专利名称：：一种真菌代谢产物及其作为除草剂的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolarismaydis)菌株(PPF-001)，其代谢物或组合物，以及它们防除杂草的用途。
背景技术：
：马唐[Digitariasanguinalis(L.)Scop.]是世界上危害最重的18种恶性杂草之一，在热带和温带地区危害严重，一年生，为欧洲的土著杂草，在北纬50。到南纬40°之间均有分布，据报道危害56个国家的33种作物，为甘蔗、花生、棉花、玉米、高梁田中的主要杂草，在咖啡、大豆、菠萝、香蕉、土豆、向日葵、水稻等田中也危害较重。马唐在我国为秋熟旱作物地恶性杂草，发生数量、分布范围在旱地杂草中均居首位，以作物生长的前中期危害为主，常和毛马唐混生危害。以秦岭、淮河一线以北地区发生面积最大，长江流域、西南、华南也都有大量发生和危害。例如夏大豆田中马唐发生严重的地块，每平方尺502株，占杂草总株数的98.5%，造成减产达70%以上；而我国黄淮海棉区马唐危害面积达51%。狗尾草也是一年生杂草，产生种子数量巨大，大量出现在春季作物田中，危害35个国家的29种作物。化学除草剂具有作用迅速、使用方便等特点，在杂草治理中发挥了重要作用，特别是进入20世纪以来，超高效除草剂磺酰脲类化合物的发现，将除草剂的开发和应用推向一个新阶段。但已有的化学除草剂的不断应用，也逐渐暴露其弊端，如除草剂的残留、残毒等原因引起作物的药害，耐药杂草种群的上升，环境污染日趋严重。进入21世纪，除草剂仍将是同杂草作斗争的有效武器，并将发挥更大的作用。随着环境保护呼声的日益提高，高毒性农药的大量使用对农业生产及生态环境造成的负面影响已引起世界范围的广泛关注。为了保护人类生存的环境和农业的可持续发展，除草剂的研制与使用将严格受到环境和生态的制约。生物源除草剂以其资源丰富、毒性小、不破坏生态环境、残留少、选择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境兼容性好等优点，正逐步引起人们的重视。从若干真菌中分离出了对植物具有毒性的二苯醚类衍生物Cyperine，可作为开发除草剂的先导化合物。因此，探索微生物来源的除草活性物质能够有效防除杂草，并有利于环境保护。
发明内容为获得即环保又对禾本科杂草有效的微生物，发明人从全国各地采集了大量的寄生于禾本科杂草上的真菌标本，通过筛选，发现一种属于平脐蠕孢属的菌株PPF-001，其抑制马唐种子萌发的效果非常显著。因此，本发明的目的是提供一种平脐蠕孢属的新菌株PPF-001。本发明的新菌株PPF-001已经于2009年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2988，保藏地点为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。该菌株为玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolarismaydis(Nisikado&Miyake)Shoemaker)[有性Cochliobolusheterostrophus(Drechsler)Drechsler]，隶属于方定抱腔菌属(CochliobolusDrechsler)[无性阶段平脐蠕孢属(BipolarisShoemarker)]，格孢腔菌科(PleosporaceaeNitschke)，格孢腔菌目(PleosporalesUittrellexBarr)，格孢月空菌亚纟冈(Pleosporomycetidae)，座囊菌纟冈(Dothideomycetes)，子囊菌门(Ascomycota)，真菌界(Fungi)。本发明的新菌株PPF-001是通过下述途径获得的。发明人对我国北方地区农田、草坪、荒地的禾本科杂草发病情况进行调查并采集发病的叶片和茎秆，记录植株发病症状及有关信息，回实验室后进行镜检。1病原真菌的分离从发病部位的病健交界处切取组织块2-5mm2，用0.1%升汞溶液进行表面消毒3min，无菌水换洗3次，移入PDA培养基或CMA(玉米粉琼脂)培养基平板上，26。C恒温箱中培养。待菌落长出后，从组织块菌落边缘挑取少量菌丝，再次移入PDA平板上培养。经过移植纯化，菌落形态和孢子形态均一致的菌株分别移入PDA斜面培养、保存备用。2病原真菌的鉴定2.1菌株的形态学鉴定将菌株接种在PDA培养基上，26t:恒温培养3天，记录菌落形态，取直径2cm的菌饼放在铺有两层湿润滤纸的培养皿中，4天后制做玻片，观察记录孢子形态及产孢结构，测量孢子(30个)和孢子梗宽度等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定。2.2菌株的DNA提取、PCR扩增及扩增产物的序列分析在PDA平板上铺玻璃纸，然后把供试菌株PPF-001接种到玻璃纸上，待菌落接近长满平板时从玻璃纸上收获菌丝体，用SDS法提取基因组DNA(LeeSB&TaylorJW，IsolationofDNAfromfungalmyceliaandsinglespores.In:I皿isMA，GelfandDH，SninskyJJ，WhiteTJed.PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.AcademicPress,SanDiego，1990，282287.)，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。以上述提取的基因组DNA为模板，用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')对供试菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。反应液体积50iiL，包括10XPCR缓冲液(100,1/LTris-HCl(pH8.8)，500mmol/LKCl，0.8%NonidetP-40)5iiL，25mmol/LMgCl25iiL，引物ITS4(10iimol/L)和ITS5(10iimol/L)各1iiL，lOmmol/LdNTP2yL，5U/iiLTaqDNA聚合酶0.4iiL，基因组DNAlyL，双蒸灭菌水34.6iiL。PCR反应程序95。C预变性2min后，95。C变性lmin，53。C复性lmin，72。C延伸2min，进行34个循环，最后72。C延伸10min，4t:保存。PCR产物在1.4%琼脂糖凝胶中电泳分离后，于溴化乙锭溶液(0.5iig/mL)中染色15min，通过ALPHA凝胶成像系统显示记录电泳结果。PCR扩增产物经检测后送到上海英骏生物技术有限公司测序，测序引物为ITS5。经形态学和分子生物学方面研究的结果，将菌株PPF-001鉴定为Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker。菌株PPF-001的形态学特征为在PDA培养基上培养2周，菌落呈黑色带白色扇形区域；在水琼脂麦杆培养基(TWA+W)上，菌落灰褐色，平展，绒毛状，表面气生菌丝色浅，较短。分生孢子梗中至深黄褐色，顶端色浅，屈膝状弯曲，单生或簇生，少分支，宽4.57.5iim。分生孢子浅黄褐色，拟纺锤形，明显弯曲，光滑，510个(多89个)假隔膜，50.0130.0X10.020.0iim，(平均80.0X15.0iim);脐部平截，略突出，明显。此菌株的形态特征与专著(SivanesanA，1987.GraminicolousspeciesofBipolaris，Curvularia，Drechslera，Exserohilumandtheirteleomorphs.MycologicalPapers158:1-261)上Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker的描述一致。将此菌株提取的DNA进行了rDNAITS序列测定，测得的序列采用Blast程序与GenBank上的序列进行同源性比较，菌株PPF-001与GenBank上B.maysis的序列AF158107(BerbeeML，PirseyediMandHubbardS，1999.Cochliobolusphylogeneticsandtheoriginofknown,highlyvirulentpathogens，inferredfromITSandglyceraldehydes_3_phosphatedehydrogenasegenesequences.Mycologia91(6):961-977.)相似率达100%。经形态学和分子生物学方面序列特征的比对结果，均支持此菌株的分类学命名为Bipolarismaysis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker。本发明还提供一种除草组合物，包含本发明的玉蜀黍平脐蠕孢新菌株PPF-001的培养物或其无菌滤液和农药领域常用的载体。所述菌株PPF-001的培养物可以以被培养的活细胞、细胞培养物的无菌滤液或细胞与滤液的混合物的形式用于除草组合物中，所述的活细胞可以是分生孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选使用该菌株的无菌滤液。含有菌株PPF-001和载体的本发明除草组合物可被加工成多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂等，优选加工成适于喷洒施用的剂型。上述剂型所使用的载体是农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体，可以是固体的或液体的形式。固体载体的实例包括矿物，如粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液体载体的实例包括各种有机溶剂，如癸烷和十二烷；植物油；矿物油和水。根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、粘合剂、稳定剂等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温so等，稳定剂可使用抗氧化剂和/或ra调节剂等。本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。本发明的菌株PPF-001或除草组合物可用于防除禾本科杂草马唐，抑制马唐种子的萌发。本发明的菌株PPF-001或除草组合物可用于马唐危害的农田和园林中，优选用于双子叶植物、果园以及园林环境中防除马唐。本发明的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。生物学试验1菌株PPF-001孢子悬浮液对马唐的致病性测定将马唐种子播于直径8cm的塑料花盆中，在温度为20_30°C的温室中培育，待马唐长至3-4叶期，选取12盆，每盆保留生长一致马唐植株10株待用。待测菌株PPF-001接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)或玉米粉琼脂培养基(CMA)平板26t:恒温箱中培养。两周后，将菌落用刮铲轻轻刮下，经两层纱布过滤，用含有O.1%吐温-80的灭菌水配制悬浮液，稀释至血球计数板测得浓度为1X105个孢子/ml。接种采用孢子悬浮液喷雾法，用微型喷雾器将混匀的孢子悬浮液均匀喷洒到已准备好的马唐植株上；对照喷含0.1%吐温-80的无菌水；对照和孢子悬浮液接种马唐各6盆。接种后的植株置于密闭容器内室温下保湿培养24h，然后移到人工气候箱中培养，每天光照/黑暗交替12h，光照度16500Lx，温度32t:/25°C(光照/黑暗)、相对湿度80%。在两周内调查发病情况，计算马唐植株的死亡率。接种马唐后，对照马唐死亡率为O，菌株PPF-OOl接种后马唐死亡率为100%。2菌株PPF-001无菌滤液对马唐及其他植物种子萌发的抑制率测定无菌滤液的准备250ml三角瓶中加入100ml液体PD(PDA去掉琼脂)培养基，灭菌后备用。用打孔器取三个菌株PPF-OOl的菌饼，无菌操作条件下接入PD液体培养基中，摇床上23°C，80rpm，培养一周后，用中速滤纸过滤菌液，得到足够量的无菌滤液。将马唐和其他植物种子(供试植物名单见表2)用1%的H202浸泡24hr，加入无菌水放入12hr光照/黑暗交替的培养箱中催芽至露白。取灭菌培养皿，每皿加入2张中速滤纸，选取催芽后的马唐种子20粒置于培养皿中滤纸上，每培养皿为1处理，重复3次；其他植物种子根据种子大小不同置培养皿上5-20粒种子，也是每皿为1处理，重复3次。将灭菌水和无菌滤液各10ml，分别加入3个放有露白种子的培养皿中，一周后记录种子萌发数，计算萌发抑制率，测量萌发后种子的根、茎长，用SPSS11.5数据处理系统独立样本T-test分析O.1%水平的差异显著性。种子萌发率(％)=萌发种子数/供试种子总数X100%平均根(芽)生长抑制率(％)=[对照平均根(芽)长-处理平均根(芽)长]/对照平均根(芽)长X100%。2.1菌株PPF-001无菌滤液对马唐种子的抑制作用对照马唐种子发芽率为100%，菌株PPF-001无菌滤液处理马唐种子的发芽率为41.7%，抑制58.3%的马唐种子萌发(见表1)。平均根生长抑制率(%)=(3.8467-0.2333)/3.8467X100%=93.9%。平均芽生长抑制率(％)=(1.1683-0.5074)/1.1683X100%=56.6%。无菌滤液处理的马唐平均根(芽)长度跟对照用无菌水处理的差异极显著，无菌滤液处理后明显抑制马唐根(芽)的生长。2.2菌株PPF-001无菌滤液对狗尾草种子的抑制作用对照和用菌株PPF-001无菌滤液处理的狗尾草种子发芽率均为98.3%，无菌滤液和对照的处理相比，对狗尾草种子萌发率抑制不明显(见表l)。但无菌滤液处理的狗尾草平均根(芽)长度跟对照用无菌水处理的差异极显著，无菌滤液处理后明显抑制狗尾草根(芽)的生长。平均根生长抑制率(%)=(0.3-0.12)/0.3X100%=60%。平均芽生长抑制率(%)=(1.0746-0.5729)/1.0746X100%=46.7%。表1对照和处理的马唐和狗尾草种子萌发情况表6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.3菌株PPF-001无菌滤液对几种植物种子的抑制试验无菌滤液处理对谷子、莴苣、豌豆和豇豆根、芽抑制率与对照相比差异不显著，对谷子的芽和豌豆根的生长有促进作用(见表2)。表2菌株PPF-001对不同植物种子萌发的致病性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注**表示在0.001水平上差异极显著'权利要求一种玉蜀黍平脐蠕孢菌的菌株PPF-001，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期2009年4月1日；保藏号CGMCCNo.2988。2.根据权利要求1所述的菌株PPF-001，其形态学特征为在PDA培养基上培养2周，菌落呈黑色带白色扇形区域；在水琼脂麦杆培养基(TWA+W)上，菌落灰褐色，平展，绒毛状，表面气生菌丝色浅，较短。分生孢子梗中至深黄褐色，顶端色浅，屈膝状弯曲，单生或簇生，少分支，宽4.57.5iim。分生孢子浅黄褐色，拟纺锤形，明显弯曲，光滑，510个(多89个)假隔膜，50.0130.0X10.020.Oiim，(平均80.0X15.0iim);脐部平截，略突出，明显。3.—种除草组合物，包含权利要求1所述的菌株PPF-OOl的培养物或其无菌滤液和农药领域常用的载体。4.权利要求1所述菌株PPF-OOl的无菌滤液。5.权利要求1的菌株PPF-OOl用于防除禾本科杂草的用途。6.根据权利要求5的用途，其用于防除双子叶作物农田、园林和草坪环境中的禾本科杂草。7.根据权利要求5的用途，所述禾本科杂草是狗尾草或马唐。全文摘要本发明涉及一种菌株PPF-001，该菌株属于玉蜀黍平脐蠕孢Bipolarismaydis(Y.Nisik.&C.Miyake)Shoemaker，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2009年4月1日，保藏号CGMCCNo.2988。本发明还涉及菌株PPF-001的培养物或其无菌滤液和农药领域常用载体的除草组合物，以及用于防除禾本科杂草马唐和狗尾草的用途。采用浓度为1×105个孢子/ml的孢子悬浮液接种马唐后死亡率为100％，该菌株的无菌滤液明显抑制马唐根、芽的生长，抑制率分别为93.9％和56.6％。文档编号A01N63/04GK101735956SQ20101000023公开日2010年6月16日申请日期2010年1月5日优先权日2010年1月5日发明者牛永春,邓晖申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所