专利名称：猪肌肉特异性itgb1bp2启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于猪基因工程技术领域，具体涉及ー种新的启动子序列，该启动子可以调控目的基因ITGB1BP2表达，本发明包括猪ITGB1BP2启动子的克隆、鉴定与应用。
背景技术：
ITGB1BP2 (integrin beta I binding protein 2)编码整合素 β I 结合蛋白 2,又名Melusin，与整合素β I胞浆区域的膜近侧区相结合，是ー个肌肉组织特异性蛋白，其作用相当于整合素途径的生物力学感应器，參与调控整合素介导的细胞信号转导系统，控制基因的表达和细胞的生长与存活，在肌细胞成熟和组织形成过程中发挥着重要的作用。免疫突光显示ITGB1BP2与integrins和vinculin —起位于包含α -辅肌动蛋白的Z线近侧的肋状体，所以其也是整合素-肌动蛋白连接复合体的重要组分之一。ITGB1BP2有着多个独特的结构域，在其C-端包含有ー个integrin结合位点和一个位于C-末端的能高容量低亲和カ结合钙的富含天门冬氨酸和谷氨酸的44个氨基酸残基区域，在其N-端存在保守的SH3和SH2的结合位点，包含有两个结合Zn2+的串联重复的CHORD结构域(通过该结构域ITGB1BP2可以与热休克蛋白共调控，如ITGB1BP2可以作为分子伴侣直接与Hsp90结合，并能与Hsp90的一个公认的互作因子Sgtl相互作用)，其可能是肌肉细胞中连接整合素受体和细胞骨架分子或转导蛋白的重要分子，作为ー种接头蛋白募集其他的信号分子到整合素β I的尾区，从而调节细胞的增殖与分化。另外，ITGB1BP2还參与调控AKT/GSK3 0和ERK1/2的磷酸化和转录因子NF-AT和GATA4的激活(AKT、GSK3 β和ERK1/2是抗细胞凋亡的主要信号蛋白，定向过表达ITGB1BP2，可以引起AKT、GSK3i3和ERKI/2的磷酸化増加)，从而控制细胞的存活和肥大。此外，Melusin还能与S100A6 (又称calcyclin)、S100A1和S100A4 结合(Filipek et al. Involvement of S100A6 (calcyclin) and its binding partners inintracellular signaling pathways. Adv Enzyme Regul. 2008,48 :225-39)。Brancaccio等(1999)通过荧光素原位杂交技术将人的Melusin基因定位于Xql2. I_ql3区，在老鼠中位干与人同源的X染色体D区。我们研究发现其在大白猪背最长肌中的表达量明显高于梅山猪，并获得其cDNA全长序列(GenBank登录号为DQ002920)。ITGB1BP2基因的表达在肌细胞増殖和分化过程中受到严格的表达调控。体外实验表明，ITGB1BP2基因在正在分化的成肌细胞中不表达，而在分化了的肌肉细胞中高表达。体内研究表明，ITGB1BP2基因的表达在15天的小鼠胚胎中可以检测到，并且在初生时达到最高的表达量，在成年骨骼肌组织中表达量略有下降。在其表达量最高期，正好处于次级肌细胞(secondary myogenesis)的生成时期,大量的肌细胞以初步形成的肌小管(myotube)为支架不断融合形成次级肌管并进一歩生成肌肉纤维。在成年小鼠的胫骨前肌的重生过程中，ITGB1BP2基因也有很高的表达量(Brancaccio et al. Melusin is anew muscle-specific interactor for beta I integrin cytoplasmic domain. J. Biol.Chem. 1999,274 :29282-29288)。真核生物的转录调控是基因表达调控的最重要途经，启动子是影响转录复合物形成和转录起始的关键DNA序列，含有基因表达调控网络的重要/[目息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它(Remenyi et al. Combinatorial control of geneexpression. Nat Struct Mo丄 Biol. 2004,11 :812-815 ;Kim et al.Direct isolation andidentification of promoters in the human genome. Genome Res. 2005,15 :830-839)。ITGB1BP2在肌肉组织中特异性表达，并在肌细胞増殖和分化过程中受到严格的表达调控。该基因的研究目前在猪中还未见报道。因此，分离克隆猪ITGB1BP2的启动子，研究其启动子的结构、功能和核心启动区的定位，是理解其基因表达调控机制及调控网络最基本、最重要的内容。利用其肌肉特异性启动子构建更有效的基因工程表达载体，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性，应用于基因工程、育种工程等领域。
发明内容
本发明的目的在于分离克隆与鉴定猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2的启动子，利用该启动子调控目的基因表达，本发明的启动子可应用于猪遗传改良的基因工程和育种エ程等领域。 本发明克隆得到了猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，分析发现其具有启动子序列特征。本发明通过以下技术方案实现利用TRIzol(购自Invitrogen公司)从大白猪的肌肉等不同组织中提取DNA和RNA，根据猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号DQ002920)设计如下用于猪ITGB1BP2表达谱分析的引物序列，如下所述正向引物ITGBlBP2qF :5' GATTCCACTTCCTGCGTTCA 3'；反向引物ITGBlBP2qR :5' CGAGATGGCATCAAGGAGAC 3'。 以大白猪不同组织RNA为模板，反转录得到cDNA序列，进行荧光定量PCR扩增，检测猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱，确定其在肌肉组织中特异表达。以猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号DQ002920)为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下用于猪ITGB1BP2启动子扩增的引物，序列如下所述正向引物ITGBlBP2pF :5' GTAGGGGATTCCTCCAAT 3'；反向引物ITGBlBP2pR :5' CCACAGCCTTTGTTATGG 3'。以大白猪肌肉组织DNA为模板，进行PCR扩增，克隆，提取质粒pMD18_T_ITGB1BP2，并进行测序。利用生物信息学方法对所获启动子可能存在的转录因子结合位点进行分析，设计出15个长度不同的启动子缺失片段的扩增引物，其各干算序列如下所述PGL3-PI 正向引物5' GAAGATCTGAGGGGCGGTATTGA3'；PGL3-P2 正向引物5' GAAGATCTGCATTCCTGAAGTC3'；PGL3-P3 正向引物5' GAAGATCTAGCCTGGGAGAGTCA3'；PGL3-P4 正向引物5' GAAGATCTTGGATCCAGTTAGAGC3'；PGL3-P5 正向引物5' GAAGATCTCCGCAGAGGTCACAG3'；PGL3-P6 正向引物5' GAAGATCTATTTTAGGTAGTTATGC3;；PGL3-P7 正向引物5' GAAGATCTTTTGTCCCTGATAACC3'；
PGL3-P8 正向引物5' GAAGATCTCGGGGAGGCTCTGTA3'；PGL3-P9 正向引物5' GAAGATCTATCCATCTAGACAAAAC3'；PGL3-P10 正向引物5' GAAGATCTAATCCCATGCTGTTG3'；PGL3-P11 正向引物5' GAAGATCTAGCAATTGGGGTACT3'；PGL3-P12 正向引物5' GAAGATCTCTCAAAATTGGTATTCA3'；PGL3-P13 正向引物5' GAAGATCTCTTGGAATTGGCATG3'；PGL3-P14 正向引物5' GAAGATCTAAATGTTCCTGAGCT3'；PGL3-P15 正向引物5' GAAGATCTCCTTCCAGGCAGCTA3'；
反向引物(上述正向引物的共用引物)5^ CCAAGCTTAAGGGTATTTCAAGG3'。然后以质粒pMD18-T-ITGBlBP2为模板，利用上述正向引物分别与反向引物配对进行PCR扩增，获得15个长度不同的ITGB1BP2启动子缺失片段。之后将15个缺失片段分别连接到PGL3_Basic载体(普洛麦格北京生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理)上，转染C2C12细胞检测每个缺失片段的活性，发现其核心启动子区域位于1107 1388bp之间，上述不同的缺失片段均具有活性。本发明确定了猪ITGB1BP2基因的转录起始位点。应用5’ RACE的方法，鉴定猪ITGB1BP2的转录起始位点位于1320bp处(C)。
序列表SEQIDN0 1为克隆所得到的猪ITGB1BP2的启动子序列。序列表SEQIDN0 :2为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P1应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 3为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P2应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 :4为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P3应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 5为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P4应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 6为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P5应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 7为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P6应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 8为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P7应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 9为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P8应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 10为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P9应用的核苷酸序列。序列表SEQIDN0 11为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P10应用的核苷酸序列。
序列表SEQIDNO :12为从所述SEQIDN0 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P11应用的核苷酸序列。序列表SEQIDNO :13为从所述SEQIDNO 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P12应用的核苷酸序列。序列表SEQIDNO : 14为从所述SEQIDNO 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P13应用的核苷酸序列。序列表SEQIDNO :15为从所述SEQIDNO 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P14应用的核苷酸序列序列表SEQIDNO :16为从所述SEQIDNO 1克隆得到的作为另ー个启动子PGL3-P15应用的核苷酸序列。
图I为猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱。图2为猪ITGB1BP25’侧翼序列的PCR扩增結果。图3为猪ITGB1BP2基因转录起始位点的5’ RACE鉴定結果。图4为用于分析猪ITGB1BP2启动子不同片段活性的PGL3_basic载体结构示意图。图5为猪ITGB1BP2启动子缺失片段重组质粒的双酶切鉴定泳道M1-15分别为 pGL3-Pl、pGL3-P2、pGL3_P3、pGL3_P4、pGL3_P5、pGL3_P6、pGL3_P7、pGL3_P8、pGL3_P9、pGL3-P10、pGL3-P11、pGL3_P12、pGL3_P13、pGL3_P14 和 pGL3_P15 重组质粒的酶切結果。图6为用于分析猪ITGB1BP2启动子不同片段活性所用的pRL_TK内參载体结构示意图。图7为猪ITGB1BP2启动子缺失片段重组质粒转染C2C12细胞的活性检测結果。
具体实施例方式实施例I猪基因组DNA和RNA的提取及cDNA的合成利用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司，按照该试剂提供的说明书操作)同时从大白猪(来源华中农业大学试验猪场，为常规报道品种，为引进的外来品种)的不同组织中提取DNA和RNA，具体步骤如下(I)将猪的不同组组织(例如肌肉、心、肝、脾、肺、肾)分别在液氮中磨碎，每50 IOOmg组织中加入Iml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆。将匀浆后的样品在室温放置5min后加入氯仿(约姆使用Iml TRIzol加0. 2ml),加完后立即剧烈振荡15s,室温放置3min。之后在4°C、12000 Xg离心15min，样品将分三层底层为黄色有机相，上层为无色水相和ー个中间层。将水相转入一新管中开始RNA的提取，剩下的可以用来提取DNA和蛋白。(2)每使用Iml TRIzol加0.5ml异丙醇到水相中，室温放置10分钟后4°C、12000Xg离心lOmin，弃上清；接着加75%こ醇(约每使用Iml TRIzol加Iml)，混匀后7500 Xg离心5min，弃上清；在室温放置5_10min，晾干后加入50 μ IDEPC水，55 60で放置IOmin使RNA溶解，_70°C保存。(3)姆使用Iml TRIzol加0. 3ml无水こ醇到中间层和有机相中，室温放置3min后，4°C、2000Xg离心5min。弃上清；用含10%こ醇的0. IM柠檬酸钠洗涤DNA沉淀(约每使用Iml TRIzol加Iml)，室温放置30min后，4°C、2000X g离心5min，弃上清，重复一次；再加入75%こ醇(约每使用Iml TRIzol加入I. 5 2ml)，室温放置10 20min后(不时颠倒混合)，4°C、2000Xg离心5min,弃上清；室温放置晾干DNA 5 IOmin,姆50 70mg组织用300 600 μ 18mMNa0H溶解DNA，4°C、12000 X g离心IOmin除去组织中的一些不溶物，最后用4-羟こ基哌嗪こ磺酸(HEPES)调pH值至7-8并加入こニ胺四こ酸(EDTA)至ImM, -20°C保存。
(4)用浓度测定仪直接测定所提取的RNA和DNA的浓度值和A260/A280比值。(5)将提取好RNA用DNase I处理去除RNA中的DNA污染。PCR反应体系和PCR反应条件分别见见表I和2所述。表I PCR反应体系
RNAIpg
IOxReaction Buffer with Mgcl2IpL
DNase I，RNase-freeIpL
ddH20TolOpL37°C，3Omin50 mM EDTA65 °C, IOmin(6)将处理过的 RNA 用 Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit反转录成cDNA(按照该试剂盒的说明书操作),于_20°C保存。表2PCR反应条件
Total RNAI μβ
Oligo (dT) 18 primerI pL
ddH20Tol2pL 65°C,5min5 XReaction Buffer4pL RiboLock RNase InhibitorIpL
10 mM dNTP Mix2pL42°C ,60min
RevertAid M-MuLV Reverse TranscriptaseIpL70°C,5min实施例2猪ITGB1BP2基因在大白猪不同组织中的表达谱根据猪ITGB1BP2基因的mRNA序列(登录号DQ002920)设计如下用于猪ITGB1BP2表达谱分析的引物对正向引物ITGBlBP2qF : 5' GATTCCACTTCCTGCGTTCA3'；反向引物ITGBlBP2qR : 5' CGAGATGGCATCAAGGAGAC3'。以2月龄大白猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌、背脂cDNA为模板，以猪β -actin基因为内參，β -actin的引物如下所述β -actin-qPCR-F 5' CCAGGTCATCACCATCGG3'；β -actin-qPCR-R 5' CCGTGTTGGCGTAGAGGT3'。采用SYBR Green I突光染料(购自Invitrogen公司)，在Roche公司的LightCycler480仪器中进行实时定量PCR。利用2_Λ 法进行数据分析。试验结果表明猪ITGB1BP2基因主要在心肌中特异高表达(见图I)。定量PCR反应体系和定量PCR反应条件见表3和表4所述。 表3 定量PCR反应体系
权利要求
1.一种猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2的启动子，其特征在于该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
如权利要求I所述的猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2的启动子的片段，其特征在于所述片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO :2-16所示。
所述启动子在猪遗传改良和转基因表达中的应用。
2.所述启动子的片段在猪遗传改良和转基因表达中的应用。
全文摘要
本发明属于猪分子遗传学领域，具体涉及一种猪肌肉特异表达基因ITGB1BP2启动子的克隆鉴定与应用。本发明的步骤包括提取大白猪不同组织总RNA，进行荧光定量PCR，确定其在肌肉组织中特异表达。以大白猪肌肉组织总DNA为模板，设计引物，PCR扩增获得猪ITGB1BP2基因5’端侧翼1442bp的序列，构建15个长度不同的ITGB1BP2启动子缺失片段的荧光素酶报告基因质粒，转染C2C12细胞，检测每个缺失片段的启动子活性，鉴定猪ITGB1BP2基因启动子。本发明克隆的猪ITGB1BP2基因启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，为猪的遗传改良和转基因提供了重要的元件和手段，可强化转基因表达的肌肉组织特异性和稳定性。
文档编号A01K67/027GK102747082SQ20111045194
公开日2012年10月24日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者张子见, 徐德全, 熊远著 申请人:华中农业大学