专利名称：一种精原干细胞移植受体的制备方法
技术领域：
本发明属于应用型生物技术领域，是ー种新型、高效、低毒的精原干细胞移植受体制备方法，可在精原干细胞移植、利用精原干细胞制备转基因动物和利用精原干细胞保护濒危物种等领域中应用。
背景技术：
精原干细胞是生精上皮近基底膜的一群具有高度自我更新和多向分化潜能的ニ倍体细胞，是成年动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。精原干细胞既能持续自我更新保持自身群体数量恒定，又能不断分化产生各级精原细胞，并最终生成精子。精原干细胞移植体系的建立对精子发生机制的研究起到了推动作用，也为治疗男性不育、开发男性节育药物、保存肿瘤或高位隐睾患者的生育能力、保护濒危动物、促进优质高产家畜繁育及转基因动物制备等提供了可能。现在，已成功实现了小鼠、大鼠、公牛、山羊、猪等物种精原干细胞的受体制备与移植，尤其是在小鼠上的研究更为成熟。 受体制备是精原干细胞移植技术的重要组成部分，是成功移植的必要条件和前提基础，受体制备的效率直接关系到移植效果。目前，已经建立了腹腔注射白消安、局部射线照射、局部热处理等受体制备技木，通过这些技术处理，使受体睾丸的各级生精细胞发生凋亡，在曲精细管支持细胞包围的近腔小室和基底小室中形成空腔，便于移植后供体精原干细胞的内迁和附植，进而完成再生分化和精子发生。虽然已经建立了较为成熟的受体制备方法，但是，制备过程较为繁琐，制备时间较长，药物注射易造成受体动物死亡，整体效率较低。腹腔注射白消安法白消安是ー种抑制细胞増殖的抗肿瘤药，能使DNA烷基化从而破坏受体精原干细胞的增值。白消安能够清除动物睾丸内的绝大多数精原干细胞和精子发生过程中几乎全部的中间细胞，是最早使用的受体制备方法。但白消安对动物的骨髄、造血系统可产生抑制作用，损伤很大。腹腔注射白消安制备受体时，会导致实验动物较高的死亡率。也有实验采用阴囊注射来制备受体，虽然降低了对实验动物的伤害，但实验效果仍不很理想。局部射线照射法局部射线照射，是使用不同剂量X射线对动物局部部位进行照射，在几乎不损伤其他器官细胞的前提下，使受体睾丸内各级精原细胞受到较为彻底的破坏。这种方法更适用于大动物，虽然可以直接杀灭精原细胞，但需专用辐照设备，使用不方便，且设备比较昂贵、操作复杂、剂量不易确定。实验中还会造成放射线污染，且同样存在使受体致死的安全隐患。热处理法与前两种方法相比，热处理法可以更好地将处理作用局限在靶点部位，减弱对身体其他部位的副效应。来自小鼠和大鼠的研究表明，42-43°C高温可引发生殖细胞凋亡，热处理可导致睾丸重量短期内减小，进而引起处理鼠的短暂轻度不育或完全不育。但该法处理的受体睾丸微环境恢复较快，且移植要在最佳容受期内才能获得最高的移植效率，因此使用此法制备的受体必须严格注意移植时间，否则会影响移植結果。热处理法虽然对动物无毒害作用，但其效果相对不明显，对时间的把握要求严格，较少使用。近年来，动物福利及受体安全越来越受到行业的重视，使受体制备方法更具挑战性，因此，有必要建立一种简单、安全、高效的新型精原干细胞移植受体制备技木。
发明内容
本发明目的在于针对上述不足提供一种制备精原干细胞移植受体的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种制备精原干细胞移植受体的方法，该方法是将白消安注入受体睾丸制备得到移植受体。优选地，注入时使针头沿睾丸长轴方向刺入睾丸至长轴方向远端，然后在将药物 推入的同时将针头慢慢抽出，使白消安注入睾丸各小叶的曲细精管内。白消安的注射剂量可以根据不同物种确定，以3. 5^4. 5mg/ml浓度，3、mg/kg体重的剂量注入受体小鼠睾丸为佳，处理后28天得到移植受体。一种更佳的注射方式是将白消安以4mg/ml浓度，4mg/kg体重的剂量注入小鼠受体睾丸，处理后2广28天得到移植受体。基于此，本发明还提供一种用于制备精原干细胞移植受体的试剂，其为T5mg/ml的白消安溶液。用于注射的工具包括注射器针筒和注射针头，注射器针筒和注射针头之间用软管连接。例如可以使相贯通连接的注射器和静脉输液针。具体地例如采用0.45mmX15mm规格一次性静脉输液针与注射器连接制成注射工具。根据受体的不同，可以对针头的规格进行适应性调整。利用本发明，可以大大減少对动物骨髄、造血系统的伤害，減少或避免受体动物的死亡。因为直接对靶器官进行药物注射，使药物能够以最快的速度发挥药效，并减少了对其他器官的伤害，从而大大降低甚至避免了受体动物死亡。小鼠睾丸注射白消安后，曲细精管内出现大量空腔，同时支持细胞间的紧密连接被破坏，为移植后供体精原干细胞的内迁和附植提供了条件。处理21-28d，曲细精管中的空管化达到最大程度，随后支持细胞间的紧密连接逐步恢复。因此，选择处理后21d-28d的小鼠受体进行移植。本发明通过改变传统的白消安注射位点，降低甚至避免了受体动物死亡；通过改进注射针头，即将O. 45mmX 15mm规格的一次性静脉输液针与注射器连接替代注射器针头和拉针针头，既降低了注射对睾丸的创伤又降低了技术难度。本发明不涉及任何专用仪器，只利用现有常规仪器和化学试剂即可完成，降低了制备成本，此外，本领域的一般技术人员均可实施本发明。本发明能够实现精原干细胞移植受体的高效制备，为精原干细胞移植技术的迅速提高及新方法的探索提供简单、安全、可行的技术支持，并有助于精原干细胞受体制备的应用与推广，从而推动精原干细胞移植技术的应用。
图I为不同处理组小鼠睾丸切片其中，A，未处理组正常睾丸切片H. E染色图。B (BI、B2、B3、B4)，4mg/kg/侧剂量白消安睾丸注射组受体在14(1、21(1、28(1、35(1睾丸切片!^染色图。C(C1、C2、C3)，为40mg/kg剂量白消安腹腔注射组受体在14d、21d、28d睾丸切片H. E染色图。(放大倍数400X)图2为不同注射剂量组小鼠睾丸切片其中，A(Al，A2，A3，A4)2mg/kg/侧剂量组，处理后 14d、21d、28d、35d 小鼠睾丸切片H. E染色图。B (BI, B2, B3, B4) 3mg/kg/侧剂量组，处理后14d、21d、28d、35d小鼠睾丸切片H. E染色图。C (Cl，C2，C3，C4)4mg/kg/侧剂量组，处理后14d、21d、28d、35d周小鼠睾丸切片H. E染色图。(放大倍数400X)。 具体实施方法以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I受体制备受体1-2月龄⑶I (ICR)品系正常繁殖公鼠。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。配置白消安将白消安溶于DMS0，浓度为8mg/ml，注射前O. 5小时，加入等体积超纯水，定终浓度为4mg/ml，37°C水浴，防凝固。注射将O. 45mmX 15mm规格的一次性静脉输液针与注射器连接备用，注射浓度4mg/ml,剂量分别为2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg,注射量为腹腔注射的1/10。同时设立腹腔注射对照组和空白对照组，腹腔注射组以常规方法进行腹腔注射，注射剂量为40mg/
kg ο切片白消安睾丸注射组受体在注射后14d、21d、28d、35d时分别取不同剂量组及对照制作睾丸切片，H. E染色。结果如图I和图2所示，通过睾丸注射可在不同程度上造成各级生精细胞的减少，其中以3 5mg/kg/侧的效果较为明显(5mg/kg/侧图中未示出),且4mg/kg/侧是睾丸注射白消安制备受体的最佳剂量。小鼠睾丸注射白消安后，随着处理后时间的延长，曲细精管内的各级生精细胞逐渐减少，在21-28d減少到最低，曲细精管中空，各级生精细胞消失，之后逐渐恢复，35d可见到曲细精管内出现大量生殖细胞。腹腔注射白消安的小鼠随着处理后时间的延长，也可见睾丸内各级生精细胞开始減少，21d減少到最低，之后逐渐恢复的过程。但由切片可看出，睾丸注射白消安对睾丸结构的损坏较小，且曲细精管中空持续的时间较长。表I为不同处理组的小鼠死亡统计结果
IFl处理剂量处理数目/只j死亡数目/只死亡率/%
腹腔注射组 40mg/kg953435 8
睾丸注射组 4mg/kg/侧 55OO
权利要求
1.一种制备精原干细胞移植受体的方法，该方法是将白消安注入受体睾丸制备得到移植受体。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，注入时使注射针头沿睾丸长轴方向刺入睾丸至长轴方向远端，然后在将药物推入的同时将针头慢慢抽出，使白消安注入睾丸各小叶的曲细精管内。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在干，该方法以3.5^4. 5mg/ml浓度，3^5mg/kg体重的剂量注入受体睾丸，处理后2广28天得到移植受体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在干，该方法是将白消安以4mg/ml浓度，4mg/kg体重的剂量注入受体睾丸，处理后2广28天得到移植受体。
5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，注入工具包括注射器针筒和注射针头，注射器针筒和注射针头之间用软管连接。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述注入工具为相贯通连接的注射器针筒和静脉输液针。
7.权利要求Γ6任一项所述方法制备的受体在精原干细胞移植中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种精原干细胞移植受体制备的方法，该方法通过睾丸注射白消安制备精原干细胞移植受体。应用本发明方法，不但能够成功快速制备精原干细胞移植受体，降低腹腔注射白消安法对动物骨髓、造血系统所造成的较大伤害，减少或避免动物死亡，还能减少药物使用量，降低成本。这种方法开辟出了一种新型精原干细胞移植受体制备方法。该方法不涉及任何专用仪器，只利用现有常规仪器和化学试剂即可完成，本领域的一般技术人员均可实施本发明，是一种成本低廉，操作简便、高效、快速、安全、可行的精原干细胞移植受体制备方法，有助于精原干细胞移植技术的推广应用及优化创新。
文档编号A61D7/00GK102824226SQ20121034310
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者王栋, 朱化彬, 刘玲, 王琛, 郝海生, 秦彤, 赵学明 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所