适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，包括水稻GAS1基因LOC_Os01g68860内含子、位于所述水稻GAS1基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；所述水稻GAS1基因LOC_Os01g68860内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端9621-10099位核苷酸。与用GUS基因作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体相比，在应用该基因内含子作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体具有更高的干扰效率。同时，实验操作变得简单易行，有利于减少失误，提高工作效率。
【专利说明】适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，属于植物生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]常用的植物RNA干扰载体除了常规双元载体所必备的核心元件，如启动子，多克隆位点，抗性标记基因外，还包含一段DNA序列作为shRNA (short hairpin RNA,短发夹RNA)的环状结构。植物RNAi干扰载体一般用细菌的GUS (转β -葡糖醛酸酶)基因片段或植物基因的内含子作为环状结构。与用GUS基因作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体相t匕，用带剪接位点的基因内含子作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体具有更高的干扰效率。
[0003]在基因工程的不断发展过程中，随着科学技术各个分支的不断发展和人们对基因功能认识的不断深入，选择标记基因也处在不断发展完善的过程中。到现在为止在基因工程操作中大量应用的选择标记基因大体可以分为四类:分别是抗生素抗性基因、除草剂抗性基因，化合物解毒酶基因和植物糖类代谢酶基因。它们在相应的选择培养基上都可以起到标签的作用，使得符合我们条件的细胞能够突出的显现出来。其中，Bar基因和草丁膦筛选体系是目前应用最广泛的除草剂类选择标记筛选体系。
[0004]在将外源片段克隆到载体的分子生物学操作中，同源重组定向克隆和双酶切连接是两种常用的克隆方法。相比后者，前者的优势在于不需要用限制性内切酶酶切目的克隆片段，克服了酶切位点的限制，同时减少了操作步骤，有助于减少工作量，提高工作效率。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其包含设计、克隆靶基因干扰片段，筛选含有靶基因干扰片段的重组载体，检测转基因干扰植株等一系列操作的标准化方法；及在筛选含有靶基因干扰片段重组载体、检测转基因干扰植株等应用过程中所使用的PCR检测引物。在应用该RNA干扰载体时，实验操作变得简单易行，有利于减少失误，提闻工作效率。
[0006]本发明的技术方案是这样实现的:一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，核苷酸序列为序列表中的序列1，包括PTF101.1载体的基本骨架、35s启动子以及水稻GASl基因L0C_0s01g68860内含子、位于所述水稻GASl基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；
所述水稻GASl基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端9621-10098位核苷酸；
所述上游多克隆位点为BamH1、SmaI (XmaI)和MluI ；
所述下游多克隆位点为Hpa1、SpeI和SacI ；
所述干扰载体的启动子为35s启动子。[0007]本发明提供的RNA干扰载体pLYZRNAi，按照如下方法制备:
将DNA片段I与pTF101-35s载体骨架共培养，得到的载体；
所述DNA片段I包括含有上游多克隆位点的片段a、水稻GASl基因(L0C_0s01g68860)内含子、含有下游多克隆位点的片段b组成；
所述水稻GASl基因(L0C_0s01g68860)内含子的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第 9621-10098 位；
所述片段a的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第9591-9620位；
所述片段b的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第10099-10129位，
所述DNA片段I的核苷酸序列为序列表中序列2 ；
所述上游多克隆位点为BamH1、SmaI (XmaI)和MluI ；
所述下游多克隆位点为Hpa1、SpeI和SacI。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种重组载体。
[0009]本发明提 供的重组载体，按照如下I或II方法制备:
I包括如下步骤:
1)将DNA片段2插入所述的干扰载体的上游多克隆位点，得到含有所述下游多克隆位点的中间载体A ;
2)将DNA片段3插入步骤I)得到的中间载体A的所述下游多克隆位点，得到重组载
体；
II包括如下步骤:
A、将DNA片段3插入所述的干扰载体的下游多克隆位点，得到含有所述上游多克隆位点的中间载体B ;
B、将DNA片段2插入步骤A得到的中间载体B的所述上游多克隆位点，得到重组载体； 所述DNA片段2包括目标蛋白编码基因片段和分别位于目标蛋白编码基因两侧的用于
插入载体的2种DNA分子，所述分别位于目标蛋白编码基因片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述上游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体B同源的核苷酸；
所述DNA片段3包括目标蛋白编码基因的反向互补片段和分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述下游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体A同源的核苷酸；
所述DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列4 ；
所述DNA片段3的核苷酸序列为序列表中序列5。
[0010]所述DNA片段2也可以插在干扰载体下游多克隆位点，所述DNA片段3也可以插在干扰载体上游多克隆位点，只要正义片段和反义片段的方向相反即可。
[0011]上述重组载体的构建中，DNA片段2和DNA片段3中既有同源重组序列又有双酶切位点，即可通过同源重组插入载体的多克隆位点处，得到重组载体；又可以通过双酶切与经过同样酶切得到的载体连接，得到重组载体。
[0012]所述的干扰载体和/或所述重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用。[0013]所述重组载体在植物转基因育种和/或基因功能研究中的应用为抑制目的植物中的靶基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的株高低于所述目的植物；所述抑制目的植物中的靶基因的表达的方法是通过向所述目的植物中转入重组表达载体实现的。
[0014]所述靶基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ；
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物优选为大豆。
[0015]实验证明，本发明利用其来构建针对在大豆油脂合成途径代谢中调控蛋白质和油脂含量比率的关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPc)的RNA干扰载体，然后转化大豆受体品种Williams82中。RNA干扰载体在受体中表达形成的 shRNA 被 Dicer 酶剪切成 siRNA (Small interfering RNA,干扰小 RNA) ;siRNA能特异性抑制靶基因的表达，从而使大豆籽粒中油分含量增加，进而GmPEPc基因功能的目的。
[0016]与现有的植物RNA干扰载体相比，本发明积极效果是:
1、使用35s强启动子。应用该RNA干扰载体能显著提高shRNA的表达量，从而提高靶基因的干扰效率，增强干扰效果，该载体特别适用于拟南芥、大豆等双子叶植物。
[0017]2、使用水稻GASl基因的内含子作为shRNA的环状结构。在内含子剪接过程中，shRNA中靶基因正义及反义序列的相互配对得到增强，增加了 shRNA被Dicer酶剪切成siRNA的概率，从而提高靶基因的干扰效率，增强干扰效果。
[0018]3、在载体GASl基因内含子的左右两侧多克隆位点处各添加了限制性内切酶酶切位点，方便靶基因干扰片段的克隆。
[0019]4、在设计靶基因干扰片段PCR引物时，在引物中同时引入同源重组序列及双酶切位点。后续实验可视具体情况选用同源重组定向克隆或双酶切连接克隆方法，不仅操作灵活，而且用同源重组定向克隆方法克服`了酶切位点的限制。
[0020]5、本发明包含设计、克隆靶基因干扰片段，筛选含有靶基因干扰片段的重组载体，检测转基因干扰植株等一系列操作的标准化方法；及在筛选含有靶基因干扰片段重组载体、检测转基因干扰植株等应用过程中所使用的PCR检测引物。在应用该RNA干扰载体时，实验操作变得简单易行，有利于减少失误，提高工作效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ]图1为pLYZRNAi载体的构建流程图。
[0022]图2为pLYZRNAi载体的结构示意图。
[0023]图3为pLYZRNAi重组载体的酶切鉴定电泳图。
[0024]图4为pLYZRNA1-GmPEPc载体的构建流程图。
[0025]图5为pLYZRNA1-GmPEPc载体结构示意图。
[0026]图6为pLYZRNA1-GmPEPc重组载体的酶切鉴定电泳图。
[0027]图7 所示 PCR 鉴定 pLYZRNA1-sense-GmPEPc 重组载体。
[0028]图8所示PCR鉴定pLYZRNA1-GmPEPc重组载体。
[0029]图9为大豆遗传转化流程图。
[0030]图10为PCR检测Tl代转基因后代材料。【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述:实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；并且实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]实施例1、RNA干扰载体pLYZRNAi的构建
RNA干扰载体pLYZRNAi是用同源重组定向克隆的方法，将水稻GASl基因的内含子正向克隆到带Bar标记的植物双元载体pTF101-35s中(图1为实验流程图)，RNA干扰载体pLYZRNAi的结构示意图如图2所示,具体方法如下:
1、水稻GASl基因L0C_0s01g68860内含子片段的获得
利用人工合成基因技术合成水稻GASl基因的内含子序列，并在序列两段加上所用的多克隆位点a和b，为序列2 ;然后根据pTF101-35s载体选择BamI和SacI酶设计扩增内含子的引物序列如下(带下划线的字母表示pTF101-35s载体上BamI和SacI酶切位点两侧的同源重组序列。):
GASl intron-F:5’- TAGAAACAGAGGATCCGGATCCAACAGCCCCGGGAA-3’ ；
GASl intron-R:5’ - GATCGGGGAAATTCGAGCTCGAGCTCTCTAGAACTAGTATCGATG-3’。
[0033]PCR 扩增程序 :94 °C 2 min ;再 98 °C 10 sec, 60 °C 5 sec, 72 °C 1.5 min，30个循环；最后72 °C 7 min。
[0034]以上述人工合成的DNA为模板，采用上述PCR扩增程序，以GASl intron-F和GASlintron-R作为引物进行PCR扩增，电泳结果参见图3中的第5泳道，为扩增基因的目的条带片段。
[0035]所述上游多克隆位点为(Bam1、SmaI和MluI)；
所述下游多克隆位点为(Sac1、SpeI和HpaI)。
[0036]回收PCR产物备用。
[0037]2、BamI和SacI酶切pTF101_35S线性载体的制备
使用NEB中国有限公司的BamI和SacI限制性内切酶，酶切pTF101_35S载体(电泳检测如图 3 的2泳道)(Paz, M., Martinez, J.C.，Kalvig, A., Fonger, T., Wang,K.(2010) Agrobacterium-mediated transformation of soybean and recovery oftransgenic soybean plants.公众可从吉林省农业科学院农业生物研究所获得。)，回收经过酶切的PTF101-35S线性载体备用。电泳检测如图3的3泳道。
[0038]3、pLYZRNAi重组载体的获得
I) GASl基因内含子的同源重组定向克隆
使用GenScript中国有限公司的CloneEZ同源重组定向克隆试剂盒将步骤I得到的回收的PCR产物与步骤2得到的回收的线性载体进行同源重组反应，反应体系如表1所示:表1同源重组反应体系
【权利要求】
1.一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，包括水稻GASl基因LOC_0s01g68860内含子、位于所述水稻GASl基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点； 所述水稻GASl基因L0C_0s01g68860内含子的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端9621-10099位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其特征在于所述的上游多克隆位点为BamH1、Sma1、Xma1、MluI。
3.根据权利要求1所述的一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其特征在于所述下游多克隆位点为Hpa1、SpeI和SacI。
4.根据权利要求1所述的一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其特征在于所述的干扰载体的启动子为35s启动子。
5.根据权利要求1所述的一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其特征在于所述的RNA干扰载体按照如下方法制备: 将DNA片段I与pTF101-35s载体骨架共培养，得到的载体； 或将DNA片段I与pTFlOl.1载体骨架共培养，得到的载体； 其中DNA片段I包括含有上游多克隆位点的片段a、水稻GASl基因L0C_0s01g68860内含子、含有下游多克隆位点的片段b组成； 所述片段a的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第9591-9620位； 所述片段b的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第10099-10129位， 所述DNA片段I的核苷酸序列为序列表中序列2。
6.根据权利要求1所述的一种适合除草剂筛选标记Bar基因的RNA干扰载体，其特征在于所述的RNA干扰载体的重组载体，按照如下I或II方法制备: 1包括以下步骤: 1)将DNA片段2插入所述的干扰载体的上游多克隆位点，得到含有所述下游多克隆位点的中间载体A ; 2)将DNA片段3插入步骤I)得到的中间载体A的所述下游多克隆位点，得到重组载体； II包括以下步骤: A、将DNA片段3插入所述的干扰载体的下游多克隆位点，得到含有所述上游多克隆位点的中间载体B ; B、将DNA片段2插入步骤A得到的中间载体B的所述上游多克隆位点，得到重组载体； 所述DNA片段2包括目标蛋白编码基因片段和分别位于目标蛋白编码基因两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于目标蛋白编码基因片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述上游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体B同源的核苷酸； 所述DNA片段3包括目标蛋白编码基因的反向互补片段和分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述下游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体A同源的核苷酸；所述的DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列4 ； 所述的DNA片段3的核苷酸序列为序列表中序列5 ； 所述DNA片段2也可以插在干扰载体下游多克隆位点，所述DNA片段3也可以插在干扰载体上游多克隆位点，只要正义片段和反义片段的方向相反即可。
7.根据权利要求6所述的一种RNA干扰载体的重组载体，其特征在于所述的重组载体的构建中，DNA片段2和DNA片段3中既有同源重组序列又有双酶切位点，即可通过同源重组插入载体的多克隆位点处，得到重组载体；又可以通过双酶切与经过同样酶切得到的载体连接，得到重组载体。
8.—种RNA干扰载体或其重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用。
9.根据权利要求8所述的一种RNA干扰载体的重组载体，其特征在于所述的重组载体在植物转基因育种为抑制目的植物中的靶基因的表达，得到转基因植物；转基因植物的株高低于所述目的植物；抑制目的植物中的靶基因的表达的方法是通过向所述目的植物中转入重组表达载体实现的。
10.根据权利要求8所述的一种RNA干扰载体的重组载体，其特征在于所述靶基因的核苷酸序列为序列表中序列2。
【文档编号】A01H5/00GK103642827SQ201310484523
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】张玲, 董英山, 张原宇, 张春宝, 王玉民, 于志晶 申请人:吉林省农业科学院