小菜蛾保幼激素酯酶基因的rna干扰序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及昆虫基因【技术领域】的保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列及其应用，第一种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子序列为：正义链SEQIDNO：1TTCCATTTGCCCTCAGTCC，反义链SEQIDNO：2GAAGAAGAGGTTGCCAATCC，对编码保幼激素酯酶底物结合位点区域DNA片段具有沉默效应；第二种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子序列为：正义链SEQIDNO：3CTAGGGATGTCGTGGTCG，反义链SEQIDNO：4CGGTCAGAGTGCCGG，对编码保幼激素酯酶催化位点区域的RNA的沉默效应。本发明的干扰RNA序列较有效提高小菜蛾幼虫死亡率，降低幼虫生长发育速率。
【专利说明】小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业昆虫害虫防治领域，具体涉及昆虫保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列及应用。
【背景技术】
[0002]小菜蛾属鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，学名为Plutellaxylostella(Linnaeus),广泛分布于世界各地,主要为害十字花科蔬菜，由于小菜蛾年繁殖力强、发生代数多、生态适应性强以及各种虫态均无滞育现象等原因，成为当今世界范围内对十字花科蔬菜为害最为严重的害虫之一。由于化学杀虫剂的不合理利用，小菜蛾目前对所用于防治的杀虫剂均产生抗性，探索新的防治方法对于减少农药污染、提高蔬菜产量与品质具有重要意义。
[0003]保幼激素是小菜蛾生长发育调节的重要激素之一。保幼激素与其他所有激素一样，当某个阶段(如临近蜕皮时)昆虫体内不再需要时，保幼激素就必须有效降解，直至下次需要时再合成。它通过含量实现对内分泌系统的严格调控。在全变态昆虫末龄幼虫化蛹前体内保幼激素低水平的维持是通过保幼激素酯酶控制的。可见，在保幼激素的各类代谢酶中，保幼激素酯酶是最重要的保幼激素代谢酶。保幼激素酯酶的活性对昆虫的生长发育十分重要。
[0004]RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double stranded RNA,dsRNA)特异性地结合在mRNA上并在mRNA水平关闭互补序列基因表达或使其沉默的过程(Fire A, et al.，1998)。RNAi 是一种转录后水平基因沉默(post transcriptional genesilencing, PTGS)的方法。由于dsRNA干扰相应基因的表达后，基本检测不到基因表达的蛋白，所以又称基因敲除(Knock out)。RNA干扰现象广泛存在于生物界中，在真菌中被称为基因压制(quelling),在烟草、拟南芥等植物中称为共抑制(cosuppression)或PTGS,在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物中称为RNA干扰。
[0005]随着RNA干扰技术的成熟，RNAi已经成为目前研究功能基因组学的一个重要技术手段，RNAi的作用机制也逐渐明晰。RNAi技术广泛应用于昆虫研究中，主要集中在功能基因、抗药性和害虫防治三个方面。在小菜蛾的研究主要集中在功能基因表达、作用机制和信号通路等几个方面。
[0006]目前有关小菜蛾保幼激素酯酶的RNAi研究还未见报到，与其比较相关的是李晓静(2012)将保幼激素环氧水解酶基因进行克隆之后进行RNAi实验，结果未观察到显著的干扰效果。
【发明内容】
[0007]本发明的 目的在于克服现有防治方法的不足，提供一种小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列。本发明的RNA干扰序列可有效的干扰小菜蛾的生长发育，为小菜蛾防治提供新思路。[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列为双链RNA分子，该分子正义链为SEQID NO:1TTCCATTTGCCCTCAGTCC，反义链为 SEQ ID NO:2GAAGAAGAGGTTGCCAATCC ;或者正义链由SEQ ID NO:1，反义链由SEQ ID NO:2的核苷酸序列碱基取代、缺失或添加而形成的，且能作用于保幼激素酯酶基因的RNA序列。
[0010]小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列为双链RNA分子，该分子正义链为SEQID NO:3CTAGGGATGTCGTGGTCG，反义链为 SEQ ID NO:4CGGTCAGAGTGCCGG ;或者正义链由 SEQID NO:3，反正链由SEQ ID NO:4的核苷酸序列碱基取代、缺失或添加而形成的，且能作用于保幼激素酯酶基因的RNA序列。
[0011]所述序列可干扰编码保幼激素酯酶底物结合位点区域基因或编码保幼激素酯酶催化位点的基因表达。
[0012]小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列的应用，可应用于小菜蛾防治。
[0013]
[0014]【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0016]下面实施例中所使用的技术，包括RNA的提取、PCR扩增与检测、dsRNA产物的纯化等分子生物学技术，以及 保幼激素酯酶活性的测定等，除非特别说明，均为本领域内技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非本说明书特别注明，均为一般本领域的研究人员可通过公关途径获得的。
[0017]实施例1dsRNA对小菜蛾保幼激素酯酶底物结合位点的沉默效应
[0018]步骤一，dsRNA设计合成
[0019]根据福建农林大学应用生态所提供的小菜蛾cDNA文库序列信息，在BLAST上搜寻序列以及推断的功能区域序列并比对，利用软件Primer Premier5.0设计特异性扩增引物(5'-端加上T7promoter序列)，用于扩增小菜蛾保幼激素酯酶底物结合位点功能区基因。根据基因测序结果，利用软件Primer Premier5.0设计dsRNA引物，引物序列如下:
[0020]正义链5，-TTCCATTTGCCCTCAGTCC
[0021]反义链3’ -GAAGAAGAGGTTGCCAATCC
[0022]步骤二，饲喂dsRNA对小菜蛾死亡率、生长发育及保幼激素酯酶活性的影响
[0023]将合成的dsRNA用超微量紫外分光光度计测定其浓度为412.410ng/ μ L，用DEPC处理水稀释至6.444,25.776、103.102,412.410ng/μ L的dsRNA溶液，对照为DEPC处理水。
[0024]将发育一致并经饥饿4h的3龄初期幼虫移到小培养皿中，每皿10头，每个浓度重复3次。将dsRNA涂抹于叶碟表面，相向重叠，制成“三明治”。饲喂幼虫。每8h更换叶碟，并观察每个处理幼虫的存活数以及生长发育情况。
[0025]dsRNA饲喂小菜蛾3龄幼虫后，每24h取样测定试虫保幼激素酯酶活性。
[0026]试验结果及分析
[0027](I) dsRNA对小菜蛾存活的影响
[0028]取小菜蛾3龄幼虫饲喂不同浓度的dsRNA，观察并统计小菜蛾的死亡时间及死亡数量，结果分析，dsRNA的摄入给小菜蛾带来了一定程度的死亡，但与dsRNA的浓度不成相关比例关系。随着时间的延伸，对照组最终死亡率12%。处理组的死亡情况经矫正后，仍然呈现不同程度的死亡，到实验结束，即dsRNA处理后72h，除了处理组3的死亡率达到了最高32%外，其他组的死亡率也分别死亡了 14%、22%、30%。由此可见,经dsRNA干扰后，小菜蛾的生长发育受到影响，最终导致了死亡。
[0029](2) dsRNA对小菜蛾生长发育的影响
[0030]小菜蛾食用dsRNA浸泡过的叶碟后，观察不同时间上小菜蛾的生长及发育速度，统计结果如表1所示。统计分析dsRNA对小菜蛾3龄幼虫的生长速度，结果显示，随着饲喂dsRNA浓度的升高，小菜蛾的生长速度有逐渐减慢的趋势，但是不同浓度处理间的差异不显著，不能断定结果是由于dsRNA的浓度差异造成的。
[0031](3) dsRNA对小菜蛾3龄幼虫保幼激素酯酶活性的影响
[0032]取不同饲喂时间的小菜蛾幼虫，提取保幼激素酯酶酶原，测定蛋白含量和20min内酶反应消耗底物的物质的量，并计算JHE酶比活，显著性检验结果如附表2所示。在整个实验中，保幼激素酯酶活有先降低再升高，又降低的趋势。实验开始，Oh处理组412.454和对照有差异外，各处理组的酶比活没有显著差异；24，对照组和103.114浓度下的试虫JHE酶比活没有显著差异，但和其他处理组的差异达到显著水平；48h，对照和6.445ng/yL的酶比活差异没有达到显著水平，但和高浓度dsRNA处理的差异达到显著水平。由于饲喂dsRNA导致了小菜蛾生长发育速度不同，而处在不同发育龄期、同一龄期的不同阶段的小菜蛾的保幼激素酯酶基因表达水平不同，后试虫的生长发育出现差异，导致酶比活的变化趋势也呈现延迟现象。
[0033]表1RNAi对小菜蛾3龄幼虫生长的影响
[0034]
【权利要求】
1.小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列，其特征在于:该序列为双链RNA分子，该分子正义链为SEQ ID NO:1所示，反义链为SEQ ID NO:2所示；或者正义链由SEQ ID NO:1，反义链由SEQ ID NO:2的核苷酸序列碱基取代、缺失或添加而形成的，且能作用于保幼激素酯酶基因的RNA序列。
2.小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列，其特征在于:该序列为双链RNA分子，该分子正义链为SEQ ID NO:3所示，反义链为SEQ ID NO:4所示；或者正义链由SEQ ID NO:3，反正链由SEQ ID NO:4的核苷酸序列碱基取代、缺失或添加而形成的，且能作用于保幼激素酯酶基因的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列，其特征在于:所述序列可干扰编码保幼激素酯酶底物结合位点区域基因或编码保幼激素酯酶催化位点的基因表达。
4.一种如权利要求1或2所述的小菜蛾保幼激素酯酶基因的RNA干扰序列应用于小菜蛾防治。·
【文档编号】A01N57/16GK103849619SQ201310690060
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】魏辉, 顾晓军, 李新慧, 田厚军, 陈艺欣, 田素芬, 郑丽祯, 常虹 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所