Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种Lycium?exsertum组织培养及快速繁殖方法，以解决引进枸杞的繁殖问题。该方法包括如下步骤：外殖体处理、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗以及移栽，本发明的优点如下：A.本发明中对Lycium?exsertum进行继代培养时，仅使用了6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸配比，极大地降低了激素积累对多次继代的影响，同时也降低了成本。B.本发明中对Lycium?exsertum的继代苗木进行生根培养时，所采用的培养基配比中没有添加任何激素，做到了培养基配制的简化和成本的降低，并且效果较好。C.本发明中泥炭、蛭石、珍珠岩1∶1∶1的移栽基质混合配比，能够在栽培过程起到很好的保水和保温的作用，能够提高移栽的成活率。
【专利说明】Lyc i um exsertum组织培养及快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养领域,具体涉及Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]爺科枸杞属Lyciumexsertum是从美国引进的爺科枸杞属植物,主要分布在亚利桑那沙漠地区，其进化程度高于我国的枸杞。在生殖进化上，已经由雌雄同体和自交不亲和的二倍体进化到自交亲和的多倍体阶段，而我国仍处在自交不亲和的二倍体进化阶段。该种枸杞的引进对于我国枸杞的种质资源的改良有很大的意义。该种枸杞引进后面临的首要问题是进行扩大繁殖。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法，以解决引进枸杞的繁殖问题。
[0004]本发明技术方案如下:本发明种子为爺科枸杞属(Lycium exsertum)购于美国的 S&S SEEDS, INC.联系方式为 P.0.BOX 1275 CARPINTERIA AVE CARPINTERIA, CA93013，USA。
[0005]一种Lycium exsertum组织培养方法,具体步骤如下:
A、外殖体处理采用Lyciumexsertum幼嫩莖段作为外殖体,剪去叶片，留少量叶柄,每2-3个芽剪成一段，将茎段洗去污溃，后用水冲洗干净，冲洗时间为5-10min，然后将其放入超净工作台中，进行 消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用；
优选的，消毒的最佳方案如下:先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6—6.5分钟，最后用无菌水清洗3-4次；
B、初代培养
以MS培养基为基础培养基，添加不同类型的激素及数量进行初代培养。通过初代培养可以获得所繁育物种的无菌材料。这一阶段的培养效果依植物种类及培养基成分而异，可能形成一个芽或多个芽。
[0006]优选的，添加0.05mg/L的萘乙酸(NAA)、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件是光强为30001x全光照24h，温度为:25°C，湿度为70%RH。
[0007]C、继代培养
在初代培养的基础上获得的芽苗数量不多，还需进一步扩大繁殖，才能发挥组织培养快速繁殖的优势。
[0008]通过对L.exsertum的最佳培养基的筛选，培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸。
[0009]优选的，继代培养基主要成分以及培养条件如下:以MS培养基为基础培养基,添加0.1 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光强为30001x全光照24h，温度为23°C，湿度为70%RH。
[0010]优选的，所述6-苄氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚_3_乙酸的浓度比为2:1时，芽分化系数最高，生长最旺盛。
[0011]D、生根培养
继代培养扩大繁殖后进行生根诱导获得完整再生的植株。
[0012]生根培养有三种优选方案:方案一、所述步骤D生根培养条件:使用步骤C继代培养植株叶片为材料，以1/4的MS培养基为基础培养基，添加1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光强为30001x下12h光暗交替，温度为23°C，湿度为70%RH。
[0013]方案二、使用步骤B的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养，
方案三、使用步骤C的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养，方案二和三的培养条件:以1/2MS培养基为基础培养基，添加1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6_BA)、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培养条件是先在25°C下暗培养7d，然后在25°C、光强为30001x全光照，湿度为70%RH下培养至丛芽长出。此条件下丛芽增殖系数最高，生长最旺盛，增殖系数能达到
5.0以上。
[0014]E、炼苗移栽
炼苗:将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗5-7d，让组培苗逐渐适应外界条件。
`[0015]移栽:炼苗移栽基质以泥炭、蛭石、珍珠岩1:1:1混合配制，将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜。
[0016]优选的，炼苗移栽对基质用0.1%多菌灵浇透，移栽时将炼好苗的植株的根部浸入
0.1%多菌灵和0.1 g/Ld的NAA混合溶液中浸泡lOmin。
[0017]优选的，枸杞组培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必须设置遮阳网，光强度为全光照时的30%。每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放。适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4MS营养液。待幼苗成活后逐渐全光照。
[0018]发明的优点:
I)本发明中对Lyciumexsertum进行继代培养时,仅使用了 6-节氨基腺嘌呤(6-BA)与吲哚-3-乙酸(IAA)配比，极大地降低了激素积累对多次继代的影响，同时也降低了成本。
[0019]2)本发明中对Lyciumexsertum的继代苗木进行生根培养时,所采用的培养基配比中没有添加任何激素，做到了培养基配制的简化和成本的降低，并且效果较好。
[0020]3)本发明中泥炭、蛭石、珍珠岩1:1:1的移栽基质混合配比，能够在栽培过程起到很好的保水和保温的作用，能够提高移栽的成活率。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例进一步说明本发明的具体实施过程，但不以任何方式限制本发明。
[0022]实施例1 A、外殖体处理
采集Lycium exsertum幼嫩茎段作为外殖体，剪去叶片，留少量叶柄,每2_3个芽剪成一段，将茎段用洗衣粉水洗去污溃，后用自来水冲洗干净，冲洗时间为5-10min。然后将其放入超净工作台中，进行消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用。
[0023]B、初代培养
每次处理接种30瓶，外殖体接种后每隔7天记录一次生长状况。
[0024]以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的NAA、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件是光强为30001x全光照 24h，温度为25°C，湿度为70%RH。不定芽生长的比例达到93.3%。
[0025]C、继代培养
培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS培养基为基础培养基，添加0.1 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光照:24h/d，光强为30001x，温度为23°C，湿度为70%RH。此条件增殖系数最高，生长最旺盛。每次处理接种30瓶，每7天观察并记录幼苗的增殖效果。
[0026]D、生根培养
生根培养基主要成分以及培养条件:以1/4的MS培养基为基础培养基，添加1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光强为30001x下12h光暗交替，温度为23°C，湿度为70%RH。从第7d开始生根，15d后可移栽，生根率在80%以上，生根条数平均在4.3条。
[0027]E、炼苗移栽 炼苗:将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗5-7d，让组培苗逐渐适应外界条件。
[0028]实施例2
与实施例1区别在于生根培养步骤不同:使用步骤B的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养，以1/2MS培养基为基础培养基，添加1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培养条件是先在25°C下暗培养7d，然后在25°C、光强为30001x全光照，湿度为70%RH下培养至丛芽长出。
[0029]实施例3
与实施例1区别在于生根培养步骤不同:使用步骤C的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养，以1/2MS培养基为基础培养基，添加1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培养条件是先在25°C下暗培养7d，然后在25°C、光强为30001x全光照，湿度为70%RH下培养至丛芽长出。此条件下丛芽增殖系数最高，生长最旺盛，增殖系数能达到
5.0以上。
[0030]实施例4
对实施例1炼苗后的产品进行移栽:炼苗移栽基质以泥炭、蛭石、珍珠岩1:1:1混合配制，在移栽前对基质进行高温灭菌。冷却后装盆，准备移栽，移栽前对基质用0.1%多菌灵浇透；移栽时将炼好苗的植株完整的从锥形瓶中取出，放入水中洗净根上的培养基，将根部浸入0.1%多菌灵和0.1 g/L的NAA的混合溶液中浸泡lOmin。将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜。
[0031]枸杞组培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必须设置遮阳网，光强度为全光照时的30%左右。每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放。适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4MS营养液。15d后统计成活率，移栽成活率在90%以上，而在沙和田园土基质中移栽的效果较差。
[0032]实施例5与实施例1不同之处在于，步骤A消毒的具体方案如下:先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6min，最后用无菌水清洗3_4次。
[0033]实施例6与实施例1不同之处在于，步骤A消毒的具体方案如下:先用75%酒精振荡消毒5s,再用0.1 %升萊溶液消毒6.5min,最后用无菌水清洗3_4次。该方案效果最佳，正常生长的比例可达85%。
[0034]试验
试验一、考察用0.1%升汞消毒为6min，并且用75%酒精消毒，看消毒时间对初代培养生长的影响:
将准备好的材料先用75%酒精分别消毒4s、5s、6s、7s、8s ;再用0.1%升汞溶液消毒6min，后用无菌水冲洗3-4遍。再剪去嫩茎两端接种，每瓶接种I个，每处理接种30瓶。接入培养基中，统计污染、干枯和正常生长的个数，结果见表1。
【权利要求】
1.一种Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于该方法包括如下步骤: A、外殖体处理采用爺科枸杞属(Lyciumexsertum)幼嫩莖段作为外殖体,剪去叶片，留少量叶柄，每2-3个芽剪成一段，将茎段洗去污溃，后用水冲洗干净，冲洗时间为5-10min，然后将其放入超净工作台中，进行消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用； B、初代培养 以MS培养基为基础培养基进行初代培养； C、继代培养 培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸； D、生根培养:以MS为基本培养基； E、炼苗移栽 炼苗:将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗5-7d ;移栽:炼苗移栽基质以泥炭、蛭石、珍珠岩1:1:1混合配制，将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜。
2.根据权利要求1所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤A消毒方案如下:先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6 — 6.5分钟，最后用无菌水清洗3-4次·。
3.根据权利要求2所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤B的培养过程为以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的萘乙酸、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8，培养条件是光强为30001x全光照24h，温度为25°C，湿度为70%RH。
4.根据权利要求3所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤C继代培养条件如下:以MS培养基为基础培养基，添加0.1 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光强为30001x全光照24h，温度为23°C，湿度为70%RH。
5.根据权利要求4所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述6-苄氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸的浓度比为2:1。
6.根据权利要求5所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤D生根培养条件:使用步骤C继代培养植株叶片为材料，以1/4的MS培养基为基础培养基，添加1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8 ;培养条件是光强为30001x下12h光暗交替，温度为23°C，湿度为70%RH。
7.根据权利要求5所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤D生根培养条件:使用步骤B或步骤C的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养，以1/2MS培养基为基础培养基，添加1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸；培养条件是先在25°C下暗培养7d，然后在25°C、光强为30001x全光照，湿度为70%RH下培养至丛芽长出。
8.根据权利要求6或7所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤E中炼苗移栽对基质用0.1%多菌灵浇透，移栽时将炼好苗的植株的根部浸入`0.1%多菌灵和0.1 g/Ld的NAA混合溶液中浸泡lOmin。
9.根据权利要求8所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤E中组培苗移栽初期，设置遮阳网，光强度为全光照时的30%。
10.根据权利要求9所述的Lyciumexsertum组织培养及快速繁殖方法,其特征在于:所述步骤E移栽前两日遮光密封保湿培养，第三日开始每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放；适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4的MS营养液，待幼苗成活后逐渐全光照。``
【文档编号】A01H4/00GK103843664SQ201410110179
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】李捷, 冯丽丹, 王有科, 张宝琳, 张广忠, 蔡国军 申请人:甘肃农业大学