一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因RMg39及其应用。本发明公开了水稻稻瘟病新抗性基因RMg39的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。此基因属于NBS-LRR类型抗病基因家族的成员。本发明中的抗稻瘟病基因克隆自对稻瘟病菌表现出高抗的水稻品系，并将其转化至对稻瘟病菌感病的品种中，利用稻瘟病菌侵染的方法对其抗病能力进行评估，从而最终确定该基因对水稻稻瘟病具有抗性。
【专利说明】-种水稻稻瘟病抗性基因 RMg39及其应用
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【技术领域】
[0002] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因 RMg39及其应 用。
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【背景技术】
[0004] 植物抗病基因是植物与病原菌长期相互作用、相互选择、协同进化的结果，在植 物的进化过程中扮演着十分重要的角色。自从第一个植物抗病基因 Hml在1992年被 Johal和Briggs从玉米中分离以来（Tanksley et al. 2007;董玉琢,2001)，到目前为 止，已经超过60个植物抗病基因从不同的植物中得以克隆和分离，部分抗病基因已在分 子育种中得到应用，为有效控制植物病害提供了新的途径。除少数抗病基因外，植物抗 病基因的结构相对保守，主要类型为NBS-LRR结构类型（Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat，即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复蛋白）；另外还有少部分抗病基 因主要为 eLRR-TM-pkinase、eLRR-TM、STK 等类型。
[0005] 大量实践证明，开发和利用已有的植物抗病种质资源是防治植物病害的最为有 效的方法之一（Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)。传统的抗病品种培育，一般包括 三个基本环节：（1)广泛收集种质材料；（2)对收集的种质材料进行保存、鉴定和筛选，从中 得到抗病种质；（3)优质高产的品种与抗病性强的材料杂交，然后通过不断的回交选育，最 后得到抗病且优质的新品种。这一选育过程不仅繁琐，且极其耗时。经典的图位克隆方法 利用抗病和感病的品种杂交，然后对大量的分离后代接种病菌、鉴定抗性、遗传作图等，最 后在精确遗传定位的基础上进行克隆。但因其周期长、费时费力、分离和等位性检测较难等 原因，不适合大量克隆抗病基因的需要。同时，因抗病基因独特的遗传方式，也使该方法的 应用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因为例，该类基因在基因组中通常成簇（gene cluster)分布（Wang et al. 1999;Liu et al. 2002; Lin et al. 2007)，在不同品种的 同源染色体间的位置和结构也多呈不对称分布，等位关系不明确，拷贝数变异大（Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。这些遗传现象，大 大增加了图位克隆的难度，严重影响了抗病基因的克隆效率。
[0006] 近年来，随着植物抗病及抗病相关基因分子水平研究的突破性的进展，使我们对 植物抗病及抗病相关基因的结构、功能、起源、变异及保存的认识有了根本性的变化。即植 物抗病基因，主要是一类含有LRR结构域的基因，其中又以NBS-LRR (核酸结合-富含亮氨 酸)类型抗病基因为主。由于这些基因在结构与功能上都具有高度的相似性，结合其独特的 遗传与进化特征，为快速的克隆与鉴定这些基因提供了便利，也为高效地利用抗病种质资 源提供了新的机遇。
[0007] 稻瘟病是世界上分布最广、危害水稻最严重的病害之一，严重影响到水稻的产量， 给农业产生巨大的损失,全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失占 11-30% (约合I. 57亿 美元，http://www. fungalgenomics. ncsu. edu)，直接威胁到稻农增收和国家的粮食安全。 因此，在世界各国，解决稻瘟病难题一直是保障水稻持续生产的一个优先研究的课题。但是 由于病菌本身变异与分化速度快(凌忠专等，2004)，新的稻瘟病菌生理小种层出不穷，使已 有的抗病基因 （Plant disease resistance，R基因）很快丧失抗性，稻瘟病的防治就变得 更加困难。
[0008] 因此，克隆并直接转化抗病基因可能是最直接有效的培育抗病品种的途径。本发 明充分利用植物抗病基因结构上的相似性及独特的遗传变异与进化特征，采用生物信息学 方法筛选潜在的抗病基因，并利用分子生物学技术大量、快速克隆候选抗病基因，最终在水 稻中得到多个具有稻瘟病抗性的基因。
[0009]
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是，分离克隆水稻高抗品种中携带的稻瘟病抗性基因 RMg39及包含 调控这个基因的启动子的DNA片段。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因 RMg39所编码的蛋白质序列。
[0012] 本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。
[0013] 本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。
[0014] 本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
[0015] 本发明涉及克隆和鉴定一种包含RMg39基因的DNA片段，这些基因编码的蛋白能 使水稻对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。其中，所述片段分别如序列表SEQ ID NO: 1所示或者基本上相当于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 1所示序列的亚片段。这些DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所分离、克隆的RMg39抗性基因编码NBS-LRR蛋白。蛋白包含两个主要的结构 域：NBS和LRR区域，RMg39蛋白的C-末端为17个LRR重复。
[0016] 根据本发明提供的RMg39基因序列信息（SEQ ID NO: 1)，本领域技术人员可以通过 以下方法获得与RMg39等同的基因：（1)通过数据库检索获得；（2)以RMg39基因片段为探 针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；（3)根据RMg39基因序列信息设计 寡核昔苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取； (4)在RMg39基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5)用化学合成的方法获得该基 因。
[0017] 本发明提供的稻瘟病抗性基因 RMg39具有重要的应用价值。将所述的RMg39基因 序列用任何一种转化方法导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品 种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控 序列适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽抗谱或增强抗 性。
[0018] 本发明具有如下有益效果：将克隆的抗稻瘟病基因转入感病的植物中，有助于获 得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用，从而能够克服传统抗病 育种中远缘杂交的困难。此外，可以用转基因技术在植物中累加多个抗病基因，缩短育种周 期。本发明还能够进一步提供或应用上述DNA片段获得的抗病转基因植株和相应的种子， 以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用 有性杂交的方式将本发明的基因转入其他植株。
[0019]
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明流程不意图。图IA :抗稻癌病候选位点的确定；图1B-E :抗稻癌病 基因的分离与克隆；图IF-G :抗稻瘟病基因的遗传转化；图IH :转化体的鉴定。
[0021] 图2为稻瘟病抗性基因 RMg39的转化体的潮霉素抗性基因和CaMV 35S启动子的 PCR检测电泳图；图IA为CaMV 35S启动子的PCR扩增产物，泳道1-6为转化体的PCR扩增 产物，泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物，泳道8为受体新2号的非转 化体的PCR扩增产物；图IB为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1-6为转化体的PCR扩增 产物，泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物，泳道8为受体新2号的非转 化体的PCR扩增产物。
[0022] 图3为稻瘟病抗性基因 RMg39的转化植株抗性鉴定图。图3A:稻瘟病抗性基因 RMg39的转化植株的抗性鉴定图；图3B :对照植株新2号的抗性鉴定图。
[0023]
【具体实施方式】
[0024] 水稻抗稻癌病候选基因的确定：以水稻全基因组测序品种93-11和日本晴为基 础，首先鉴定基因组中所有的NBS-LRR类型的抗病基因，并构建系统进化树。在此基础上， 我们选取了 20个候选的抗稻瘟病基因位点，通过引物设计、在抗稻瘟病的水稻品种中进行 长片段PCR、载体构建、转基因、抗性鉴定等过程，最后通过10个来源于中国大陆分布所有 水稻主产区的稻瘟病菌系统鉴定，鉴定出1个具有特异性抗性的抗稻瘟病基因。
[0025] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
[0026] 实施例1稻瘟病抗性基因 RMg39的克隆、载体构建、抗病植株鉴定 本实施例的试验流程如图1所示。
[0027] 1、抗稻瘟病候选位点RMg39的确定：（1)在日本晴中有1个相近的拷贝，93-11中 有2个相近的拷贝；（2)在其LRR区域，特别是xxLxLxx区域具有较高的Ka/Ks值； 2、稻瘟病抗性基因 RMg39 (Os 04g30930_Tet印）的分离与克隆：利用公共数据库测 序品种日本晴（Nipponbare)和93-11为参考序列，设计引物（引物两端皆带有酶切位点 AscI)。引物序列参见序列表，正向引物序列如SEQ ID N0:4所示；反向引物序列如SEQ ID NO:5所示。
[0028] 以抗病水稻品种Tet印，谷梅2号和Q2436为模板，利用长片段PCR技术 (Long-PCR)扩增候选基因片段。PCR程序如下：95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，60°C 复性45秒，68 °C延伸7分钟，共35个循环，随后72 °C保温10分钟，最后KTC恒温。随后对 PCR产物进行割胶回收。
[0029] 3、双功能基础载体的准备：将稀有酶切位点AscI导入双功能载体pCAMBIA1300的 多克隆位点BamHI和Sail之间，取代酶切位点XbaI，构成基础载体pCAMBIA1300-AscI。
[0030] 4、候选抗性基因与基础载体的连接：用限制性内切酶AscI，同时酶切PCR产 物与基础载体质粒，并纯化。在T4连接酶的作用下，将候选基因片段连入基础载体 pCAMBIA1300-AscI。
[0031] 5、候选抗性基因的遗传转化：将携有候选基因的双功能载体导入根癌农杆菌 EHA105,采用农杆菌介导法，将候选基因转化到水稻普感品种新2号。最后一共获得20株 独立的转化体。
[0032] 6、PCR分子检测：以转化体DNA为模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S启 动子的特异性引物对其进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参加序列表，正向引物 序列如SEQ ID N0:6;反向引物序列如SEQ ID NOJtjCaMVSSS启动子的引物序列参加序列 表，正向引物序列如SEQ ID NO:8;反向引物序列如SEQ ID NO:9。
[0033] 7、转化体的抗性鉴定：选择10个来源地不同，区别力好的独立稻瘟病菌生理小种 作为检测的病原菌种。利用稻瘟病菌小种接种感染T2代转基因植株和对照品种，筛选抗病 性改变的转化体。抗性鉴定结果显示候选基因 RMg39在普感品种新2号的遗传背景下，对 4个病原菌株都显示不同程度的抗性，表明候选基因 RMg39具有特异性抗性且被成功克隆 (图2和图3)。
[0034] 8、稻瘟病抗性基因 RMg39的基因结构和蛋白结构分析：采用步移法对RMg39的 DNA序列进行了测序。RMg39基因 DNA长度为6697bp，含有3个开放读码框，2个内含子和 3个外显子。RMg39编码的蛋白序列如SEQ ID N0:2所示。RMg39基因编码1个由1002个 氨基酸残基组成的蛋白多肽。RMg39蛋白属于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端为17个LRR 重复。
【权利要求】
1. 一种水稻抗稻瘟病基因RMg39,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或者 其核苷酸序列是与SEQ ID NO: 1所示的DNA序列在相似度上> 95%相似的DNA序列，或其核 苷酸序列的功能相当于SEQ ID N0:1所示DNA序列的亚片段,或者如SEQ ID N0:1所示的 DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述基因序列编码的蛋白。
3. 根据权利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或SEQ ID NO:2 所示的序列经过替换、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4. 一种调控如权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因RMg39的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
5. 根据权利要求1所述的一种水稻抗稻瘟病基因RMg39,其特征是含有调控水稻抗稻 瘟病基因RMg39的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 含有权利要求1所述基因的转化载体。
7. 含有权利要求6所述转化载体的宿主细胞根癌农杆菌EHA105。
8. 含有权利要求6所述转化载体的转基因植物。
9. 权利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育种中的应用。
10. 权利要求2所述蛋白在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
【文档编号】A01P3/00GK104404052SQ201410462177
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】田大成, 贾艳晓, 杨四海, 张小辉 申请人:南京大学