一种解淀粉芽孢杆菌fs6及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用。所述解淀粉芽孢杆菌FS6，其保藏号为CGMCC No.9538，并提供了所述解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌FS6及其菌剂对人参根部和叶部病原菌具有较高抑菌活性，可诱导人参的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等与防卫相关的酶活性升高，提高人参对病原菌的抗性，可稳定定殖于人参植株和土壤中，在施用对象表面形成一层保护膜阻止病原菌侵入，有效减少人参根部和叶部病害的发生，并且对人参无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发潜力和应用前景。CGMCC No953820140825
【专利说明】一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业微生物【技术领域】，具体地涉及一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应 用。
【背景技术】
[0002] 人参（Panax ginseng C. A. Meyer)作为名贵中药材，在我国栽培面积最大、产量最 高。我国已成为世界上主要的人参生产国和出口国，每年生产的人参产量占世界总产量的 78 %以上，出口量占国际市场的60 %以上，但产生的经济效益却很低。中国的人参产量约为 韩国的3倍，而产值却仅为韩国的1/4,这主要是由于人参中农药残留超标，农药使用不合 理造成的。
[0003] 人参生育期较长，一般4?6年，同时人参对生产条件的要求较高，在其整个生长 过程中极易遭受各种病原菌的侵袭，由此造成多种病害发生。已有记载的人参病害有40余 种，我国约有25种以上。其中侵染性病害主要有人参灰霉病和人参黑斑病等。人参灰霉 病是由葡萄孢属灰葡萄孢（Botrytis cinerea)侵染所致，为半知菌类葡萄孢属真菌，主要 危害人参的叶片、叶柄、花和果实，严重发生时亦可危害茎及根部。自2002年起，人参灰霉 病在我省人参产区发病率逐年上升，防治不及时，可造成严重损失。人参黑斑病是由人参链 格孢（Alternaria panax)侵染所致,为半知菌交链孢属真菌。人参黑斑病是人参生产上发 生最普遍，危害最严重的病害之一，发病率为20%?30%，严重时可达100%，可危害叶片、 茎、果实和根。
[0004] 对于人参病害的防治，目前应用较多的主要有化学农药防治、农业防治和生物防 治，其中生物防治具有无毒、无残留、病原菌不易产生抗药性等优点，应用前景广阔。从人参 主产区采集土样，从中分离生防菌株，应用于田间防治，具有重要的实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌FS6及其应用，目的是提供一株来源于人参主产 区土壤中，可用于防治人参病害的解淀粉芽孢杆菌，可定殖于人参植株和土壤中，可增强人 参多种防御酶活性，可与化学农药防治相结合，降低人参农药残留量。
[0006] 一种解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) FS6,已于 2014 年 8 月 25 号 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC ;地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号；邮编：100101，保藏编号CGMCC No. 9538。
[0007] 本发明一种实施方式是含有所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
[0008] 本发明所述菌剂的活菌数为109Cfu。
[0009] 本发明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28°C下培养1-2 天；
[0011] (2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28°C条件下在摇床 中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
[0012] (3)菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28°C条件下在摇床中180r/min震 荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
[0013] 上述步骤（1)菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g， NaCl 5. 0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂粉 15g，ρΗ7· 0。
[0014] 上述步骤（2)发酵种子培养所用的液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨 10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0。
[0015] 上述步骤（3)菌剂发酵中KMB培养基配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g， K2HPO4L 5g，MgSO4 · 7Η201· 5g，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 0。
[0016] 上述步骤（3)中种子液的接种量为6%。
[0017] 本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治植物灰霉病和黑斑病的应用。
[0018] 本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治人参灰霉病和黑斑病的应用。
[0019] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FS6及其发酵液菌剂对人参植株有诱导抗性作 用，可诱导人参过氧化物酶（POD)、多酚氧化酶（PPO)、苯丙氨酸解氨酶（PAL)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶（SOD)活性的提高。菌株FS6可稳定定殖于人参植株和土壤中，利于 增强菌剂的抗病原菌活性。此外，解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂对人参灰霉病和黑斑病 均有较好田间防效。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂用于植物灰霉病和黑斑病， 尤其是人参灰霉病和黑斑病的防治。
[0020] 本发明的有益效果是：解淀粉芽孢杆菌FS6及其菌剂对人参植株有增强防卫能力 作用，在人参植株和土壤中具有较强的定殖能力，并且在大田防治中，对人参灰霉病和黑斑 病有良好的防治效果。有效减少人参病害的发生，降低农药在人参中的残留量，并且对人参 无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图IA是解淀粉芽孢杆菌FS6在NA平板上的菌落形态图；
[0022] 图IB是用透射电镜观察到的FS6菌体形态图；
[0023] 图2A是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后POD酶活性的变化图；
[0024] 图2B是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后PPO酶活性的变化图；
[0025] 图2C是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后PAL酶活性的变化图；
[0026] 图2D是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后CAT酶活性的变化图；
[0027] 图2E是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液处理人参后SOD酶活性的变化图；
[0028] 图3A是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂进行叶面喷雾处理后在人参根、茎、叶及 土壤中体内的定殖动态图；
[0029] 图3B是解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液菌剂进行灌根处理后在人参根、茎、叶及土壤 中体内的定殖动态图。
【具体实施方式】
[0030] 一种解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) FS6,已于 2014 年 8 月 25 号 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC ;地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号；邮编：100101,保藏编号CGMCC No. 9538。
[0031] 本发明一种实施方式是含有所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
[0032] 本发明所述菌剂的活菌数为109cfu。
[0033] 本发明解淀粉芽孢杆菌FS6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0034] (1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28°C下培养1-2 天；
[0035] (2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28°C条件下在摇床 中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
[0036] (3)菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28°C条件下在摇床中180r/min震 荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
[0037] 上述步骤（1)菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g， NaCl 5. 0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂粉 15g，ρΗ7· 0。
[0038] 上述步骤（2)发酵种子培养所用的液体培养基配方为：牛肉膏5.0g，蛋白胨 10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0。
[0039] 上述步骤（3)菌剂发酵中KMB培养基配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g， K2HPO4L 5g，MgSO4 · 7Η201· 5g，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 0。
[0040] 上述步骤（3)中种子液的接种量为6%。
[0041] 本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治植物灰霉病和黑斑病的应用。
[0042] 本发明所述解淀粉芽孢杆菌在防治人参灰霉病和黑斑病的应用。
[0043] 以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和 实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0044] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0045] 实施例1解淀粉芽孢杆菌FS6的分离、筛选及鉴定
[0046] I. 1细菌的分离
[0047] 采用稀释分离法对采集到的人参主产区土壤样品进行分离。取3g 土壤样品加入 30mL无菌水中，以240r/min，28°C，振荡培养30min后取出待用。在无菌条件下将土壤悬浮 液用无菌水逐级稀释为10'10」、KT 5三个浓度梯度。依次取100 μ L涂布于NA培养基表 面，每个处理设3次重复，置于28°C恒温培养箱培养48h。培养期间定期观察，选择优势菌 落的细菌菌落进行纯化，保存备用。
[0048] 牛肉膏蛋白胨培养基（NA):蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂粉15g，蒸馏水 lOOOmL，pH 7. 0-7. 2。
[0049] I. 2解淀粉芽孢杆菌FS6的筛选获得
[0050] 初筛：采用平皿对峙培养法对I. 1中分离纯化得到的各细菌菌株进行拮抗筛选。 用内径为8_的打孔器打取活化好的病原菌（人参灰霉病和黑斑病菌）置于PDA平板的中 央，在距平板中心2. 4cm处呈十字形交叉形分别用打孔器（内径8mm)打洞，用移液枪吸取 30 μ L拮抗菌菌液于孔洞内。每处理设3个重复，25 °C培养3-7d后测量抑菌带宽度，将具有 拮抗作用的菌株保存备用。
[0051] PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂16g，蒸馏水1000ml。
[0052] 复筛：将初筛获得的拮抗菌株置牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，取各菌 苔一环分别接入IOOmL种子培养液中培养48h作种子液，再分别吸取100 μ L种子液注 入150ml菌剂发酵培养液中，于摇床中180r/min、28°C的条件下培养48h。取各培养液于 10000r/min离心lOmin，取上清液经0. 22 μ m滤膜过滤得上清滤液，吸取各上清滤液与温度 约为45°C PDA培养基混合制成含上清滤液浓度为8%的平板，采用生长速率法筛选出对人 参灰霉病菌和人参黑斑病菌菌丝生长抑制作用最强的菌株，得到目标菌株FS6。
[0053] 牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂粉 15g，ρΗ7· 0。
[0054] 种子培养液配方：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水lOOOmL，ρΗ7. 0。
[0055] 菌剂发酵培养液配方：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO 4L 5g， MgSO4 · 7Η201· 5g，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 0。
[0056] I. 3解淀粉芽孢杆菌FS6的鉴定
[0057] 形态观察的结果表明，菌株FS6在NA培养基上形成乳白色菌落，菌落不透明，表 面干燥粗糙且有褶皱现象，菌落形状不规则，边缘不整齐。为革兰氏阳性杆菌，细胞呈直杆 状，周生鞭毛，具有运动性，能产生椭圆形芽孢（如图1所示）。菌株生理生化特性结果表 明，接触酶、氧化酶、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解、V-P、硝酸盐还原、明胶液化、二羟基丙酮等 反应为阳性，能利用柠檬酸盐、水解酪朊、淀粉，PH5. 7和6. 8、10-50°c、2-10% NaCl、有溶菌 酶均能良好生长，能使明胶液化、淀粉水解，生长良好，能利用D-葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露 醇和D-木糖。16S rRNA序列分析结果表明，该菌的16S rRNA序列与已报道的解淀粉芽孢 杆菌具有较高的同源性。此外，采用BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌株FS6进行 鉴定，根据微生物鉴定专家数据库信息设计鉴定反应最佳组合进行鉴定，置信度值为99%。 综上，通过形态特征、生理生化反应、分子鉴定及BD Phoenix-100微生物自动鉴定系统对菌 株FS6进行鉴定，将菌株FS6鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。
[0058] 实施例2解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液的制备
[0059] (1)菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28°C下培养1-2 天；
[0060] (2)发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28°C条件下在摇床 中180r/min震荡培养24h，制得种子液；
[0061] (3)菌剂发酵：
[0062] 按6%的接种量，将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，于28°C条件下在摇床 中180r/min震荡培养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂（活菌数约为3. OX IO9Cfu/ ml)。
[0063] 菌株活化培养用固体培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馈 水 lOOOmL，琼脂粉 15g，ρΗ7· 0。
[0064] 菌株发酵种子培养用液体培养基配方为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g， 蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 0。
[0065] 菌剂发酵培养基KMB配方为：蛋白胨20g，甘油10mL，葡萄糖20g，K2HPO 4L 5g， MgSO4 · 7Η201· 5g，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ7· 0。
[0066] 实施例3解淀粉芽孢杆菌FS6滤液对人参防御酶活性的影响
[0067] 3. 1解淀粉芽孢杆菌FS6发酵液滤液对人参过氧化物酶（POD)活性的影响
[0068] 将实施例2制备的解淀粉芽孢杆菌FS6种子液以4%的接种量接种于LB培养基， 相同培养条件培养48h，细菌悬浮液采用分光光度计测0D_值，稀释至浓度为6 X 108cfu/mL 后，将其喷施于人参叶面，以等量的清水为空白对照每个处理设3次重复。于处理后0、1、2、 3、4、5、6(1采用对角线五点随机取样，采集人参叶片5(^，置于-201：冰箱保存备用。
[0069] 称取人参样品0. 5g，放入预冷的研钵中，液氮下迅速研磨成粉末，加5mL 0. IM(pH 5. 5)的乙酸-乙酸钠缓冲液，在冰浴条件先研磨成勻楽，于4-C、5000r/min离心30min，收 集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
[0070] POD测定：25mM愈创木酚溶液5mL 50mM H2O2溶液IOOyL,粗酶液10yL，空白不加 粗酶液，用缓冲液代替，均匀混合，于37°C水浴5min，冰浴终止反应，在470nm测定吸光度， 每个处理3次重复。在上述条件下，每毫克鲜重每分钟OD 47tl值变化0. 01为一个酶活力单 位。
[0071]
【权利要求】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌FS6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的 保藏号为CGMCC No. 9538,保藏日期2014年8月25号。
2. 含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活菌数为109cfu。
4. 权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括以下步骤： (1) 菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌FS6接种于固体培养基上，于28°C下培养1-2天； (2) 发酵种子培养：将上述活化菌株接种于液体培养基中，于28°C条件下在摇床中 180r/min震荡培养24h，制得种子液； (3) 菌剂发酵：将种子液接入KMB培养基中，于28°C条件下在摇床中180r/min震荡培 养36h，制得解淀粉芽孢杆菌FS6的菌剂。
5. 根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤⑴中所述固体培养基为： 牛肉膏 5. 0g，蛋白胨 10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水 1000mL，琼脂粉 15g，pH7. 0。
6. 根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2)中所述液体培养基为： 牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水 1000mL，pH7.0。
7. 根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3)中所述KMB培养基配方 为：蛋白胨 20g，甘油 10mL，葡萄糖 20g，K2HP041. 5g，MgS04.7H20L 5g，蒸馏水 1000mL，pH7. 0。
8. 根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3)中种子液的接种量为 6%。
9. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6在防治植物灰霉病和黑斑病中的应用。
10. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌FS6在防治人参灰霉病和黑斑病中的应用。
【文档编号】A01N63/00GK104388335SQ201410581729
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】高洁, 王春伟, 刘丽萍, 王燕, 白庆荣, 杨丽娜, 陈长卿, 欧师琪, 王雪 申请人:吉林农业大学