变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用，属中药材【技术领域】。本发明的生产菌株变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1，已于2013年8月8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013367。本发明的变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株，用利福平标记方法确定能在石斛上定殖，能够作为制备用于促进石斛生长的制剂中的应用。本发明的优点在于具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点；对石斛有显著促生长效果。CCTCC NO：M 20133672013.08.08
【专利说明】变栖克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-1菌株的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及变栖克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-l菌株的应用，属中药材技 术领域。
【背景技术】：
[0002] 石斛为兰科石斛属植物，是一种名贵中草药，有一定解热镇痛作用，能促进胃液分 泌，助消化。有增强新陈代谢、抗衰老等作用。属于多年生附生草本，高30?50厘米。茎丛 生，多节，节间长2.5?3.5厘米。野生石斛多附生于高山岩石或森林中的树干上。喜温暖 湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。分布四川、贵州、云南、湖北、广西、台湾等地有栽培。 全年均可采挖，但以秋后采挖者质量好。采回后如保存鲜用时，在春、秋季则应及时栽培于 细砂石中，放置阴湿处，经常浇水使根部保持湿润。在冬天应平放于竹筐内，上盖蒲包，但应 注意空气流通。
[0003] 关于栽培技术。由于石斛主要栽培于温室或大棚，其温度和湿度相对而言较易控 制，所以用无性繁殖或试管苗快速繁殖技术已经很成熟，在选附主、繁殖、田间管理、防治病 虫等方面的配套措施也很完善。然而在相同肥水管理条件下，通过使用微生物菌剂促进石 斛生长健壮、根系发达、萌蘖多，对石斛安全生产及可持续性发展具有极大的应用前景，是 有前途的方法。本发明涉及施用微生物菌剂促进石斛生长的应用。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的在于提供一种变栖克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-I菌株的
[0005]应用。
[0006] 本发明的生产菌株变栖克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH_l，已于2013年8月 8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCM2013367。保藏单位地址：武 汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0007] 本发明的变栖克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH_l菌株，用利福平标记方法 确定能在石斛上定殖，能够作为制备用于促进石斛生长的制剂中的应用。
[0008] 本发明的优点在于：具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点；对石斛有显著 促生长效果。
【具体实施方式】：
[0009] 一、菌株的获得
[0010] 本发明菌株的获得方法为常规方法，具体如下：
[0011] 新鲜铁皮石斛茎杆采自德宏，灭菌水洗净晾干后切成小段（1cm)，用70%乙醇表 面消毒5min，然后灭菌水漂洗3次，采用无菌操作技术纵向剖开茎杆，将剖开的茎杆置于马 铃薯葡萄糖液体培养基中30°C培养7天，取培养所得的菌液lmL，加到盛有9mL无菌水的试 管中，30°C摇床振荡培养20min，制成样品悬浮液。取ImL悬浮液加入盛有9mL无菌水的试 管中进行10倍系列稀释，选择10-5-10-7的稀释液分别取0.lmL，在PDA平板上采用稀释涂 布法分离纯化，30°C培养12-24h，挑取菌落形态不同的单菌落于PDA培养基平板上培养并 保存备用。
[0012] 筛选：将病原接种在PDA培养基平板中心，用已分离纯化出的细菌做成菌悬液，取 IOOuL菌悬液置于中心四周，28°C培养观察对峙培养抑菌情况。将抑制效果明显的细菌进行 形态、生理生化鉴定和16SrDNA分析。
[0013] 形态鉴定：LB固体培养基上纯化培养细菌，观察菌落形态、菌体形态。
[0014] 生理生化鉴定：参照常用细菌鉴定手册，采用吲哚试验、V-P试验、H2S试验等对分 离出的细菌进行生理生化检测。
[0015] 16SrDNA序列测定：采用CTAB/NaCl法提取SH-I基因组DNA。用于扩增 的引物为 16SrDNA扩增通用引物，27F:5 ' -AGAGTITTATCNTGGCTCAG-3 '和 1492R: 5 ' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3 '。扩增所得PCR产物有上海生工测序，测得的序列与 Genbank中已有的16SrDNA序列进行同源性比对。
[0016] 表I.SH-I菌株鉴定的形态及生理生化特征
【权利要求】
1.变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola)SH-l菌株在制备石斛生长制剂中的应用。
【文档编号】A01P21/00GK104351255SQ201410627779
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】赵明富, 文国松, 徐绍忠, 李梦娇 申请人:云南农业大学