一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法与流程

本发明涉及十字花科芸薹属芥菜类蔬菜育种技术，具体涉及一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法。

背景技术：

宽柄芥(Brassica juncea var.latipa)，系十字花科芸薹属芥菜种叶芥类蔬菜的一个变种，俗称笋壳菜、青菜、宽板菜，因其叶柄及中肋宽大肥厚、质地脆嫩，同时含不同程度的辛辣味、煮汤或涮火锅味道尤美，具有去热、御风湿、利五脏、补天阳促进血液循环之工效，颇受世人喜爱，是闻名于世的四川酸(泡)菜“主要原料，也是市民常用的特色鲜食蔬菜。目前在我国南方各省市区广泛栽培，年种植面积达150万亩以上，尤以四川、湖南、贵州等面积较大，生产种植加工也最为集中。

目前，国内外有关宽柄芥胞质雄性不育系选育与研究还未见报道。特别是宽柄芥大面积生产用种方面，长期以来，无论是川、湘、黔等省还是重庆市，都是直接使用表现稍好的地方品种，大面积生产上的“多杂乱”及“自交衰退”现象十分普遍，直接结果就是原料作物的生长不整齐、产量不高、品质差、抗病(逆)性弱等，严重制约着该产业的快速健康发展。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法，利用芥菜类蔬菜(茎瘤芥)不育系为不育源，通过杂交、后代择取典型单株与父本连续回交和SSR分子标记鉴定，培育出了不育性状稳定、经济性状良好且各具特色的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系，实现该作物“三系”配套，进而培育出高产优质抗(耐)病性强的宽柄芥杂交新品种，实现杂种优势利用，属国内外首创。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法，包括如下步骤：

选取茎瘤芥胞质雄性不育系JL154-5A作为母本，并同时选取宽柄芥优良自交系作为转育父本进行常规杂交获得F1，后代择取典型单株与父本连续回交7代，获得不育性状稳定，经济性状良好的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系。

本发明具有以下有益效果：

1、以茎瘤芥胞质雄性不育系为不育源，宽柄芥优良种质为父本，通过杂交和连续回交，在国内外率先培育出不育性状稳定、经济性状良好且各具特色的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系，丰富了芥菜类蔬菜的杂交育种遗传种质且属国内外首创。

2、以培育出的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系为基础，实现该作物“三系”配套，进而培育出高产优质抗(耐)病性强的宽柄芥杂一代新品种，实现杂种优势利用，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法的系谱图。

图2为本发明实施例引物“KBJ416”在宽柄芥不育系及保持系中多态性分布图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施事例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施事例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供了一种宽柄芥胞质雄性不育系的选育方法，包括如下步骤：

S1、以重庆市渝东南农科院范永红等培育出的茎瘤芥(榨菜)胞质雄性不育系“JL154-5A”作母本，2011年3月，在田间系统鉴定并确证“JL154-5A”不育性状稳定的基础上，选择不同性状、不同生态类型、不同熟性的宽柄芥优良自交系DJ、K6、HK-1、HK-2、K46、BK作父本进行常规杂交获得F1，后代择取典型单株与父本连续回交7代，获得不育性状稳定，经济性状良好的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系：DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和K46B、HK-2A和HK-2B、BKA和BKB；

2010年10月将茎瘤芥不育系“JL154-5A”，在重庆市渝东南农科院试验地进行播种育苗移栽，2011年3月在开花期对不育系的花器官构造、不育性状表现进行了观察鉴定，确证为不育性彻底、性状稳定的不育系后，以茎瘤芥不育系JL154-5A作母本，选取6个优良宽柄芥自交系、每自交系3个单株，与之分别成对杂交，得到F1代。2011年8月夏繁，从F1代中选择3个典型单株作母亲本，用上述对应的自交系宽柄芥S1回交，同时母本单株自交测定其结实性。连续4年(2011-2014)的春季和夏季，继续用宽柄芥自交系作轮回父本与之回交，同时母本单株套袋自交，测定其育性。到2015年5月选育出了不育度、不育株率为100％，且经济性状良好稳定的宽柄芥胞质雄性不育系及保持系6个

S2、在杂交和各回交世代，花期以材料为单位，进行单株套袋自交，考查不育株自花授粉的结实性。

S3、对回交7代(不育系)及其父本(保持系)，随机抽选3-5个典型单株在盛花期分别观察测定花冠、雄蕊、雌蕊和蜜腺的形状及大小，并对其开花特性进行系统观察。

S4、对回交7代(不育系)及其父本(保持系)的花粉，用0.5％的红四唑(TTC)液在38℃下恒温染色50min(分)，测定其生活力。

S5、对不育系和保特系，在重庆市渝东南农科院(海拔273m)进行正季种植，常规管理，各材料现蕾时，每材料选取5个典型单株，按《芥菜类蔬菜田间试验观察记载项目及标准》，系统观察其形态特征和主要性状表现。

2014年月9月～2015年2月，对已经完成回交转育并经育性鉴定达不育系标准的所有不育系和保持系，集中在渝东南农科院同一生态条件下栽培，对其形态特征和主要农艺性状进行了系统的观察鉴定。结果为：

经连续7代回交转育后的宽柄不育株系，其在叶形、叶缘、中脉颜色、叶片剌毛蜡粉、单株有效叶片数等方面，与对应的保持系表现相同或相近。但在株高、开展度、单株鲜重、中肋宽及厚度等方面，与对应的保持系有较大的差异。即：不育系比对应保持系的植株高2-4cm，开展度大4-9cm，单株鲜重较保持系重100-300g等。同时，不育系的营养生长期比保持系要长3-5天。

2014年3-5月，在继续进行宽柄芥不育系回交转育的同时，对不育系和相应保持系的花器官形态特征、开花特性及花期变化进行了系统的观察。

(1)不育系的花器官特征

保持系的花冠由4个花瓣组成，呈十字形，黄色或浅黄色，雄蕊6枚、4强2弱；雌蕊单生，柱头表面多乳突，花药和花丝的长度稍大于花柱的长度，花药较饱满；蜜腺发育良好，3-4个，圆形，绿色或浅绿色，个别深绿色经连续回交7代转育的宽柄芥不育系花与对应的保持系相比较，有其形态特征和结构上的差别：不育系花冠盛花时花瓣表现为半开或全开，呈不规则的十字状；每朵花雄蕊5-6枚，但花药干瘪、纤瘦、有棱或多棱；花丝比保持系短0.87-1.45mm；雌蕊单生，柱头表面多乳突，子房外观形态和大小与保持系基本相同；蜜腺发育良，与对应的保持系没有明显差异。

(2)不育系的开花特点

经连续7代回交转育的宽柄芥不育系，几乎每朵花的柱头，在花蕾成熟之前就伸出蕾外达2.1-3.1mm，形成特殊的“花柱异长期”，此时人工授以正常的芥菜类花粉能够正常结实结籽，平均结实率达90％以上。柱头外露2～3d(天)后，花瓣才全展开或半展开，呈不规则的十字形，再经2～3d(天)花瓣脱落，柱头表面变黑。而对应的保持系花蕾没有异长期，每个花蕾从萼片开裂到花瓣展开仅3～4h(小时)就呈十字形，再经1-2d(天)后花瓣脱落。其它诸如植株的开花顺序、每天的开花时间等，不育系与对应的保持系没有明显的差别。

(3)不育系的花期

经连续7代回交转育的宽柄芥不育系的始花期与对应的保持系相比，一般推迟2～3d(天)，盛花期和终花期相应推迟3～5d(天)，整个花期持续20-27d(天)，长的达29d(天)以上，即不育系的花期比保持系要长5-6d(天)。

宽柄芥胞质雄性不育系的育性

(1)雄蕊的育性

①自然生态气候条件下的育性：2011～2015年，在对宽柄芥雄性不育株系的每个世代进行回交转育的同时，对中选单株进行了套袋自交测定，除个别材料的回交世代株系发现有单株自交结实指数≥1(已陶汰)以外，未发现有自交结实现象。2014～2015年，又对经回交六代后的“DJA、K6A、HK-1A、K46A”等不育系及对应保持系单株自交结实情况进行了系统考查，4个不育株系无论是春季还是夏季的自交结实指数均为“0”，表现为高度的不育且育性非常稳定；而保持系在不同的季节结实率差异较大，一般是春季结实高于夏季结实，这可能与夏季气温较高、植株营养体小有关。

②不育系花粉的生活力：2014年3月，对“DJA、K6A、HK-1A、HK-2A K46A、BKA”等6个不育系及对应的保持系的花粉粒进行了“TTC”染色镜检观察。结果为：不育系的花粉粒均不着色，且多数花粉粒呈不规则圆球形、透明，部分花粉粒还有开裂、缺失现象，花粉粒边沿呈乳突状；而保持系的花粉粒着色率为85-96％，表现为有生活力的花粉占绝大多数，花粉粒的形状多为圆球形或椭圆形，不透明、饱满。

(2)雌蕊的育性

2011～2015年，每个世代的回交转育结果表明，宽柄芥不育系(或不育单株)的雌蕊柱头在人工授粉后，不但能结实结籽，而且后代生长发育正常，不存在生殖隔离。同时，观察不育系雌蕊的形态特征，均未发现与对应的保持系(或回交父本材料)有质的差异。由此证明，宽柄芥雄性不育系的雌蕊育性是完全正常的。

S6、选取经回交七代转育且植株形态特征及性状表现稳定的各不育系及对应保持系的幼嫩叶片组织进行了不育系SSR分子标记鉴定。即：选用十字花科芸薹属网公布的600对SSR引物序列(由生工生物工程有限公司代理合成)，采用CTAB法提取全基因组DNA，并分别进行PCR反应、电泳及银染等。具体为：

2016年1-4月，对培育出的宽柄芥雄性不育系及保持系6个(DJA和DJB、K6A和K6B、HK-1A和HK-1B、K46A和K46B、HK-2A和HK-2B、BKA和BKB)，选用十字花科芸薹属网公布的600对SSR引物序列，在重庆市渝东南农业科学院，进行了SSR分子标记筛选鉴定，结果如图2所示，图中，1-2为不育源JL154；3-5为DJA-1-DJA-3；6-8为K46A-1-K46A-3；9-10为保持系DJ和K46；11-13为K6A-1--K6A-3；14-15为BKA-1-BKA-2；16-17为HK-1A和HK-2A；18-21为保持系K6、BK、HK-1、HK-2；22为Maker。

引物“KBJ416”在不育系及保持系中扩增出的条带呈多态性。其中，泳道1为引物KBJ416在茎瘤芥不育系JL154-5A(宽柄芥不育源上)所扩增出的条带；泳道2-8、11-17为引物“KBJ416”在不同宽柄芥不育系上扩增出的条带；泳道9-10、18-21为引物“KBJ416”在宽柄芥保持系上扩增出的条带。同时，带型分析表明，引物“KBJ416”在不育源和经连续回交转育的不同宽柄芥胞质雄性不育系上扩增的条带完全一致，而与对应的宽柄芥保持系扩增出的带型表现有显著的差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。