一种三系不育系抗螟杂交水稻的选育方法与流程

本发明属于杂交水稻育种领域，具体涉及一种三系不育系抗螟杂交水稻的选育方法。

背景技术：

水稻是中国最重要的粮食作物之一，我国是杂交稻生产大国，每年的水稻种植面积约占农作物种植面积的近1/3，产量占粮食总产量的40％左右。

水稻也是虫害最多的粮食作物之一，田间虫害种类达624种以上，鳞翅目害虫二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等一直是水稻生产的主要害虫，螟虫在我国每年危害面积达1000万公顷，每年仅螟虫造成的产量损失多达1.0×10¹³kg。长期以来，我国主要是通过化学农药防治螟虫，不但增加水稻生产成本，而且造成了环境污染、农药残留等问题。

现有技术中的非转基因三系杂交稻不育系和恢复系都不具备抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的能力，由它们所配置的杂交稻也都不抗螟虫性能，农民主要通过使用大量农药来防止虫害，而大量农药的使用不仅导致水稻生产成本提高，影响稻米品质，而且加大了环境污染，严重影响人民健康。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种三系不育系抗螟杂交水稻的选育方法，把抗螟虫基因通过杂交及回交育种方法快速、稳定地导入三系不育系中，育成遗传背景与保持系完全相同的抗螟水稻三系不育系，与育成的不育系配置的三系杂交组合抗性好，每亩产量可增16.2-39.7％，后代都具有抗虫性。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种三系不育系抗螟杂交水稻的选育方法，包括如下步骤：

1)以携带抗螟基因Cry1Ac1的抗螟水稻保持系为轮回亲本，与粳稻不育系进行连续成对回交5-7代，利用转基因检测试纸检测抗螟基因的蛋白表达，结合田间螟虫抗性测定，筛选出不育性稳定、柱头外露率高的、且导入抗螟虫基因的抗螟虫不育系；

2)以步骤1)获得的抗螟虫不育系为母本，以高配合力的恢复系为父本，进行杂交，获得高产、抗螟虫、米质优的抗螟杂交水稻。

进一步，步骤1)所述的抗螟水稻保持系携带Cry1Ac1基因，优选‘秀水134Bt’，步骤1)所述的粳稻不育系具有产量高、柱头外露率高的特点。

又，步骤2)中所述的转基因检测试纸条为Cry1Ab/Cry1Ac基因的检测试纸条。

进一步，步骤2)中的恢复系为R7、R8、R64、R248、R250或R251。

本发明中的水稻品系‘秀水134Bt’是利用农杆菌介导的遗传转化方法，将人工改造后的cry1Ac1基因导入高产优质粳稻品种‘秀水134’中，通过分子手段筛选出具有cry1Ac1转录活性的单拷贝的、整合了完整目的基因且T-DNA插入位点未打断已知功能基因的独立转化体，并通过后代自交分离筛选获得纯系。

本发明中的水稻品系‘银玉A’为优质粳稻不育系，具有柱头外露率高、农艺性状优良以及米质优等特点。

本发明利用携带抗螟基因cry1Ac1(GenBank accession no.AY126450)的保持系与不育系进行回交，将抗螟虫基因导入三系不育系中，育成遗传背景与保持系完全相同的三系不育系，期间，采用转基因检测试纸条检测目标基因的表达产物，结合田间抗螟虫表观特征，筛选出选出农艺性状与保持系亲本基本一致，同时具有抗螟基因的不育系，再以该不育系为母本，以强优恢复系为父本，杂交后得到抗螟杂交水稻，该抗螟杂交水稻可抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟，具有高产、优质、抗螟虫的优点，本发明节省了成本，提高了杂交稻产量，减少了化学农药的使用，是当前解决杂交稻螟虫危害的最有效方法之一，是保证高产稳产的一个重要途径。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明把抗螟虫基因通过杂交及回交育种方法导入三系不育系中，育成遗传背景与保持系完全相同的三系不育系，选育过程中利用转基因检测试纸条和田间抗螟虫相结合进行筛选，检测快速、准确，省时省力，选择高配合力的恢复系R7、R8、R64、R248、R250、R251为父本分别与本发明选育的抗螟虫不育系配置，得到的三系杂交水稻组合抗虫性好，可抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等，亩产量增加16.2-39.7％。

附图说明

图1为本发明实施例中的134BtA不育系抗螟虫蛋白检测结果。

图2-图7为本发明实施例中134BtA不育系与不同恢复系测交得到的精米外观品质图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明实施例中的转基因表达产物的蛋白检测试纸条为上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Cry1Ac转基因检测试纸条。

实施例

1.抗螟虫不育系的选育

用携带抗螟基因Cry1Ac1的粳稻保持系‘秀水134Bt’与优质粳稻不育系A杂交，以秀水134Bt为轮回亲本，与优质粳稻不育系‘银玉A’连续回交6代，采用Cry1Ab/Cry1Ac转基因检测试纸条快速检测及田间螟虫抗性测定，筛选得到抗螟虫的不育系134BtA。

其中，应用Cry1Ab/Cry1Ac转基因检测试纸条检测抗螟虫蛋白，基于双抗体夹心免疫层析的原理，待检测样本中的抗原在侧向移动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体1结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动，与NC膜检测线上的特异性单克隆抗体2结合，形成双抗夹心复合物，如果待检测样本中转基因蛋白占可溶性蛋白的含量大于1％，检测线显红色，结果为阳性；反之，检测线不显色，结果为阴性。

水稻叶片中的蛋白质抽提和试纸条检测步骤严格按照说明书中描述的步骤进行，检测步骤如下：

a)准备待测样品：取水稻叶片0.1g于1.5ml，捣碎，加入0.2ml PBS缓冲液，盖好盖子，振荡提取管20-30s，确保样品与缓冲液充分混匀，快速离心10s；

b)快速检测：将试纸条取出，直接插入待测样品中，开始计时，10-15分钟后读取数据。

结果分析：若质控线未出现，则检测结果判定为无效；若有质控线，又有检测线，则为阳性；若有质控线，没有检测线，则判定为阴性，蛋白检测结果见图1，其中，‘秀水134Bt’为阳性对照，CK是非转基因一般常规水稻作为阴性对照，134BtA为本发明筛选获得的抗螟虫不育系杂交水稻。

从图1可以看出，本发明所获得的转基因抗螟虫不育系134BtA可以明显检测到Bt抗螟虫蛋白的表达。

2.配置抗螟杂交水稻

以步骤1获得的不育系134BtA为母本，分别以现有的6个高配合力的强优恢复系R7、R8、R64、R248、R250和R251为父本，测交组配，筛选出6个高产、优质、抗螟虫的强优质抗螟虫杂交组合。

对获得的6个测交组合的田间农艺性状及螟虫抗性进行调查，以秀水134Bt为对照组，对田间农艺性状的进行调查时，每组调查3个重复，每个重复调查10株；田间抗虫性调查以稻纵卷叶螟危害情况为准，叶片上有昆虫啃噬的白色条斑，或者有明显的纵向卷叶、叶缘有白丝、卷叶地步有白色条斑的植株视为稻纵卷叶螟受害株，各测交组合的农艺性状及虫害率调查结果见表1，各杂交组合稻米的精米外观品质见图2-图7。

由表1可以看出，利用现有的强恢复系品系R7、R8、R64、R248、R250、R251分别与选育的134BtA配置杂交组合，抗虫性好，虫害株率均为0％，测交的各组合单株重量比对照组134Bt提高16.2-39.7％，而株高、分蘖数、结实率、糙米率和精米率等性状差异不显著。

稻米外观品质是指米粒的性状、大小、透明度和垩白(又称心白、腹白)大小等，强恢复系品系R7、R8、R64、R248、R250、R251分别与选育的134BtA配置杂交组合的外观分别参见图2-7。由图2-7可以看出，以恢复系R251为父本，与选育的抗螟虫不育系134BtA配组得到的杂交组合米粒透明、垩白粒率和垩白度最低，因此，综合田间农艺性状及外观品质，以恢复系R251为父本与134BtA选配的杂交组合最好，与对照组相比，增产约39.7％，命名为‘沪克螟1号’。