本发明属于小麦单倍体育种技术领域，具体涉及一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法。
背景技术：
小麦玉米杂交诱导小麦单倍体技术，通过国内20多年的研究，已成为产生小麦单倍体效率较高的途径。单倍体技术育种可缩短育种年限，提高育种效率。小麦单倍体在筛选基因突变体、基因功能研究等方面具有重要应用价值，加倍单倍体在基因定位、构建连锁遗传图谱、固定杂种优势、加速小麦育种进程等方面具有重要应用价值。
小麦玉米杂交产生的小麦单倍体试管苗形成于大田小麦的成熟期（5月中下旬），之后外界温度越来越高，不利于单倍体苗的移栽和育种实践。室内单倍体试管苗的培养，小麦玉米杂交产生的小麦单倍体胚萌发成的试管苗长至2-3片叶、3-5 cm高时，转入温度、光照强度、光照时长可设定和调节的壮苗用培养箱进行壮苗培养；培养至2-3个分蘖时，转入温度、光照强度、光照时长可设定和调节的其它培养箱进行3-4个月甚至更长时间的越夏培养；田间气温降至15℃以下时，越夏培养的试管苗经移栽前锻炼后移栽到露地栽培管理，这种培养方式一般要经历繁琐的继代转瓶培养、越夏培养，直至移栽到田间，历时3-4个月甚至更长时间，期间容易因操作不当导致试管苗黄叶、污染、停止生长和分蘖甚至死亡，影响单倍体苗的移栽成活和加倍效率，影响单倍体技术的育种应用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，通过对试管苗采取营养补给的方法，让单倍体苗移栽前一步成苗，形成壮苗，不需要经过继代转瓶培养。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，所述方法包括以下步骤：
（1）当小麦单倍体胚生试管苗长至2-3片叶、有根时，转入温度、光照强度、光照时长可设定的壮苗用培养箱进行壮苗预培养；
（2）壮苗用培养箱中50%的试管苗达到三叶期时，将达到三叶期的试管苗转移至壮苗培养基中，培养瓶灼烧后封口，置于壮苗用培养箱内进行壮苗培养；
（3）壮苗培养2-3周后，向培养瓶中无菌添加1号营养补给液，培养瓶灼烧后封口，置于壮苗用培养箱内继续进行壮苗培养，以后每隔2周向培养瓶内添加与1号营养补给液体积相同的2号营养补给液；
（4）试管苗产生2-3个分蘖时，转入温度、光照强度、光照时长可调节的越夏用培养箱进行越夏培养，每2周向培养瓶内无菌添加2号营养补给液；
（5）10月下旬到11月上旬，将试管苗的培养箱培养条件恢复至壮苗用培养箱的培养条件，并准备试管苗移栽用地；
（6）移栽用地准备好后，田间气温降至15℃以下时，试管苗进行移栽前炼苗，每天向培养瓶内无菌添加2次2号营养补给液；
（7）炼苗2-3天后，以2号营养补给液做为移栽定根水，进行试管苗的露地移栽；
其中，1号营养补给液的配置方法为：将硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾用水溶解，加入用95%乙醇溶解的多效唑，其中，硝酸铵 1650 mg/L、硝酸钾1900 mg/L、磷酸二氢钾 170 mg/L、多效唑0.5 mg/L，调节pH值至5.6-5.8，灭菌，4℃下保存期限为2周；
2号营养补给液的配置方法为：将硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾用水溶解，其中，硝酸铵 1650 mg/L、硝酸钾1900 mg/L、磷酸二氢钾 170 mg/L，调节pH值至5.6-5.8，灭菌，4℃下保存期限为2周；
壮苗培养基的配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、MS有机物质、多效唑0.5 mg/L、蔗糖30g/L，琼脂6.5 g/L，pH值5.6-5.8，灭菌，4℃下保存期限为1周。
优选地，上述壮苗用培养箱的培养条件为：13-14℃、11h光照和13h黑暗，其中11h的光照强度为2000-3000lx。
优选地，上述步骤（3）中1号营养补给液的加入的体积为步骤（2）壮苗培养基体积的0.25倍。
优选地，上述越夏用培养箱的培养条件为：4-7℃、10h光照和14h黑暗，其中10h的光照强度为2000-3000lx。
优选地，上述步骤（4）中2号营养补给液加入的体积与步骤（3）相同。
优选地，上述移栽炼苗的具体操作为：将培养瓶移到培养架上，在20℃、12h光照度为5000-10000 lx的光照和12h黑暗的条件下，敞开培养瓶的瓶口进行移栽炼苗，同时在培养架隔板间喷雾以增加瓶口周围湿度。
优选地，上述步骤（6）中2号营养补给液的加入量为步骤（4）中2号营养补给液加入量的20%，每天向培养瓶内无菌添加2次2号营养补给液的时间分别为上午9时和下午17时。
优选地，无菌添加1号营养补给液或2号营养补给液的具体操作为：在无菌条件下，将培养瓶的瓶口敞开，用无菌移液管转移1号或2号营养补给液至培养瓶内，灼烧瓶口，然后封口。
优选地，试管苗移栽用地，要求畦宽1.4-1.6m，高畦，精耕细作，使土壤疏松通透，土壤颗粒小，无石块儿。
优选地，营养补给液配置过程中溶解用的水为经硼硅酸玻璃蒸馏过的水。
本发明的优点：
本发明提供了一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，通过在不同培养阶段添加营养补给液的方式，实现了小麦单倍体胚生试管苗一步形成壮苗，简单有效地缓解了试管苗的越夏衰亡，使试管苗的存活率提高10-17%，增加了试管苗出瓶移植的成功率，间接提高了单倍体苗的加倍效率，对于不具备人工气候室实施同年加代收种的小麦单倍体育种实验室来说，是一种省时省力、简便可行、节约成本的方法，是小麦玉米杂交诱导小麦单倍体技术应用于小麦育种的关键环节之一，有利于小麦单倍体技术的育种应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1号营养补给液、2号营养补给液和壮苗培养基的配置
1、1号营养补给液的配置方法为：将硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾用水溶解，加入用95%乙醇溶解的多效唑，其中，硝酸铵 1650 mg/L、硝酸钾1900 mg/L、磷酸二氢钾 170 mg/L、多效唑0.5 mg/L，调节pH值至5.6-5.8，灭菌，4℃下保存期限为2周；
2、2号营养补给液的配置方法为：将硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾用水溶解，其中，硝酸铵 1650 mg/L、硝酸钾1900 mg/L、磷酸二氢钾 170 mg/L，调节pH值至5.6-5.8，灭菌，4℃下保存期限为2周；
3、壮苗培养基的配制：
（1）配制壮苗培养基母液：采用现有技术配置壮苗培养基母液，包括MS培养基的大量元素20倍母液、MS培养基微量元素100倍母液、MS培养基铁盐100倍母液、MS培养基有机物质20倍母液、多效唑100倍母液，置于4℃冰箱保存。其中大量元素20倍母液，包括NH4NO3 33000 mg/L，KNO3 38000 mg/L、CaCl2·2H2O 8800 mg/L、MgSO4·7H2O 7400 mg/L、KH2PO4 3400 mg/L；微量元素100倍母液，包括MnSO4·4H2O 2230mg/L、ZnSO4·7H2O 860 mg/L、H3BO3 620 mg/L、KI 83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 25 mg/L、CuSO4·5H2O 25 mg/L、CoCl2·6H2O 25 mg/L；铁盐100倍母液，包括Na2·EDTA 3730 mg/L、FeSO4·7H2O 2780 mg/L；有机物质20倍母液，包括甘氨酸40 mg/L、肌醇2000 mg/L、盐酸硫胺素8 mg/L、盐酸吡哆醇 10 mg/L、烟酸10 mg/L；多效唑100倍母液，浓度为50 mg/L。
（2）配制壮苗培养基。在煮制培养基的容器中加入经硼硅酸玻璃蒸馏过的水，依次加入一定体积的壮苗培养基母液，包括大量元素、微量元素、铁盐、有机物质（甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇）母液，加热；加入一定量的蔗糖和琼脂，至琼脂完全熔化后加水定容至所需体积，加入多效唑母液，搅拌均匀后调节培养基pH值至5.6-5.8，分装后封瓶口，高温高压灭菌，取出置于无菌接种室中待用；
配置的壮苗培养基的配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、MS有机物质、多效唑0.5 mg/L、蔗糖30g/L，琼脂6.5 g/L，pH值5.6-5.8。MS大量元素，包括NH4NO3 1650 mg/L，KNO31900 mg/L、CaCl2·2H2O 440 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4 170 mg/L； MS微量元素，包括MnSO4·4H2O 22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、KI 0.83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L； MS铁盐，包括Na2·EDTA 37.3 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L；MS有机物质，包括甘氨酸2 mg/L、肌醇100 mg/L、盐酸硫胺素0.4 mg/L、盐酸吡哆醇 0.5 mg/L、烟酸0.5 mg/L；多效唑0.5 mg/L。
实施例2
本实施例作为对比例，不使用实施例1制备的1号营养补给液、2号营养补给液；壮苗培养基采用MS基础培养基，即除了不添加多效唑外，其他成分及含量同实施例1制备的壮苗培养基。
1. 准备工作：小麦单倍体胚生试管苗的准备
（1）进行小麦远杂单倍体幼胚的接种试验，历时1个月，在无菌条件下共拯救幼胚1200个；
（2）将接种后的幼胚置组培间培养架上，在20-22℃、12h 5000 lx光照和12h黑暗的条件下培养；每2-3天定时逐瓶查看，捡出萌发出芽的小麦单倍体胚生试管苗，归置于培养架的成苗区域。
2. 一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，具体方法如下：
（1）2014年5月4日至6月24日，根据试管苗的茎叶和根部发育不同程度，将培养架的成苗区域内长有2-3片叶、有根的小麦单倍体胚生试管苗，转入壮苗用培养箱中做壮苗预培养：壮苗用培养箱的培养条件为13℃、11h光照和13h黑暗，其中11h的光照强度为2000lx；5月4日至5月29日，共有180瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。5月30日至6月24日，共有195瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。
（2）壮苗用培养箱中有50%试管苗达到三叶期，将达到三叶期的试管苗转移到新鲜的MS基础培养基上，方法为：将合乎规格的试管苗置于超净工作台上，无菌条件下，用消过毒的镊子从原瓶中取出试管苗，植入配置待用的新鲜的MS基础培养基上，迅速灼烧瓶口，并用透气封瓶膜封住瓶口，线绳扎住，置于壮苗用培养箱中继续壮苗培养，促发分蘖；剩余的预培养试管苗分别在第3片绿叶伸出2cm时，分批次更换至新鲜的MS基础培养基上，置壮苗用培养箱中继续壮苗培养；
（3）6月20日，当首批试管苗产生2-3个分蘖时，将产生2-3个分蘖的试管苗转入光照时长可调节的越夏用培养箱中进行越夏培养，越夏用培养箱的培养条件为4℃、10h光照和14h黑暗，其中10h的光照强度为2000lx；对剩余试管苗采取相同的方法继代转接和培养；以后每3周转接单倍体苗到新鲜MS培养基上，再置越夏用培养箱继续越夏培养。
（4）10月26日，调节越夏用培养箱的培养条件至壮苗用培养箱的培养条件，使越夏中的试管苗恢复分蘖生长状态；在秋播整地的基础上，准备单倍体苗移栽用地，要求畦宽1.4-1.6m，高畦，精耕细作，使土壤疏松通透，土壤颗粒小，无石块儿；
（5）11月4日、5日，田间气温已降至15℃以下，将试管苗转移到培养架上，共284瓶，在20℃、12h光照度为10000 lx的光照和12h黑暗的条件下，敞开培养瓶的瓶口进行移栽前炼苗，每天上午9时和下午5时分别向瓶内加入2 mL 无菌水，并在培养架隔板间喷雾增加瓶口周围湿度，增强试管苗移植后对外界环境的适应能力；
（6）炼苗3天后，以无菌水做为移栽定根水，将培养架上经炼苗的284瓶试管苗进行露地移栽，栽后覆膜、覆遮阳网，保湿遮荫，半月后移除覆盖物、及时剪除少数抽穗、拔节的分蘖，促发新蘖；
小麦单倍体胚经组织培养共得到单倍体试管苗375株，萌发成苗率为31.25%；移栽前炼苗284株，试管苗存活率75.73%；移栽后统计成活的小麦单倍体植株共计195株，移栽成活率为68.66%。加倍后再次移栽大田，统计加倍后成活的小麦植株共计139株，加倍成活率为63.18%。收获DH系种子128份，加倍效率58.18%。
实施例3
本实施例中使用实施例1制备的1号营养补给液、2号营养补给液和壮苗培养基。
1. 准备工作：小麦单倍体胚生试管苗的准备
（1）进行小麦远杂单倍体幼胚的接种试验，历时1个月，在无菌条件下共拯救幼胚1600个；
（3）将接种后的幼胚置组培间培养架上，在20-22℃、12h 5000 lx光照和12h黑暗的条件下培养；每2-3天定时逐瓶查看，捡出萌发出芽的小麦单倍体胚生试管苗，归置于培养架的成苗区域。
2. 一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，具体方法如下：
（1）2014年5月4日至6月24日，根据试管苗的茎叶和根部发育不同程度，将培养架的成苗区域内长有2-3片叶、有根的小麦单倍体胚生试管苗，转入壮苗用培养箱中做壮苗预培养：壮苗用培养箱的培养条件为13℃、11h光照和13h黑暗，其中11h的光照强度为2000lx；5月4日至5月29日，共有217瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。5月30日至6月24日，共有283瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。
（2）壮苗用培养箱中有50%试管苗达到三叶期，将达到三叶期的试管苗转移到壮苗培养基上，方法为：将合乎规格的试管苗置于超净工作台上，无菌条件下，用消过毒的镊子从原瓶中取出试管苗，植入配置待用的壮苗培养基中，迅速灼烧瓶口，并用透气封瓶膜封住瓶口，线绳扎住，置于壮苗用培养箱中继续壮苗培养，促发分蘖；剩余的预培养试管苗分别在第3片绿叶伸出2cm时，分批次更换至壮苗培养基上，置壮苗用培养箱中继续壮苗培养；
（3）试管苗更换至壮苗培养基培养2-3周后，向培养瓶中无菌添加无菌1号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，灼烧瓶口然后封口，再次放回原壮苗用培养箱中培养；以后每隔2周向培养瓶内无菌添加无菌2号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，每次添加后，灼烧瓶口然后封口，再次放回原壮苗用培养箱中培养，直至产生2-3个分蘖；
（4）6月20日，当首批试管苗产生2-3个分蘖时，将产生2-3个分蘖的试管苗转入光照时长可调节的越夏用培养箱中进行越夏培养，越夏用培养箱的培养条件为4℃、10h光照和14h黑暗，其中10h的光照强度为2000lx，每2周向培养瓶内无菌添加无菌2号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，每次添加后，灼烧瓶口然后封口，再次越夏用培养箱中继续培养；
（5）10月26日，调节越夏用培养箱的培养条件至壮苗用培养箱的培养条件，使越夏中的试管苗恢复分蘖生长状态；在秋播整地的基础上，准备单倍体苗移栽用地，要求畦宽1.4 -1.6m，高畦，精耕细作，使土壤疏松通透，土壤颗粒小，无石块儿；
（6）11月4日、5日，田间气温已降至15℃以下，将试管苗转移到培养架上，将培养瓶移到培养架上，在20℃、12h光照度为10000 lx的光照和12h黑暗的条件下，敞开培养瓶的瓶口进行移栽炼苗，每天上午9时和下午17时分别向瓶内加入2号营养补给液，2号营养补给液的添加量为步骤（4）中2号营养补给液加入量的20%，并在培养架隔板间喷雾增加瓶口周围湿度，增强试管苗移植后对外界环境的适应能力；
（7）炼苗3天后，以2号营养液做为移栽定根水，将培养架上经炼苗的468瓶试管苗进行露地移栽，栽后覆膜、覆遮阳网，保湿遮荫，半月后移除覆盖物、及时剪除少数抽穗、拔节的分蘖，促发新蘖；
小麦单倍体胚生试管苗经组织培养共得到单倍体试管苗500株，萌发成苗率为31.25%；移栽前炼苗468株，试管苗存活率93.60%；移栽后统计成活的小麦单倍体植株共计420株，移栽成活率为89.74%。加倍后再次移栽大田，统计加倍后成活的小麦植株共计370株，加倍成活率为88.09%。收获DH系种子333份，加倍效率79.29%。
实施例4
本实施例中使用实施例1制备的1号营养补给液、2号营养补给液和壮苗培养基。
1. 准备工作：小麦单倍体胚生试管苗的准备
（1）进行小麦远杂单倍体幼胚的接种试验，历时1个月，在无菌条件下共拯救幼胚1000个；
（4）将接种后的幼胚置组培间培养架上，在20-22℃、12h 5000 lx光照和12h黑暗的条件下培养；每2-3天定时逐瓶查看，捡出萌发出芽的小麦单倍体胚生试管苗，归置于培养架的成苗区域。
2. 一种小麦单倍体胚生试管苗的培养方法，具体方法如下：
（1）2015年5月22日至6月26日，根据试管苗的茎叶和根部发育不同程度，将培养架的成苗区域内长有2-3片叶、有根的小麦单倍体胚生试管苗，转入壮苗用培养箱中做壮苗预培养，壮苗用培养箱的培养条件为14℃、11h光照和13h黑暗，其中11h的光照强度为3000lx；5月22日至6月11日，共有184瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。6月15日至6月26日，共有117瓶试管苗转入壮苗用培养箱中。
（2）壮苗用培养箱中有50%试管苗达到三叶期，将达到三叶期的试管苗转移到壮苗培养基上，方法为：将合乎规格的试管苗置于超净工作台上，无菌条件下，用消过毒的镊子从原瓶中取出试管苗，植入配置待用的壮苗培养基中，迅速灼烧瓶口，并用透气封瓶膜封住瓶口，线绳扎住，置于壮苗用培养箱中继续壮苗培养，促发分蘖；剩余的预培养试管苗分别在第3片绿叶伸出2cm时，分批次更换至壮苗培养基上，置壮苗用培养箱中继续壮苗培养；
（3）试管苗更换至壮苗培养基培养2-3周后，向培养瓶中无菌添加无菌1号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，灼烧瓶口然后封口，再次放回原壮苗用培养箱中培养；以后每隔2周向培养瓶内无菌添加无菌2号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，每次添加后，灼烧瓶口然后封口，再次放回原壮苗用培养箱中培养，直至产生2-3个分蘖；
（4）7月17日，当首批试管苗产生2-3个分蘖时，将产生2-3个分蘖的试管苗转入光照时长可调节的越夏用培养箱中进行越夏培养，越夏用培养箱的培养条件为7℃、10h光照和14h黑暗，其中10h的光照强度为3000lx，每2周向培养瓶内无菌添加无菌2号营养补给液，添加量为壮苗培养基体积的0.25倍，每次添加后，灼烧瓶口然后封口，再次越夏用培养箱中继续培养；
（5）11月2日，调节越夏用培养箱的培养条件至壮苗用培养箱的培养条件，使越夏中的试管苗恢复分蘖生长状态；在秋播整地的基础上，准备单倍体苗移栽用地，要求畦宽1.4 -1.6m，高畦，精耕细作，使土壤疏松通透，土壤颗粒小，无石块儿；
（6）11月9日，田间气温已降至15℃以下，将试管苗转移到培养架上，将培养瓶移到培养架上，在20℃、12h光照度为5000lx的光照和12h黑暗的条件下，敞开培养瓶的瓶口进行移栽炼苗，每天上午9时和下午17时分别向瓶内加入2号营养补给液，2号营养补给液的添加量为步骤（4）中2号营养补给液加入量的20%，并在培养架隔板间喷雾增加瓶口周围湿度，增强试管苗移植后对外界环境的适应能力；
（7）炼苗2-3天后，以2号营养液做为移栽定根水，将培养架上经炼苗的301瓶试管苗进行露地移栽，栽后覆膜、覆遮阳网，保湿遮荫，半月后移除覆盖物、及时剪除少数抽穗、拔节的分蘖，促发新蘖；
小麦单倍体胚生试管苗经组织培养共得到单倍体试管苗301株，成苗率为30.1%；移栽前炼苗280株，试管苗存活率93.02%；移栽后统计成活的小麦单倍体植株共计250株，移栽成活率为89.28%。加倍后再次移栽大田，统计加倍后成活的小麦植株共计223株，加倍成活率为89.20%。收获DH系种子198份，加倍效率79.20%。
各实施例的效果比较如下表：
由此可知，在壮苗、越夏、移栽的各个阶段，通过添加营养补给液，可有效提高试管苗的存活率，并在试管内实现壮苗，增加了试管苗出瓶移植的成功率，间接提高了单倍体苗的加倍效率。