本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说涉及一种独角石斛的组织培养方法。
背景技术：
独角石斛(Dendrobium unicum)，兰科石斛属植物。其唇瓣反转似犀牛角，布有橘红色网纹，非常独特。虽然它没有饱满圆整的花型，但是花瓣橙红色与唇瓣上筋状网脉的遗传使得它异军突起，逐渐受到追捧。分布于越南、老挝、缅甸和泰国(海拔800-1550米)，生长于低地森林的岩石和小灌木上。花期春季至初夏，花朵寿命长，可达1个月以上。深受人们的喜爱。迄今为止，未见独角石斛组织培养的报道。
然而由于兰科种子自然繁殖主要靠分株繁殖，在野外本就很难发芽，而随着社会的发展，人们过度的采摘使得野生的独角石斛资源大多遭到破坏，几近灭绝，因此寻找一种组织培养的方法培养独角石斛，使独角石斛快速繁殖，实现独角石斛优质种苗的工厂化育苗，满足人们的需求，成为亟待人们解决的问题。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种独角石斛的组织培养方法，能保持原有品种的优良性状，在短时间内培育出大量适合栽培种植的独角石斛幼苗，单芽增殖系数达20-30倍以上，且试管苗丛生芽健壮，在生根培养基中容易生根，移栽基质后成活率在90％以上。
本发明提供的技术方案如下：
一种独角石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取独角石斛的果荚进行消毒和预处理，先用体积分数为2％的洗洁精水溶液浸泡5min后，用流水冲洗15-30min，然后将独角石斛的果荚灼烧2次，每次灼烧5-10s后，得到外植体；
(2)将所述外植体切开，取出种子后接种到第一培养基中，在第一培养基中培养20-30天，得到无菌试管苗；
(3)将所述无菌试管苗置于第二培养基中，在第二培养基中培养50～70天，得到试管苗丛生芽；
(4)将所述试管苗丛生芽置于壮苗培养基中，在壮苗培养基中培养20-40天，得到试管苗；
(5)将所述试管苗置于生根培养基中，在生根培养基中培养30-50天，得到组培苗；
(6)炼苗：将所述组培苗和培养所述组培苗的培养瓶一起移出培养室，打开培养瓶瓶盖，向培养瓶中加入30mL的自来水后，自然光照3-5d；
(7)炼苗结束后，从培养瓶中取出所述组培苗，将所述组培苗的根部洗净后移栽至基质中。
作为优选，步骤(1)中将独角石斛的果荚灼烧2次的具体方法为：在无菌超净台内将独角石斛的果荚用无菌镊夹住，在整个果荚表面沾染体积分数为75％的酒精，然后灼烧，将酒精烧尽后再重复灼烧1次。
作为优选，步骤(2)中所述的第一培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄基氨嘌呤、2.0mg/L的萘乙酸和3g/L的活性炭。
作为优选，步骤(3)中所述的第二培养基中包括：MS、0.5-2.0mg/L的甲巯达嗪、0.5-1.5mg/L的萘乙酸和0.2-0.5mg/L的激动素。
作为优选，步骤(4)中所述的壮苗培养基中包括：MS、1.0-4.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和1.0-4.0mg/L的萘乙酸。
作为优选，步骤(5)中所述的生根培养基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述的土豆泥为将土豆搅碎后得到。
作为优选，所述的第一培养基、所述的第二培养基、所述的壮苗培养基以及所述的生根培养基中还含有5g/L的琼脂和30g/L蔗糖，且所述第一培养基、所述第二培养基、所述壮苗培养基以及所述生根培养基的初始pH值均为5.8。
作为优选，步骤(2)-(5)中的培养均为控制光照培养条件为：培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d。
作为优选，步骤(7)中所述的基质中树皮、腐殖质土与水苔的体积比为1:1:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法采用生物技术对独角石斛进行组织培养快速繁殖，保持了原有品种的优良性状，能够在短时间内培育出大量适合栽培种植的独角石斛幼苗，且培养的独角石斛种苗质量好，能够实现规模化生产，满足生产上的需要。本发明中单芽增殖系数达20-30倍以上，且试管苗丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，移栽基质后成活率在90％以上。
(2)本发明的方法中以灼烧的方式对外植体进行灭菌，与传统的采用升汞灭菌方式相比，既避免了二次污染，又无毒害更环保。
(3)本发明的方法中萌发实验的第一培养基中添加活性炭，使得第一培养基中的环境模仿黑暗培养，更有利于种胚发芽。生根培养基中加入打碎的土豆泥，土豆泥中含有丰富的碳水化合物、蛋白质，还有丰富的钾、钙、磷、铁及维生素A，B和C等，既能提供生根所需的营养物质，且B12维生素能促进生根，有利于组培苗生根。
(4)独角石斛的果荚中含有丰富的碳水化合物、氨基酸、蛋白质，还有丰富的钾、钙、磷、铁、镁等以及多种微量元素，在第一培养基中添加果荚碎，独角石斛果荚粉碎后和燕麦中的营养物质相互互补，共同为胚乳提供营养物质，促进种子发芽。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1：
一种独角石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取独角石斛的果荚进行消毒和预处理，用体积分数为2％的洗洁精水溶液浸泡5min后，用流水冲洗15min，然后将独角石斛的果荚灼烧2次，每次灼烧5s后，得到外植体；
(2)将所述外植体切开，取出种子后接种到第一培养基中，在所述第一培养基中培养30天，得到无菌试管苗；所述第一培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)将所述无菌试管苗置于第二培养基中，在所述第二培养基中培养30天，得到试管苗丛生芽；所述第二培养基中包括：MS、1.0mg/L的甲巯达嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激动素；
(4)将所述试管苗丛生芽置于壮苗培养基中，在所述壮苗培养基中培养30天，得到试管苗；所述壮苗培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)将所述试管苗置于生根培养基中，在所述生根培养基中培养30天，得到完整组培苗；所述生根培养基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥为将土豆搅碎后得到；
(6)炼苗，炼苗的具体方法为：将所述组培苗和培养所述组培苗的培养瓶一起移出培养室，打开培养瓶瓶盖，向培养瓶中加入30mL的自来水后，自然光照3d；
(7)炼苗结束后，从培养瓶中取出所述组培苗，将所述组培苗的根部洗净后移栽至基质中，所述基质中树皮、腐殖质土与水苔的体积比为1:1:1；
所述的第一培养基、所述的第二培养基、所述的壮苗培养基以及所述的生根培养基中还含有5g/L的琼脂和30g/L蔗糖，且所述第一培养基、所述第二培养基、所述壮苗培养基以及所述生根培养基的初始pH值均为5.8；
步骤(2)-(5)中的培养均为控制光照培养条件为：培养温度23℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d。
实施例2：
一种独角石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取独角石斛的果荚进行消毒和预处理，用体积分数为2％的洗洁精水溶液浸泡5min后，用流水冲洗30min，然后将独角石斛的果荚灼烧2次，每次灼烧10s后，得到外植体；
(2)将所述外植体切开，取出种子后接种到第一培养基中，在所述第一培养基中培养30天，得到无菌试管苗；所述第一培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)将所述无菌试管苗置于第二培养基中，在所述第二培养基中培养30天，得到试管苗丛生芽；所述第二培养基中包括：MS、1.5mg/L的甲巯达嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激动素；
(4)将所述试管苗丛生芽置于壮苗培养基中，在所述壮苗培养基中培养30天，得到试管苗；所述壮苗培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)将所述试管苗置于生根培养基中，在所述生根培养基中培养30天，得到完整组培苗；所述生根培养基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥为将土豆搅碎后得到；
(6)炼苗，炼苗的具体方法为：将所述组培苗和培养所述组培苗的培养瓶一起移出培养室，打开培养瓶瓶盖，向培养瓶中加入30mL的自来水后，自然光照5d；
(7)炼苗结束后，从培养瓶中取出所述组培苗，将所述组培苗的根部洗净后移栽至基质中，所述基质中树皮、腐殖质土与水苔的体积比为1:1:1；
所述的第一培养基、所述的第二培养基、所述的壮苗培养基以及所述的生根培养基中还含有5g/L的琼脂和30g/L蔗糖，且所述第一培养基、所述第二培养基、所述壮苗培养基以及所述生根培养基的初始pH值均为5.8；
步骤(2)-(5)中的培养均为控制光照培养条件为：培养温度27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d。
实施例3：
一种独角石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取独角石斛的果荚进行消毒和预处理，用体积分数为2％的洗洁精水溶液浸泡5min后，用流水冲洗20min，然后将独角石斛的果荚灼烧2次，每次灼烧8s后，得到外植体；
(2)将所述外植体切开，取出种子后接种到第一培养基中，在所述第一培养基中培养30天后得到无菌试管苗；所述第一培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄基氨嘌呤和2.0mg/L的萘乙酸，3g/L的活性炭；
(3)将所述无菌试管苗置于第二培养基中，在所述第二培养基中培养30天，得到试管苗丛生芽；所述第二培养基中包括：MS、2.0mg/L的甲巯达嗪、0.5mg/L的萘乙酸和0.2mg/L的激动素；
(4)将所述试管苗丛生芽置于壮苗培养基中，在所述壮苗培养基中培养30天，得到试管苗；所述壮苗培养基中包括：MS、3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和4.0mg/L的萘乙酸；
(5)将所述试管苗置于生根培养基中，在所述生根培养基中培养30天后得到完整组培苗；所述生根培养基中包括：1/2MS和20g/L的土豆泥，所述土豆泥为将土豆搅碎后得到；
(6)炼苗，炼苗的具体方法为：将所述组培苗和培养所述组培苗的培养瓶一起移出培养室，打开培养瓶瓶盖，向培养瓶中加入30mL的自来水后，自然光照4d；
(7)炼苗结束后，从培养瓶中取出所述组培苗，将所述组培苗的根部洗净后移栽至基质中，所述基质中树皮、腐殖质土与水苔的体积比为1:1:1；
所述的第一培养基、所述的第二培养基、所述的壮苗培养基以及所述的生根培养基中还含有5g/L的琼脂和30g/L蔗糖，且所述第一培养基、所述第二培养基、所述壮苗培养基以及所述生根培养基的初始pH值均为5.8；
步骤(2)-(5)中的培养均为控制光照培养条件为：培养温度25℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d。
对实施例1-3中单芽的繁殖系数及所得的组培苗的移栽成活率进行调查和统计，结果见表1。
表1本发明的方法单芽的繁殖系数及所得的组培苗的移栽成活率测定
由表1可知，本发明的方法中单芽增殖系数可达20-30倍，且试管苗丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，移栽基质后成活率在95％以上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。