一种白木通快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于白木通组织培养领域，具体涉及一种白木通快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002] 白木通[Akebia trifoliata (Thunb. ) Koidz. var. australis (Diels) Rehd.]为木 通科（Lardizabalaceae)木通属（Akebia)的半常绿藤本植物，为三叶木通的变种，主要分 布于江苏、浙江、江西、广西、湖南、湖北、山西、四川等地（蒋岩等2011 ;柳方等2004)。白木 通的根、藤茎、果实均可入药，气微弱，味苦而涩，性微寒，具有利尿、疏肝益肾、清心泻火、 通经散瘀、抗肿瘤之功效（高慧敏等2006)。目前关于白木通研宄主要集中在油的理化特 性、资源分布、外观性质的鉴定、化学成分分析及药理学研宄等方面（李丽等2010 ;黄佩蓓 等2014;王超英等2015)，而对木通属植物育苗的研宄方面还处于起步阶段，雷可（2011) 研宄了扦插季节及茎段处理对白木通成活率的影响，结果表明3月份扦插成活率最高，其 他季节扦插成活率低，不利于白木通的大量繁殖。组织培养是一条快速繁殖植物优良品种 脱毒苗的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。目前，关于木通组织培养的报道仅有沈 国林等（2007)利用三叶木通的叶片、叶柄及茎段诱导愈伤组织，但愈伤组织并未分化出不 定芽，木通带芽茎段在组织培养过程中存在初代培养外植体容易污染，至今通过组织培养 还未培育出脱毒苗，本发明主要从白木通带芽茎段外植体的消毒，继代增殖、壮苗、生根及 移栽炼苗等一系列过程，获得了完整的白木通组培苗，为白木通的工厂化育苗及遗传体系 转化提供可能。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对目前木通外植体灭菌较难，通过组织培养获得再生植株技 术存在不足，在此基础上，利用白木通带芽茎段获得再生植株，该方法通过带芽茎段外植 体灭菌诱导腋芽，诱导率高，增殖效果好，生根率高，为以后工厂化育苗及遗传转化提高 可能性。
[0004] 本发明的目的是通过以下方式实现的。
[0005] 一种白木通快速繁殖的方法，包括以下步骤：
[0006] (1)消毒处理：将白木通当年生半木质化的带芽茎段切成2-3cm带单芽的茎段用 75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5-6次，再用2 %的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6 次；
[0007] (2)腋芽诱导：接种到 WPM+0-2. Omg/L 6-BA+0. 1-1. Omg/L IAA+2. Omg/L GA3的培 养基中诱导腋芽，暗培养后转到光照条件下培养；
[0008] (3)继代增殖：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到WPM+2. 0-3. Omg/L 6-BA+0-0. 5mg/L IBA的培养基中进行腋芽的增殖培养；
[0009] (4)生根培养：将增殖培养获得的健壮幼嫩的苗接到1/2MS+0. 5-2. 0mg/L ΙΒΑ+0. 5-1. 0mg/L NAA+0-1. 0mg/L GA3的培养基中进行生根诱导；
[0010] (5)炼苗、移栽获得完整植株。
[0011] 上述方法中诱导腋芽时暗培养5天后，转到光照条件下培养30-35d。
[0012] 上述方法中继代增殖培养的具体过程如下：腋芽的增殖培养时暗培养l-2d，在光 照条件下培养30-35d。
[0013] 上述方法中生根培养时暗培养5d后转到光照培养下20d。
[0014] 上述方法中培养温度为26 士 1°C，光照培养强度为2100-22001x，光照培养时间 12-14h/d〇
[0015] 上述方法中腋芽诱导的培养基优选为：WPM+1. Omg/L 6-BA+0. 1-1. Omg/L IAA+2. Omg/L GA3或者 WPM+0. 5mg/L IAA+2. Omg/L GA 3。
[0016] 上述方法中继代增殖培养使用的培养基优选为：WPM+2. 0-3. Omg/L 6-BA+O· 1-0. 5mg/L IBA。
[0017] 上述方法中生根培养使用的培养基优选为：1/2MS+1. 0-2. Omg/L IBA+0. 5mg/L NAA+1. Omg/L GA3〇
[0018] 上述方法炼苗、移栽的具体过程如下：
[0019] 将生根后的试管苗先在空气相对湿度为80%以上的人工气候箱中进行移栽前 炼，2-3天后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为泥炭土 ：珍珠 岩：蛭石=2:1:1，用薄膜盖住营养杯口，保持恒定的气候条件，两周后取出薄膜，逐步 进行正常水肥管理。
[0020] 上述方法中用到的培养基除生根培养基外均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至 5. 5-5. 8 ;生根培养基附加蔗糖20g/L，琼脂2. 5g/L。
[0021] 本发明主要以白木通当年生轻度木质化茎段作为外植体，分别从外植体消毒、初 代培养、继代增殖培养、生根、炼苗和移栽等方面进行探索，在初代培养中探索不同消毒试 剂、不同消毒时间对白木通茎段的消毒效果，基本控制了初代培养污染及褐化严重问题， 为白木通初代培养过程中容易污染及防治褐化提供试验依据；在生根培养过程中单独加入 IBA不能使白木通组培苗生根，通过加入NAA与GA^组合大大提高了白木通组培苗的生 根率及长势，形成一套适合白木通组织培养快繁技术体系，为白木通的的工厂化育苗及以 后基因工程改良打下了基础。
[0022] 此外，白木通组织培养的研宄比较少见。已研宄的内容与本发明的区别及优势总 结如下：
[0023] 1、本发明采用的白木通带芽茎段成功的培育出了白木通组培苗，本发明具有生 长周期短，初代培养腋芽诱导效果好，继代增殖及生根率高且根系较多，组培苗生长健壮。
[0024] 2、沈国林等人用三叶木通的叶片、叶柄及茎段进行了愈伤组织的诱导，认为叶片 诱导愈伤组织最高，但各种愈伤组织并未诱导出不定芽，更没有后续的继代增殖、生根培 养、炼苗移栽等过程。本发明利用白木通带芽茎段从外植体的消毒处理，初代培养，继代增 殖培养，生根培养及炼苗移栽等一系列过程，旨在建立一个高效稳定的白木通组织培养快 繁技术体系，为白木通的工厂化育苗及遗传改了提供技术基础。
[0025] 3、艾辛等人用三叶木通的带芽茎段进行腋芽诱导及生根培养，虽然获得了再生 植株，但初代培养过程中腋芽诱导率较低，且最高诱导率仅为65. 38%，不能实现木通工 厂化育苗。本发明前期采用该配方对白木通带芽茎段进行腋芽诱导，发现诱导出的腋芽大 部分叶片卷曲，叶片数较少，在继代过程中慢慢死亡，不利于后期的继代增殖培养。在生 根培养方面，利用艾辛等人的配方发现根系生长较慢，总根数少，且根较细，试管苗长势 较差，不利于后期的炼苗移栽。本发明通过大量试验得到了适合白木通腋芽诱导、继代增 殖培养、生根培养的配方，抑制了初代培养褐化及污染严重的问题，极大的提高了腋芽的 分化率，获得了生长健壮的白木通组培苗。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明白木通茎段接种初期的照片；
[0027] 图2为本发明白木通茎段诱导出腋芽的照片；
[0028] 图3为本发明白木通腋芽继代增殖培养初期的照片；
[0029] 图4为本发明白木通腋芽增殖培养后的照片；
[0030] 图5为本发明白木通腋芽生根培养的照片；
[0031] 图6为本发明白木通生根培养的照片；
[0032] 图7为本发明白木通移栽的照片；
[0033] 图8为本发明白木通移栽后成活的组培苗的照片。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0035] 实施例1
[0036] 依次进行以下操作：
[0037] 1、外植体消毒处理在2014年4-6月间的晴d上午，选取当年粗度适中无病虫 害、半木质化的白木通茎段，喷水后带回实验室将采集的茎段去除叶片后，用自来水冲洗 IOmin左右，然后用适量的洗洁精水冲洗两遍，再用自来水冲洗干净后置于超净工作台中， 用75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液及0. 1% HgCl2消毒，设置不同时间梯度如表1。消毒 过程中用镊子不断搅动，无菌水冲洗5-6遍，用无菌滤纸吸干茎段表面的水分，用无菌刀 片切掉两端褐化的部分，将单芽茎段接种到培养基中统计污染率及褐化率；
[0038] 表1不同消毒处理对白木通茎段的消毒效果
[0039]
【主权项】
1. 一种白木通快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)消毒处理：将白木通当年生半木质化的带芽茎段切成2-3cm带单芽的茎段用75% 的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5-6次，再用2%的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次； ⑵腋芽诱导：接种到 WPM+0-2. Omg/L 6-BA+0. 1-1. Omg/L IAA+2. Omg/L 培养基 中诱导腋芽，暗培养后转到光照条件下培养； (3) 继代增殖：将茎段分化得到的健壮腋芽切下接种到WPM+2. 0-3. Omg/L 6-BA+0-0. 5mg/L IBA的培养基中进行腋芽的增殖培养； (4) 生根培养：将增殖培养获得的健壮幼嫩的苗接到1/2MS+0. 5-2. Omg/L IBA+0. 5-1. Omg/L NAA+0-1. Omg/L GA3的培养基中进行生根诱导； (5) 炼苗、移栽获得完整植株。
2. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，诱导腋芽时暗培养5d 后，转到光照条件下培养30-35d。
3. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，继代增殖培养的具体 过程如下：腋芽的增殖培养时暗培养l-2d，在光照条件下培养30-35d。
4. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，生根培养时暗培养5d 后转到光照培养下20d。
5. 根据权利要求1或2或3或4所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，培养温度 为26±1°C，光照培养强度为2100-22001x，光照培养时间12-14h/d。
6. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，腋芽诱导的培养基为： WPM+1. Omg/L 6-BA+0. 1-1. Omg/L IAA+2. Omg/L GA3或者 WPM+0. 5mg/L IAA+2. Omg/LGA 3。
7. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，继代增殖培养使用的 培养基为：WPM+2. 0-3. Omg/L 6-BA+0. 1-0. 5mg/L IBA。
8. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，生根培养使用的培养 基为：1/2MS+1. 0-2. Omg/L IBA+0. 5mg/L NAA+1. Omg/L GA3。
9. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，炼苗、移栽的具体过 程如下： 将生根后的试管苗先在空气相对湿度为80%以上的人工气候箱中进行移栽前 炼，2-3d后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为泥炭土 ：珍珠 岩：蛭石=2:1:1，用薄膜盖住营养杯口，保持恒定的气候条件，两周后取出薄膜，逐步 进行正常水肥管理。
10. 根据权利要求1所述的白木通快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法中用到的 培养基除生根培养基外均附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH调至5. 5-5. 8 ;生根培养基附加蔗 糖 20g/L，琼脂 2. 5g/L。
【专利摘要】本发明提供了一种白木通快速繁殖的方法,包括外植体的消毒、初代培养、增殖培养、生根培养及炼苗移栽等过程。本发明具有外植体污染率低,繁殖速率快,培育周期短的优点,不仅为快速繁殖优良白木通植株提供了一条途径,而且为白木通的工厂化育苗及以后遗传体系转化提供可能。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104855294
【申请号】CN201510334457
【发明人】李建安, 吴玲利, 雷小林, 马英, 孙颖, 柯镔峰
【申请人】中南林业科技大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月9日