珙桐离体胚组织培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及离体胚组织培养领域。更具体地说，本发明涉及珙桐离体胚组织培养 方法。
【背景技术】
[0002] 珙桐有"植物活化石"之称，是国家8种一级重点保护植物中的珍品，但是由于森 林的砍伐破坏及挖掘野生苗栽植，数量较少，分布范围也日益缩小。因而，除了加强保护以 外，还必须积极开展引种栽培和繁殖试验，进行人工造林，扩大其分布区。离体胚组织培养 是一种被证明在培育幼苗领域行之有效的无性繁殖技术，但是珙桐离体胚在培养过程中极 易形成愈伤组织，甚至死亡，这是由于珙桐离体胚有休眠，常规培养方法无法打破其休眠。 因此，亟需研发一种新型的能打破珙桐立体胚休眠的珙桐离体胚组织培养方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0004] 本发明还有一个目的是提供一种珙桐离体胚组织培养方法，其能够打破珙桐离体 胚的休眠，提高离体胚组织培养的成苗率。
[0005] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种珙桐离体胚组织培养方 法，包括：
[0006] 将新鲜的珙桐离体胚在20 - 30°C条件下用浓度为8 - 15mM的6^溶液浸泡1. 5 - 2. 5小时，清洗，然后珙桐离体胚接种至培养基中培养；
[0007] 其中，所述培养基包括：1/2MS，0. 3 - 0? 7mg/L的 6 -BA、2 - 5mg/L的IBA、25 - 35g/L的蔗糖和6 - 7mg/L的琼脂。
[0008] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，GA3溶液的浓度为10mM，浸泡时间为 2小时。
[0009] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，所述培养基中6-BA的浓度为0. 5mg/ L，IBA的浓度为3mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为6. 5mg/L。
[0010] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，所述新鲜的珙桐离体胚为：从新鲜的 珙桐种子中将胚剥离出来后立即切掉胚的子叶，即得新鲜的珙桐离体胚。
[0011] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，所述的清洗的方法为：在流水中冲洗 0. 5 - 1. 5 小时。
[0012] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，对珙桐离体胚进行培养的具体过程 为：
[0013] 首先在黑暗环境下培养3 - 5天，然后每天光照12小时，光照强度为15001X，继续 培养20 - 40天。
[0014] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，在将珙桐离体胚接种培养前，将清洗 后的珙桐离体胚杀菌消毒，所述杀菌消毒的具体方法为：
[0015] 将珙桐离体胚用质量分数为0. 1 %的升汞浸泡30 - 80秒，然后用无菌水清洗3 - 5次，再将珙桐离体胚用体积分数为75%的酒精浸泡5 - 8秒，然后用无菌水清洗4 一 6次。 [0016] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，在所述的清洗之前，还包括恒温处 理，具体过程为：
[0017] 将浸泡后的珙桐离体胚用浓度为IOmM的6^润湿后沥干，按1:5的重量比将珙桐 离体胚与粒径为3 - 5_的蛭石混合，浇水将蛭石润湿，然后放入温度为25°C的恒温箱中静 置8小时；取出珙桐离体胚，用浓度为的5mM的CTK溶液润湿后沥干，按1:3的重量比将珙 桐离体胚与粒径为2 - 3_的蛭石混合，浇水将蛭石润湿，在温度为20°C的恒温室内静置 24 - 36小时。
[0018] 优选的是，所述的珙桐离体胚组织培养方法，在所述的清洗之前，将恒温处理后的 珙桐离体胚进行通电处理，具体过程为：
[0019] 将珙桐离体胚放置在玻璃容器中，加入浓度为10% - 15%的氯化钠溶液，使氯化 钠溶液正好将珙桐离体胚浸没，在氯化钠溶液中放入两根导线，将两根导线分别与12伏直 流电源的正负极相连，每隔10分钟通电一次，每次通电3分钟，共通电10次。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果：
[0021] (1)本发明能够打破珙桐离体胚的休眠，提高离体胚组织培养的成苗率，成苗率达 86%〇
[0022] (2)本发明在将珙桐离体胚接入培养基前用GA3溶液的浓度为8 - 15mM，浸泡时 间为1. 5 - 2. 5小时，能够有效打破珙桐离体胚的休眠，当6^溶液的浓度低于8mM时，效 果不显著，加长浸泡时间仍不能帮助打破休眠，当高于15mM时，也不能打破休眠，甚至导致 胚死亡，最优选的GA3溶液的浓度为10mM，浸泡时间为2小时，在此浓度和浸泡时间下，珙桐 离体胚的成苗率最高。
[0023] (3)本发明的培养基包括：1/2MS，0. 3 - 0? 7mg/L的 6-BA、2 - 5mg/L的IBA、25 - 35g/L的蔗糖和6 - 7mg/L的琼脂，即先将MS培养基中所有成分减半得到1/2MS培养基，并 加入6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）、IBA(吲哚丁酸）、蔗糖和琼脂，将珙桐离体胚放入在这个特 制的培养基中培养，成苗率最高，当使用MS培养基的成分不减半或使用的6-BA超过0. 7mg/ L，就会显著降低成苗率。
[0024] (4)本发明还将浸泡后的珙桐离体胚进行恒温处理，即用GAJe]湿珙桐离体胚，与 蛭石混合后放入恒温箱中，然后用CTK溶液润湿，再次与蛭石混合，放入恒温箱中，这样能 够打破帮助珙桐离体胚的休眠，蛭石具有良好的保温性、透气性和保湿性，采用蛭石作为基 质，然后在蛭石中加入GA#PCTK，能够避免温度、湿度不均匀和透气性不够造成珙桐离体 胚不能解除休眠或解除休眠的程度不均，提高成苗的整齐度。研宄发现，将润湿的珙桐离 体胚，不与蛭石混合而直接放入恒温箱，成苗的整齐度明显降低，而且当蛭石的粒径为3 - 5mm和2 - 3mm时，效果最好。
[0025] (5)本发明还将珙桐离体胚放入到氯化钠溶液，每隔10分钟通电一次，每次通电 3分钟，共通电10次，用电流对珙桐离体胚进行良性刺激，能够进一步帮助打破珙桐离体胚 的休眠，刺激细胞分裂，提高新陈代谢的速度，进行通电处理后珙桐离体胚的成率比不进行 电流处理高10 - 15%。
[0026] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研宄和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0028] 应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0029] 〈实例 1>
[0030] 一种珙桐离体胚组织培养方法，包括：
[0031] 将新鲜的珙桐离体胚在20°C条件下用浓度为SmM的6^溶液浸泡1. 5小时，清洗， 然后珙桐离体胚接种至培养基中培养；
[0032] 其中，所述培养基包括：1/2MS，0. 3mg/L的6-BA、2mg/L的IBA、25g/L的蔗糖和 6mg/L的琼脂。
[0033] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，所述新鲜的珙桐离体胚为：从新鲜的珙桐种子 中将胚剥离出来后立即切掉胚的子叶，即得新鲜的珙桐离体胚。
[0034] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，所述的清洗的方法为：在流水中冲洗0. 5小时。
[0035] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，对珙桐离体胚进行培养的具体过程为：
[0036] 首先在黑暗环境下培养3天，然后每天光照12小时，光照强度为15001x，继续培养 20天。
[0037] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，在将珙桐离体胚接种培养前，将清洗后的珙桐 离体胚杀菌消毒，所述杀菌消毒的具体方法为：
[0038] 将珙桐离体胚用质量分数为0. 1 %的升汞浸泡30秒，然后用无菌水清洗3次，再将 珙桐离体胚用体积分数为75%的酒精浸泡5秒，然后用无菌水清洗4 一 6次。
[0039] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，在所述的清洗之前，还包括恒温处理，具体过程 为：
[0040] 将浸泡后的珙桐离体胚用浓度为IOmM的6^润湿后沥干，按1:5的重量比将珙桐 离体胚与粒径为3 - 5_的蛭石混合，浇水将蛭石润湿，然后放入温度为25°C的恒温箱中静 置8小时；取出珙桐离体胚，用浓度为的5mM的CTK溶液润湿后沥干，按1:3的重量比将珙 桐离体胚与粒径为2 - 3_的蛭石混合，浇水将蛭石润湿，在温度为20°C的恒温室内静置 24小时。
[0041] 所述的珙桐离体胚组织培养方法，在所述的清洗之前，将恒温处理后的珙桐离体 胚进行通电处理，具体过程为：
[0042] 将珙桐离体胚放置在玻璃容器中，加入浓度为10 %的氯化钠溶液，使氯化钠溶液 正好将珙桐离体胚浸没，在氯化钠溶液中放入两根导线，将两根导线分别与12伏直流电源 的正负极相连，每隔10分钟通电一次，每次通电3分钟，共通电10次。
[0043] 〈实例 2>
[0044] 一种珙桐离体胚组织培养方法，包括：
[0045] 将新鲜的珙桐离体胚在30°C条件下用浓度为15mM的GA^液浸泡2. 5小时，清洗， 然后珙桐离体胚接种至培养基中培养；
[0046] 其