保存液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞制备技术领域，具体涉及一种用于保存脐带和/或胎盘的保存 液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 依据来源，间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC)包括骨髓间充质干细胞、 脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞等。相比于骨髓来源的MSC来说，从胎盘或脐带分 离获取MSC能避免采集骨髓的创伤性操作，而且采集过程中的体外分离、培养相对简单，增 殖能力和分化潜能强，而免疫原性低、生物性能稳定，因此其具有更高的应用价值。
[0003] 为了保证所获得的脐带MSC的性状、细胞活性，通常是从新鲜的胎盘或脐带进行 制备而不采用长期冷冻保存的MSC。但是，胎盘或脐带从采集结束到进入实验室分离的这 个过程需要一段时间，少则2小时、多则12小时；而在这段时间内胎盘或脐带脱离了人体环 境，会迅速影响胎盘或脐带组织的代谢状态，从而影响了制备的MSC的品质。因此在上述情 形下，一般通常为了维持制备MSC细胞的活性和品质，会将采集结束的胎盘或脐带置于保 存液中进行保存，一方面满足其营养的需要和其生存所必需的理化环境，另一方面也是为 了避免遭到其他细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及有害物质的污染。
[0004] 而目前胎盘和脐带在运输过程中使用的保存液有两类：一类是生理盐水；另一类 是培养液如DMEM。其中，生理盐水在短期内可以维持渗透压环境，但是不具有营养成分，不 能提供组织或细胞的营养需要；而培养液虽然营养丰富，可提供细胞代谢，但是在组织代谢 的过程中酸性产物积聚易造成pH降低，进而影响细胞活性。这两类保存液在维持细胞外环 境渗透压和抵抗污染方面均有不足，尤其也不能抑制胎盘和脐带组织血液凝固的状态，经 常使得胎盘和脐带组织血液凝固对后续的分离操作产生一定的干扰。
【发明内容】
[0005] 本发明实施的目的在于克服上述现有保存液的不足，提供一种能够维持组织细胞 渗透压、防止血液凝集以及维持组织细胞活性的脐带和/或胎盘的保存液及其制备方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0007] -种脐带和/或胎盘保存液，包括50~60g/L右旋糖酐、6~7g/L氯化钠、200~ 250mg/L氯化f丐、200~400mg/L氯化钾、1~I. 2g/L葡萄糖和10~30g/L人血白蛋白。
[0008] 采用本发明的保存液相比现有的保存液，在保存脐带的过程中降低脐带组织细胞 的新陈代谢量，又能提供一些基本的营养物质和能量物质，以维持较低的代谢水平，使细胞 活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形；并且成分中 的右旋糖酐具有抗凝作用，可防止血液凝集，进而避免对后续的分离操作造成干扰。
[0009] 在上述基础上，本发明进一步还提出制备保存液的方法，包括：
[0010] 将所述氯化钠、氯化钙、氯化钾、葡萄糖制成第一溶液；
[0011] 将所述人血白蛋白制成第二溶液；
[0012] 将所述右旋糖酐制成第三溶液；
[0013] 将所述第一溶液、第二溶液和第三溶液进行混合，得到混合溶液；
[0014] 调节所述混合溶液的pH至7. 1~7. 3。
[0015] 采用本发明的制备方法，将溶解程度不同的葡萄糖、无机盐，蛋白质和右旋糖酐分 别各自溶解之后，再进行混合；避免直接一次混合溶液会产生无机盐脱去蛋白质胶体的水 化膜降低与水的亲和性，进而易于被粉末的右旋糖酐结合或者表面包覆，不利于完全的分 离和溶解的问题；而且制备过程快捷、简便。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0017] 本发明实例提供一种保存液，用于保存脐带和/或胎盘，该保存液包括50~60g/ L右旋糖酐、6~7g/L氯化钠、200~250mg/L氯化钙、200~400mg/L氯化钾、1~I. 2g/L 葡萄糖、10~30g/L人血白蛋白。
[0018] 本发明的保存液相比现有的保存液，其成分中右旋糖酐一方面具有抗凝作用，可 防止血液凝集，进而避免对后续的分离操作造成干扰；更主要地，右旋糖酐自身是发酵合成 的一种葡萄糖聚合物，性质上目前是最佳的血浆代用品之一，能改善微循环，亦有扩充血容 量作用；因此在脐带和/或胎盘离体之后能起到充当体内血液或者组织液的替代作用，防 止因为离体之后引起组织细胞性状或者活性的骤变。
[0019] 在上述实施的过程中，基于本发明所需要的保存液所需替代的血液或者组织液的 粘度流动性、气容量等性能的要求，以上采用的右旋糖酐优选采用分子量为20000~40000 的低分子右旋糖酐，相比高分子和中分子的右旋糖酐，其对蛋白溶解性、保存液的粘度等方 面的影响都较小。
[0020] 同时，其中的葡萄糖、人血白蛋白这两种成分基本上可以包含了提供组织细胞生 长的C源、N源等所需的基本营养来源，作为供给细胞基础能量和基本的营养物质。同时， 在本发明中不再另外添加其他大量的营养或者能源物质，是因为经过反复试验和检测，脐 带和/或胎盘的组织细胞在失去机体调控的情形下，在离体的环境中下胁迫式的进行大量 代谢，反而会大大缩短组织细胞的寿命和活性。因此，本发明的能源和营养物质限制在1~ I. 2g/L葡萄糖、10~30g/L，在保证细胞存活的同时使脐带和/或胎盘的组织细胞代谢活动 处于相对较低的水平，更加利于维持其形态和形状。并且，人血白蛋白利于保持组织的水分 容量，利于维持渗透压的平衡。
[0021] 同时进一步在保存液中还具有的三种无机盐氯化钠、氯化钙和氯化钾，可以利用 无机离子提供保存液中的离子强度，用于提供细胞外渗透压，避免在保存过程中发生水的 跨膜移动，从而破坏细胞内的体液容量平衡和细胞形态变化。并且更主要地本发明采用上 述三种不同的阳离子混合，是可以利于维持细胞活性；一方面因为本身细胞间的通信是依 靠这些阳离子进行传递从而保持细胞间的信号联系，而在脐带组织离体之后，细胞间的信 号传递会逐渐减弱，直至细胞个体死亡，而添加的这多种Na+、K+、Ca2+可以有利于维持细胞 间的信息传递，利于维持细胞的活性；另一方面同时，本身这几种阳离子对于组织细胞来 说，需要通过相应的运载和信号蛋白才能被细胞接收，是属于高度不通透的，所以细胞膜对 于这些需要主动识别和运载的阳离子相比水分子等非电解质更加敏感，采用这多种离子混 合尤其是Ca2+可以刺激脐带组织离体之后组织细胞膜的通透性变化，使离体之后的组织细 胞自身能具有良好的应变能力。
[0022] 同时，在上述实施方式中，根据本发明试验之前对脐带组织细胞培养观察得到的 最佳的渗透压耐受范围260~320mmol/L的结果；同时基于三种阳离子所带的电荷数不 同，也为了维持渗透压和电荷强度的平衡和最佳，本发明中采用6~7g/L氯化钠、200~ 250mg/L氯化钙、200~400mg/L氯化钾的三者比例进行配置；避免采用大量钙离子造成电 荷强度偏高而破坏细胞自身的稳定性。
[0023] 进一步在上述基础上，本发明的保存液进一步还可以具有抗生素的成分，用于解 决在组织获取和保存的过程中的细菌等微生物污染及不同细胞类型的交叉污染问题。而在 本发明中所使用的抗生素最优选的采用青霉素和链霉素共用，从机理上，青霉素抑制细胞 壁的合成会导致细菌细胞破裂死亡，而链霉素干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭 或者抑制结核杆菌生长；这两种抗生素互补使用基本可以比较完全地去除污染的杂菌的问 题，而且脐带组织细胞自身没有细胞壁，代谢过程中也不涉及杆菌蛋白，因此青霉素和链霉 素对脐带和/或胎盘的组织细胞无影响。基于保存液的成分，青霉素的添加量控制90~ 110U/mL，链霉素添加量控制80~120yg/mL。
[0024] 上述抗生素在使用的过程中，脐带和/或胎盘从获取保存至实验室处理操作，有 时保存时间会比较长，其中青霉素本身比较不稳定，易分解产生青霉酸，对一些细胞特别是 参与免疫问答的细胞是有影响的。虽然需要从脐带和/或胎盘制备的早期脐带干细胞不是 免疫应答细胞，但是本领域后续比较多的是要用于制备DC、CIK等免疫细胞；因此在实施过 程中，如果目的是从脐带和/或胎盘中制备免疫细胞，双抗的选择可以根据情况进行替换， 替换成50~200mg/L的庆大霉素、100~1000mg/L的卡那霉素、10~50mg/L的四环素或 50~100mg/L的红霉素中的一种。并且从本发明的上述抗生素的选用机理上还可以看出， 其作用的方式是干扰细菌细胞壁和代谢蛋白从而进行调整，而不是选择影响细胞膜类型的 抗生素进行，以避免干扰到上述Na+、K+、Ca2+等无机离子在细胞膜上的正向效果。
[0025] 在上述保存液成分基础上，本发明进一步还提出上述保存液的制备方法，包括如 下步骤（按照IL的标准体积配置）：
[0026]S01，按照上述保存液中所描述的量，逐一称取6~7g氯化钠、200~250mg氯化 钙、200~400mg氯化钾、1~I. 2g葡萄糖之后，用水制成第一溶液；
[0027] S02,按照上述保存液中所描述的量，称取10~30g人血白蛋白，用水溶解制成第 二溶液；
[0028] S03,称取50~60g右旋糖酐粉末用水溶解制成第三溶液；
[0029] S04,按照上述保存液中固态的抗生素用少量水制成抗生素溶液；
[0030] S05,将上述第一溶液、第二溶液、第三溶液和抗生素溶液进行混合后，得到混合溶 液；
[0031] S06,定容至IL后调节混合溶液的pH至7. 1~7. 3即可。
[0032] 在上述制备的过程中，将溶解程度不同的葡萄糖、无机盐，蛋白质和右旋糖酐分别 各自溶解之后，再进行混合，避免直接一次混合溶液会产生无机盐脱去蛋白质胶体的水化 膜降低与水的亲和性，进而易于被粉末的右旋糖酐结合或者表面包覆，