专利名称：制造维生素e中间体的方法
维生素E的主要商业化形式是其乙酸酯衍生物，例如借助乙酐，经(全外消旋(all-rac))-α-生育酚乙酰化合成。
(全外消旋)-α-生育酚的工业合成基于三甲基氢醌(TMHQ)与异植醇、植醇或其衍生物如植基卤化物的缩合。然而，TMHQ通常由昂贵的2，3，6-三甲基苯酚制得，且TMHQ与异植醇、植醇或其衍生物如植基卤化物缩合必须使用酸性催化剂。
另外，通过使三甲基氢醌-1-单乙酸酯(TMHQ-1-MA)与异植醇或其等价物缩合可以合成(全外消旋)-α-生育酚乙酸酯。用于这一替换合成的TMHQ-1-MA可由便宜得多的α-异佛尔酮经酮基异佛尔酮和三甲基氢醌二乙酸酯(TMHQ-DA)而得到，后者必须要经历完全区域选择性单-脱乙酰作用，然而该完全区域选择性单-脱乙酰作用用文献中已知的方法(例如，用含水碱处理)很难完成。
现在已经发现利用脂酶使TMHQ-DA发生酶催单皂化作用可将TMHQ-DA完全区域选择性地转化成TMHQ-1-MA。
在本发明优选的实施方案中，将脂酶固定在固态载体材料上。所述载体材料可以是疏水性载体，例如象由Membrana GmbH，Obernburg(德国)提供的ACCUREL MP1001这样的聚丙烯载体。然而，不同性质的载体，即常于酶的固定化作用的碱性催化剂载体CELITE[化学组成87％SiO2，0.9％CaO，6.1％Al2O3，1.6％Fe2O3，1.6％Na2O+K2O；pH(10％悬浮液，25℃)＝8.5]，不能使固定化的酶发挥出令人满意的性能。
适合于本发明的脂酶包括属于EC3.1.1.3类酶的那些。
在可由市场购到的各种脂酶中，尤其已证明下列脂酶对本发明是有效的Thermomyces lanuginosus脂酶(TLL)；米黑毛霉(Mucor mihei)脂酶(MML)；产碱杆菌属数种(Alcaligenes spec.)脂酶(ASL)；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂酶(CRL)；Candida antartica(级分B)脂酶(CAL(B))和假单胞菌属数种(Pseudomonas spec.)脂酶(PSL)，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂酶(PFL)。优选的脂酶是PSL，PFL和TLL；特别优选TLL。
有利的是本发明的酶催单皂化作用在疏水性溶剂中进行，例如在1-甲基-2-吡咯烷酮中，或尤其是在醚类溶剂如叔丁基甲基醚、丁基醚、甲基2-甲基-2-丁基醚等中，特别优选叔丁基甲基醚。
该醚类溶剂中可方便地加入约0.01-99.5vol％，优选约0.03-20vol％，最优选约0.09-5vol％的水或缓冲液如磷酸盐缓冲液。乙醇至多可以以1％的浓度存在。
《四面体》(Tetrahedron)56(2000)317-321中尤其描述了在水存在下借助叔丁基甲基醚中的游离酶PSL将2-甲基-1，4-二乙酰氧基萘选择性单皂化成相应1-乙酰氧基-4-羟基化合物。然而，在高达185小时的时间内重复此试验时，并未发现获得一致的结果。此外，在相同反应条件下，在高达约300小时的时间内用游离酶PSL处理TMHQ-DA时，初始反应速率仅约为1/3。相反的是在小于100小时的时间内借助固定化的PSL，TMHQ-DA的单皂化作用导致几乎定量的转化，并且用固定化的PFL和固定化的TLL得到了相似的结果。
本发明中单皂化的反应速率通常随着反应温度的增加而增加。当然最高反应温度由溶剂的沸点所限制(在叔丁基甲基醚的情况下为55℃)。但是在加压下进行酶催单皂化作用时，还可达到更高的反应温度。就一些脂酶而言，尤其是TLL，温度可升高到约60-80℃。
因此，在温度约为4-80℃的范围内，本发明的酶催单皂化作用能够容易地完成，优选的温度范围是约20-75℃。
游离和固定化的酶与底物(TMHQ-DA)的比例可在较宽的范围内变动，方便的是约0.001-10g/g，优选约0.01-0.2g/g。
底物(TMHQ-DA)与溶剂的比例同样可在较宽的范围内变动，方便的是约0.001-100g/g，优选约0.01-0.8g/g。
当将酶固定到合适的载体上时，本发明的单皂化作用可有利地在例如固定床反应器或连续搅拌釜式反应器中连续而不是分批地进行。
如前所述，例如通过与异植醇的反应可以将由本发明的酶催单皂化得到的TMHQ-1-MA转化成(全外消旋)-α-生育酚乙酸酯。如果粗产物中有(全外消旋)-α-生育酚，该(全外消旋)-α-生育酚可根据需要通过乙酰化，例如借助乙酐，转化成其乙酸酯。
下面实施例更具体地说明本发明但决不意欲限制其范围。实施例1在玻璃容器中用游离脂酶进行分批试验将5ml叔丁基甲基醚、50μl水、1.67mg游离酶[脂酶来源于FlukaChemie AG(Buchs，瑞士)]和80mg TMHQ-DA[粗产物，即由酮基异佛尔酮的重排-芳构化产生且由约90％TMHQ-DA和约9％三甲基儿茶酚二乙酸酯(TMC-DA)组成的物质]加入到容器中。容器中液面上空间用氮冲洗，将该容器放到50℃的恒温箱中，以700rpm搅拌使其充分混匀。为了取样，打开容器，取出500μl，液面上空间用氮冲洗，然后再次封闭容器。将样品稀释至底物或产物的浓度为0.5-1.0wt％，并且用GC分析。
表16、12、24或48小时后各种脂酶和TLL各自的转化率(E/S＝1/48，CTMHQ-DA＝0.019g/g)
实施例2用固定化酶进行的分批试验(a)由Membrana GmbH，Obernburg提供的名为ACCURELMP1001的载体的尺寸为400-1000μm。固定化之前过筛选择尺寸为1000μm的载体粒子。
为了固定化，将1.7ml乙醇中的500mg ACCUREL MP1001与溶解于2.5ml磷酸钾缓冲液(KH2PO4，pH7，20mM)中的100mg脂酶粉混合，室温下在摇动器上摇动过夜。过滤收集固定化脂酶，用相同的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小时。该固定化酶用前储存在4℃。
用修改的Lowry方法来测定固定化蛋白的量。
(b)将10ml叔丁基甲基醚、100μl水、20mg固定化酶(13％酶/87％ACCUREL载体)[脂酶是Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，德国)提供的筛选试剂盒的一部分，称为“手性酶(Chirazyme)”]和160mg TMHQ-DA加入到容器中。容器液面上空间用氮冲洗。将该容器放到33℃的恒温箱中，以700rpm搅拌使其充分混匀。为了取样，打开容器，取出500μl，用氮冲洗液面上空间，再次封闭容器。接着将样品稀释至底物或产物的浓度为0.5-1.0wt％，并用GC分析。
表2用手性酶(chirazyme)在96小时后纯TMHQ-DA的转化率(EI/S＝1/8，CTMHQ-DA＝0.019g/g)
与用纯TMHQ-DA比较，使用粗制TMHQ-DA(见实施例1)导致相对转化率范围为95-100％。表3固定化PSL和TLL间的比较(EI/S＝1/2，CTMHQ-DA＝0.014g/g，温度50℃，其它条件见上，对两种酶的选择性＞99.5％)
实施例3在固定床反应器中的连续酶催皂化在固定床反应器中于40℃进行TMHQ-DA到TMHQ-1-MA的连续皂化[900mg固定在ACCUREL MP1001上的TLL；床高73mm；床直径12.0mm；床密度0.11g/ml；床容积8.1ml；载体直径0.7mml，底物流量水饱和叔丁基甲基醚中TMHQ-DA的浓度为0.01g/g；叔丁基甲基醚的质量流量＝0.080mg/min；TMHQ-DA的质量流量＝0.85g/d。
固定化的TLL至少可保持224小时的稳定性和活性；在TMHQ-DA到TMHQ-1-MA的皂化作用中TLL的选择性在100％的转化率下几乎为100％；并且甚至在长停留时间下或供入低浓度TMHQ-DA溶液时，TMHQ-1-MA到TMHQ的皂化作用几乎没有发生。
权利要求
1.一种三甲基氢醌二乙酸酯高选择性地转化为三甲基氢醌-1-单乙酸酯的方法，包括借助脂酶将三甲基氢醌二乙酸酯进行酶催单皂化作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中将脂酶固定在固态载体材料上。
3.如权利要求1所述的方法，其中脂酶是假单胞菌属数种(Pseudomonas spec.)脂酶，特别是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂酶或Thermomyces lanuginosus脂酶。
4.如权利要求3所述的方法，其中脂酶是Thermomyces lanuginosus脂酶。
5.如权利要求1所述的方法，其中酶催单皂化作用在疏水性溶剂中进行。
6.如权利要求5所述的方法，其中将叔丁基甲基醚用作溶剂。
7.如权利要求2所述的方法，其中酶催单皂化作用连续进行。
8.如权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括将产生的三甲基氢醌-1-单乙酸酯通过与异植醇或其等价物反应直接或根据需要随后进行脱乙酰化而转化成(全外消旋)-α-生育酚或其乙酸酯。
9.如权利要求1所述的方法，其中反应在加压下进行。
10.一种生产(全外消旋)-α-生育酚或其乙酸酯的方法，该方法包括借助脂酶将三甲基氢醌二乙酸酯转化为三甲基氢醌-1-单乙酸酯，并且使产生的三甲基氢醌-1-单乙酸酯与异植醇或其等价物缩合，任选随后进行脱乙酰化作用。
全文摘要
利用脂酶由选择性酶催单皂化作用可以从三甲基氢醌二乙酸酯制备三甲基氢醌－1－单乙酸酯。把酶固定在固态载体材料上可增加酶的活性。当将酶固定到合适的载体上时,单皂化作用可连续而不是分批地进行。通过与异植醇或其等价物反应可以将三甲基氢醌－1－单乙酸酯直接或根据需要随后进行乙酰化而转化成(全外消旋)－α－生育酚或其乙酸酯。
文档编号C12P7/62GK1373225SQ0210508
公开日2002年10月9日 申请日期2002年2月20日 优先权日2001年2月21日
发明者W·邦拉特, D·艾森克雷特泽尔, V·昂约拉斯, R·卡格, T·内特舍尔, M·施耐德 申请人:罗切维他命股份公司