一种富硒酵母培养物的生产方法

专利名称：一种富硒酵母培养物的生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物培养物及其微生物发酵方法，具体地说涉及一种富硒酵母培养
物的生产方法。
背景技术：
硒是动物必需的微量元素。由于无机硒具有毒性，利用率低，出于环保要求，添加量受到限制，提倡使用有机硒。目前有机硒主要有硒代蛋氨酸，纳米硒和酵母硒。酵母硒是将酵母细胞培养在含无机硒培养基中，通过生物转化将无机硒转变成有机硒而得到的。主要结合形式包括取代含硫氨基酸中的硫以及以共价键同肽、蛋白结合，少量同多糖结合。
目前国际上酵母硒产品，多通过液体发酵、固体吸附方法进行生产。该类方法存在以下不足(1)酵母发酵生成的益生成分有限；(2)投资额度大；(3)无机硒的转化率较低，因而生产成本高；(4)存在废液废渣排放的问题，有必要加以进一步改进。
CN1836545涉及富硒禽饲料制备方法，特征在于如何使用酵母硒，并未涉及发酵方法；CN101139554涉及中草药酵母硒的固态发酵制备方法，特征在于结合中草药固体发酵，重点在中草药，很难保证获得稳定的硒转化率；CN1618316涉及奶牛热应激缓解剂及其制备方法和应用，特征在于如何使用酵母硒，并未涉及发酵方法。 本发明采取的方法是在液体发酵的基础上，引入固体发酵，采用液体与固体两相发酵方法，在固体发酵阶段对富硒酵母进行破壁，生产富硒酵母培养物。酵母培养物(Yeastculture)方法不同于常见的活细胞酵母方法，要在菌体达到一定数量后进行破壁，酵母培养物不含许多活酵母菌，而以酵母发酵的代谢产物、变性培养基、酵母细胞壁和酵母内容物为主。目前还没有采用液体_固体两相发酵方法，将酵母培养物与硒转化结合在一起的现有技术。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够实现充分富硒的通过液体与固体两相发酵生产富硒酵母培养物的方法。 在一个实施方案中，所述生产酵母培养物的方法包括 (1)菌种筛选通过酵母在无机硒或有机硒培养基中的生长表现确定所用菌株；
(2)利用(1)中确定的菌株进行菌种逐级扩大培养； (3)在含有无机硒或有机硒的液体培养基中用酵母菌进行液体发酵转化；
(4)液体发酵后，将液体发酵液与固体培养基混合，进行固体发酵，所述固体发酵包括先进行固体有氧发酵，再进行固体厌氧发酵并对酵母进行破壁；
(5)对固体发酵产物进行干燥得到成品。 在一个实施方案中，本发明所述酵母为热带假丝酵母或酿酒酵母。 在一个实施方案中，本发明所述无机硒为正四价无机硒或正六价无机硒，优选为
亚硒酸钠。 在一个实施方案中，本发明所述有机硒为蛋白硒、氨基酸硒或多糖硒。 本发明方法中的菌种筛选步骤中，可通过酵母在高浓度正四价或正六价无机硒培养基中的生长表现确定所用菌株，所述浓度优选为0. 1% 0. 5%重量。 本发明的菌种扩大培养可以是逐级扩大培养，可包括斜面培养、摇瓶扩大培养和
种子罐扩大培养，优选包括平皿培养和斜面、摇瓶培养。 在本发明的液体发酵转化步骤中，液体培养基中无机硒或有机硒含量可以为0. 05% 0. 4%重量，优选0. 1% 0. 2%重量。 在本发明的液体发酵转化步骤中，液体发酵转化时间可以为12 48小时，优选18 48小时。 在本发明的固体发酵步骤中，可以将液体发酵液与固体培养基按i : 3 1.5 : i重量，优选i : 2重量的比例混合。 本发明所述固体培养基可以含有豆粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、花生粕(饼)、
胡麻粕(饼)、甜菜粕(饼)、麦麸、稻糠、次粉、木薯粉、大豆皮、玉米酒精糟、玉米或大米，或
者其中一种或多种的混合物；优选含有豆粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、玉米或麦麸，或
者其中一种或多种的混合物。 本发明方法中所用的固体培养基可以直接使用或经过灭菌处理后使用。 本发明的固体发酵可以利用堆放、容器、袋或固体发酵反应器进行。 在本发明方法的一个实施方案中，所述固体有氧发酵进行16-36小时，优选24-36小时。 在本发明方法的一个实施方案中，所述固体厌氧发酵并对酵母进行破壁的过程在40 6(TC，优选在5(TC下进行。该过程可进行6 24小时，优选12小时。
本发明方法中，对固体发酵产物进行干燥得到成品。所述干燥包括流化床、气流、滚筒干燥。可干燥至成品水分低于15%重量，优选低于13%重量。 本领域技术人员可以理解，本发明各实施方案中的技术特征可以相互组合，得到多种实施方案。 在一个优选实施方案中，本发明提供了一种能够实现充分富硒的通过液体-固体两相发酵生产酵母培养物的方法，所述方法包括 (1)菌种筛选用热带假丝酵母或酿酒酵母，经过在高浓度正四价无机硒
(0. 1% 0. 5% )培养基中的生长表现确定所用菌株； (2)菌种逐级扩大培养经过斜面、摇瓶和种子罐扩大培养； (3)液体发酵转化液体培养基中正四价无机硒含量为0.05% 0.4%，优选
0. 1% 0. 2% ;液体发酵转化时间为12 48小时，优选18 26小时； (4)液体发酵液与固体培养基混合，液体发酵结束后，培养液与固体培养基按
i : 3 1.5 : i，优选i : i重量比例混合，进入固体发酵阶段。这里所述的固体培养基
是指含有豆粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、花生粕(饼)、胡麻粕(饼)、甜菜粕(饼)、
麦麸、稻糠、次粉、木薯粉、大豆皮、玉米酒精糟、玉米、大米中的一种或多种混合物，优选豆
粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、玉米、麦麸中的一种或多种混合物； 这里所述的固体发酵是指对固体培养基直接或灭菌处理后，利用堆放、容器、袋或
固体发酵反应器进行的发酵生产过程，又分为有氧和厌氧发酵两个阶段。 (5)固体有氧发酵有氧发酵16-36小时，优选16_24小时； (6)固体厌氧发酵固体有氧发酵结束后，对酵母进行破壁，条件是保持40 6(TC，固体厌氧发酵6 24小时，优选5(TC发酵6 10小时； (7)成品对固体发酵产物进行干燥得到成品；这里所述的干燥是指流化床、气流、滚筒干燥。成品水分低于15%，优选低于13%，有机硒0.05% 0. 3%，气味芳香。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，培养基中无机硒含量为0. 1% ;液体发酵转化时间为18小时；培养液按1 : l重量比例同固体培养基混合；固体培养基其特征在于含有豆粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、玉米、麦麸中的一种或多种混合物；固体有氧发酵24小时；固体厌氧发酵50°C， 10小时；成品干燥到水分13%以下。 在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述液体培养基中无机硒或有机硒含量为0. 2%重量，且液体发酵转化时间为48小时，其中所述固体发酵步骤中，液体发酵液与固体培养基按l : 3重量的比例混合，其中所述固体有氧发酵进行36小时，且所述固体厌氧发酵并对酵母进行破壁的过程在5(TC以下进行12小时。 本发明方法所得成品，可包含有机硒0. 05% 0. 5%重量，且气味芳香。 在一个实施方案中，本发明提供由本发明的富硒酵母培养物生产方法生产的富硒
酵母培养物，该富硒酵母培养物包含有机硒0. 05% 0. 5%重量，且气味芳香。 通过固体发酵微生物在固体培养基继续增殖，扩大产品变性培养基、代谢产物、酵
母细胞壁、内容物等益生成分比例，硒得以进一步随着酵母裂殖均匀分散，提升产品生物学价值。 本发明的产品与方法相对于现有技术的优点 (1)本发明吸取有关微生物制剂生产方法的优点，采用已知的热带假丝酵母菌和酿酒酵母菌为菌种，以葡萄糖、豆粕(饼)、棉粕(饼)、菜粕(饼)、花生粕(饼)、胡麻粕(饼)等为原料，来源广泛，方法过程简单，产品价格低廉。
(2)本发明采用微生物液体-固体两相发酵新方法，通过大剂量接种，能够解决固
体发酵过程中，发酵周期长，容易污染等问题，生产的产品质量稳定。
(3)微生物在固体培养基继续增殖，硒进一步均匀分散。
(4)本发明采用微生物液体-固体两相发酵新方法，不仅完成了无机硒转化为有
机硒过程，还通过破壁方法，产生大量酵母培养物成分，具有益生饲料的特点。
(5)本发明生产出的富硒酵母培养物兼有有机硒与益生饲料的双重作用，用于畜
禽水产饲料，可以提高动物抗应激能力，提高母畜繁殖性能，改善肉品质。
(6)本发明所有含硒菌液均混入固体料，继续发酵制成成品，无废液废渣排放，完
全符合环保要求。 (7)与同含量无机产品辛辣味相比，本产品具有发酵香味，从而增加了饲料的适口性。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进一步进行说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1 : 1、菌种选用从广州市微生物研究所购入的热带假丝酵母AS2. 637 2、培养基葡萄糖2. 0%、蛋白胨1. 0%、酵母膏0. 5%、pH = 6. 8、无机硒(来源于
亚硒酸钠)0. 2%，培养24h，确认菌种能在上述培养液中保持生长良好。
3、斜面培养基与培养条件 葡萄糖2. 0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%、琼脂2. 0%。 pH = 6. 8、 115"灭菌18分钟。将试管菌种扩繁至培养皿，放入3(TC恒温培养箱中培养24h。
4、摇瓶种子培养基与培养条件 葡萄糖2. 0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%。起始pH二6. 8、115t:灭菌18分钟。将培养皿菌种接入摇瓶，放入3(TC恒温摇床中，200r/min振荡培养24h。
5、一级种子罐扩繁培养基与培养条件 培养基豆粕1. 0%、玉米0. 5%、蔗糖2. 0%、蛋白胨1. 0%、酵母膏0. 5%、磷酸二氢钾O. 1%、硫酸铵0. 2%、氯化钠0. 05%、消泡剂0. 05%。起始pH二 6. 8、 121。C灭菌30分钟。摇瓶到种子罐接种量按5%接种，种子罐培养时间为24h。
6、二级种子罐加铬培养 培养基为豆粕1.0%、玉米0.5%、蔗糖2.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0. 1 % 、硫酸铵0. 2 % 、氯化钠0. 05 % 、消泡剂0. 05 % ，无机硒(来源于亚硒酸钠)O. 1%。起始pH二 5.0、12rC灭菌30分钟。再按5X接种量接入二级种子罐，培养35h。
7、固体发酵 对豆粕加热至85 IO(TC ，保持5分钟灭菌，冷却至40°C ;将二级种子罐加硒培养液与灭菌豆粕混合，调整固体含水量达到45%开始发酵。对发酵物料温度进行监控，使温度不超45t:;有氧发酵24h后进入厌氧发酵，温度达到5(TC以上，发酵6 IO小时破壁，镜检破壁情况决定何时结束进行干燥。
产品检测与效果 在酸性条件下，硒与3，3'-二氨基联苯胺作用，生成黄色络合物(Se-DAB)，用分光
光度法测定。测定总硒和无机硒，用差减法求出有机硒含量。
溶液配制 (1)硒标准液准确称取2. 190g干燥的亚硒酸钠(优级纯)，溶于蒸馏水，添加80ml、48X的HBr，然后用蒸馏水稀释至1L，制备成含硒lg/L的标准硒贮备液或直接购买lg/L的硒标准液。临用时用蒸馏水稀释成lmg/kg的硒标准溶液。 (2)消化液称取10g钼酸钠，加150ml蒸馏水溶解，缓慢添加150ml浓硫酸，冷却，加入200ml、70% 72%高氯酸； (3)0. 5%的DAB 0. 5gDAB溶解于100ml新鲜制备的四氯甲烷溶液中。
样品的处理及测定 准确称取O. 1000g本发明产品，置于烧瓶中，加入5ml消化液，接上冷凝装置，回流冷凝消化至样液呈无色透明为止。冷却后用超声振荡器(150瓦频率、20KHZ)处理30min，消化液转入200ml的烧杯，用大约20ml的蒸馏水洗净。用饱和的NaOH溶液调节上述消化液pH为7. O，然后用90%的甲酸调节pH至2 3，加入4ml、40%的盐酸羟胺还原过剩的氧化成分，最后将溶液定溶到50ml。取6支125ml的分液漏斗， 一支加入上述溶液10. Oml，另5支分别加入2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. Oml的硒标准溶液(lmg/kg)，各加蒸馏水至40ml，用甲酸调节pH2 3，加入4m1、0. 2M的EDTA-2Na以掩盖干扰离子，然后加2ml、0. 5X的DAB，摇匀，于6(TC水浴20min (光线暗淡的环境下)，取出，用浓氨水调节pH至7 7. 5，加入4. Oml甲苯，猛晃lmin，静置3 4min分层，然后将有机层通过脱脂棉滤到lcm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作空白)。用标准硒溶液的吸光度绘制标准曲线，由样品的吸光度，从标准曲线上查找、计算出样品中无机硒含量。 总硒含量测定称取1. OOOg本发明产品，加入50ml蒸馏水，小火微沸30min，抽滤得到滤液，定溶至50ml，然后按上述样品的测定方法测定总硒含量。
有机硒含量=总硒含量_无机硒含量
测定结果 按上述方法进行测定，有机硒含量^ 0. 1%，无机硒转化成有机硒的比例> 95%，甚至> 98% ;粗蛋白含量10% -50% ;依据国家大豆肽粉行业标准(QB/T2653-2004)测定的肽转化率(粗蛋白中小肽含量)>8% ;黄曲霉毒素〈30i!g/kg。与同含量无机产品辛辣味相比，本产品具有发酵香味。
实施例2 1、菌种选用从广州市微生物研究所购入的热带假丝酵母AS2. 637 2、培养基葡萄糖2. 0%、蛋白胨1. 0%、酵母膏0. 5%、pH = 6. 8、有机硒(来源于
5%蛋氨酸硒)0.2%，培养24h，确认菌种能在上述培养液中保持生长良好。 3、斜面培养基与培养条件 葡萄糖2. 0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%、琼脂2. 0%。 pH = 6. 8、 115"灭菌18分钟。将试管菌种扩繁至培养皿，放入3(TC恒温培养箱中培养24h。
4、摇瓶种子培养基与培养条件 葡萄糖2. 0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%。起始pH二6. 8、115t:灭菌18分钟。将培养皿菌种接入摇瓶，放入3(TC恒温摇床中，200r/min振荡培养24h。
5、一级种子罐扩繁培养基与培养条件 培养基豆粕1. 0%、玉米0. 5%、蔗糖2. 0%、蛋白胨1. 0%、酵母膏0. 5%、磷酸二氢钾O. 1%、硫酸铵0. 2%、氯化钠0. 05%、消泡剂0. 05%。起始pH二 6. 8、 121。C灭菌30分钟。摇瓶到种子罐接种量按5%接种，种子罐培养时间为24h。
6、二级种子罐加铬培养 培养基为豆粕1.0%、玉米0. 5%、蔗糖2.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%、磷酸二氢钾0. 1 % 、硫酸铵0. 2 % 、氯化钠0. 05 % 、消泡剂0. 05% ，有机硒(来源于5 %蛋氨酸硒)O. 1%。起始pH二 5.0、12rC灭菌30分钟。再按5X接种量接入二级种子罐，培养35h。
7、固体发酵 对豆粕加热至85 IO(TC ，保持5分钟灭菌，冷却至40°C ;将二级种子罐加硒培养液与灭菌豆粕混合，调整固体含水量达到45%开始发酵。对发酵物料温度进行监控，使温度不超45";有氧发酵24h后进入厌氧发酵，温度达到5(TC以上，发酵6 IO小时破壁。镜检破壁情况决定何时结束进行干燥。
产品检测与效果 在酸性条件下，硒与3，3'-二氨基联苯胺作用，生成黄色络合物(Se-DAB)，用分光
光度法测定。测定总硒和无机硒，用差减法求出有机硒含量。
溶液配制 (1)硒标准液准确称取2. 190g干燥的亚硒酸钠(优级纯)，溶于蒸馏水，添加80ml、48X的HBr，然后用蒸馏水稀释至1L，制备成含硒lg/L的标准硒贮备液或直接购买
7lg/L的硒标准液。临用时用蒸馏水稀释成lmg/kg的硒标准溶液。 (2)消化液称取10g钼酸钠，加150ml蒸馏水溶解，缓慢添加150ml浓硫酸，冷却，加入200ml 、70 % 72%高氯酸； (3)0. 5%的DAB 0. 5gDAB溶解于100ml新鲜制备的四氯甲烷溶液中。
样品的处理及测定 准确称取0. lOOOg本发明产品，置于烧瓶中，加入5ml消化液，接上冷凝装置，回流冷凝消化至样液呈无色透明为止。冷却后用超声振荡器(150瓦频率、20KHZ)处理30min，消化液转入200ml的烧杯，用大约20ml的蒸馏水洗净。用饱和的NaOH溶液调节上述消化液pH为7. O，然后用90%的甲酸调节pH至2 3，加入4ml、40%的盐酸羟胺还原过剩的氧化成分，最后将溶液定溶到50ml。取6支125ml的分液漏斗， 一支加入上述溶液10. Oml，另5支分别加入2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. Oml的硒标准溶液(lmg/kg)，各加蒸馏水至40ml，用甲酸调节pH2 3，加入4m1、0. 2M的EDTA-2Na以掩盖干扰离子，然后加2ml、0. 5X的DAB，摇匀，于6(TC水浴20min (光线暗淡的环境下)，取出，用浓氨水调节pH至7 7. 5，加入4. Oml甲苯，猛晃lmin，静置3 4min分层，然后将有机层通过脱脂棉滤到lcm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作空白)。用标准硒溶液的吸光度绘制标准曲线，由样品的吸光度，从标准曲线上查找、计算出样品中无机硒含量。 总硒含量测定称取1. OOOg本发明产品，加入50ml蒸馏水，小火微沸30min，抽滤得到滤液，定溶至50ml，然后按上述样品的测定方法测定总硒含量。
有机硒含量=总硒含量_无机硒含量
测定结果 按上述方法进行测定，有机硒含量^ 0. 1%，无机硒转化成有机硒的比例> 95%，甚至> 98% ;粗蛋白含量10% -50% ;依据国家大豆肽粉行业标准(QB/T2653-2004)测定的肽转化率(粗蛋白中小肽含量)>8% ;黄曲霉毒素〈30i!g/kg。与同含量无机产品辛辣味相比，本产品具有发酵香味。
权利要求
一种生产富硒酵母培养物的方法，所述方法包括(1)菌种筛选通过酵母在无机硒或有机硒培养基中的生长表现确定所用菌株；(2)利用(1)中确定的菌株进行菌种逐级扩大培养；(3)在含有无机硒或有机硒的液体培养基中用酵母菌进行液体发酵转化；(4)液体发酵后，将液体发酵液与固体培养基混合，进行固体发酵，所述固体发酵包括先进行固体有氧发酵，再进行固体厌氧发酵，并对酵母进行破壁；(5)对固体发酵产物进行干燥得到成品。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述酵母为热带假丝酵母或酿酒酵母。
3. 根据权利要求l的方法，其中所述无机硒为正四价无机硒或正六价无机硒，优选亚 硒酸钠；所述有机硒为蛋白硒、氨基酸硒或多糖硒。
4. 根据权利要求1的方法，其中所述液体培养基中无机硒或有机硒含量为0. 05% 0. 4%重量，且液体发酵转化时间为12 48小时。
5. 根据权利要求1的方法，其中所述固体发酵步骤中，将液体发酵液与固体培养基按 1 : 3 1. 5 : 1重量的比例混合。
6. 根据权利要求l的方法，其中所述固体培养基含有豆粕、棉粕、菜粕、花生粕、胡麻 粕、甜菜粕、麦麸、稻糠、次粉、木薯粉、大豆皮、玉米酒精糟、玉米或大米，或者其中一种或多 种的混合物。
7. 根据权利要求1的方法，其中所述固体有氧发酵进行16-36小时，且所述固体厌氧发 酵并对酵母进行破壁的过程在40 6(TC下进行6 24小时。
8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体培养基中无机硒或有机硒含量为 0. 2%重量，且液体发酵转化时间为48小时，其中所述固体发酵步骤中，液体发酵液与固体 培养基按l : 3重量的比例混合，其中所述固体有氧发酵进行36小时，且所述固体厌氧发 酵并对酵母进行破壁的过程在5(TC以下进行12小时。
9. 通过权利要求1所述的方法生产的富硒酵母培养物，所述富硒酵母培养物包含有机 硒0. 05% 0. 5%重量。
10. 权利要求9所述的富硒酵母培养物作为饲料的用途。
全文摘要
本发明涉及一种富硒酵母培养物生产方法。其特征在于选用并筛选耐受高硒的热带假丝酵母菌和酿酒酵母菌，通过液体-固体两相发酵方法进行生产。方法流程包括菌种筛选、菌种逐级扩大培养、液体发酵转化无机硒、固体有氧发酵与厌氧发酵破壁、干燥。干燥后的成品含有有机硒0.05％～0.5％。利用本发明技术无机硒转化成有机硒的比例在98％以上。本发明具有方法简单、生产成本低、产品质量好等特点，生产出的富硒酵母培养物兼有有机硒与益生饲料的双重作用，可用于畜禽水产饲料。
文档编号C12N1/18GK101792720SQ20101012227
公开日2010年8月4日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者潘军 申请人:广州市博善生物饲料有限公司