专利名称：病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，更具体地说是涉及一种由人类肿瘤抑制基因p53与腺病毒载体重组序列构建成的重组体。
背景技术：
随着分子生物学技术的进步，特别是基因工程技术的发展，恶性肿瘤的基因治疗成为人们研究的热点。目前，全球共有600多项基因治疗方案获准进入临床试验，有些治疗方案已获得了一定的疗效，初步显示了基因治疗的前景。
作为可用于基因治疗的各种载体，本身不具有任何治疗疾病的意义、无临床应用价值；而作为可用于各种治疗目的基因，由于导入靶细胞及在靶细胞内表达的难度，只具有潜在的治疗作用，而不具备实用的临床价值。只有将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体结合，通过后者介导，将目的基因导入靶细胞并表达，才能达到真正的临床治疗效果。因此，构建治疗基因与基因载体的融合序列是实现基因治疗的关键。
将目的基因的表达盒与载体进行融合常用的方法是在真核细胞中进行同源重组，过程复杂，费时费力。而使用在原核细胞(大肠杆菌)中实现同源重组、构建融合表达载体的新技术则可有效解决上述问题。
缺乏特异性、靶向性及高效性的基因转移载体一直是肿瘤基因治疗的一个难题。目前，用于基因治疗研究的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体等。腺病毒载体是常用的基因载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片断、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，既能感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点。但也存在不足之处，一是感染缺乏特异性，二是具有免疫原性。因此，对腺病毒载体进行存利去弊的改进是发展基因治疗的必由之路。研究表明，腺病毒载体E1或E3缺失区携带外源性基因时，可以实现目的基因的较长时间的表达，且可降低其免疫原性；逆转录病毒载体能携带外源性基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因稳定持久的表达，但逆转录病毒体外繁殖滴度低、转染效率低，只感染分裂期细胞。对染色体的随机整合，有致癌的危险性；其他可用于基因转移的病毒载体和非病毒载体均存在不同的利弊。
发明内容
本发明旨在将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体进行有机结合，而提供一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体，使得人类肿瘤抑制基因与病毒载体构成融合序列，使之在基因工程改造过的特定细胞中繁殖、生产，并可直接在真核细胞中表达，达到预防或/和治疗肿瘤的目的。
本发明的目的还在于提供该重组体的制备方法及其用于制备预防或/和治疗肿瘤药物的应用。
为实现上述目的，本发明提供一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体，该重组体是将由DNA克隆技术构建的病毒载体与人肿瘤抑制基因表达盒相结合，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中表达肿瘤抑制蛋白的融合序列。
该重组体的载体可以为DNA病毒或RNA病毒的任一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体，最优选载体为腺病毒载体。
所述人肿瘤抑制基因可以是具有对肿瘤抑制作用的基因中的任一种，其最优选基因为p53基因。
该重组体由腺病毒载体与p53基因构建而成，定义为重组p53腺病毒体，其融合序列为腺病毒5基因组序列右侧-ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848-腺病毒5基因组序列左侧其中1.腺病毒5基因组序列右侧和腺病毒5基因组序列左侧见腺病毒5基因组全序列(Genbank NoNC_001406)2.1-70腺病毒右侧臂(70位碱基位于腺病毒5基因组序列正向3328位)3.71-523Rous肉瘤病毒的LTR(启动子)4.524-6555’端非翻译区5.656-1837p53基因的编码序列6.1838-27333’端非翻译区(其中从2298开始为多聚腺苷酸尾poly A)7.2734-2848腺病毒左侧臂(2734位碱基位于腺病毒5基因组序列正向452位碱基)该重组体的基因表达盒是由启动子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸构成的特征序列，其上游为任一真核细胞启动子、原核细胞启动子或病毒启动子，下游为任何真核基因的多聚腺嘌呤核苷酸。
本发明的重组体是通过如下方法获得的，重组病毒载体是在原核细胞中同源重组获得的，首先是腺病毒与质粒pGT-1(含有腺病毒两侧反向重复序列)在大肠杆菌中同源重组获得重组体pGT-2，再与人工构建的“腺病毒右侧臂/启动子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸/腺病毒左侧臂”在大肠杆菌中同源重组获得重组体pGT-3，随后经内切酶PacI线性化去除原核质粒序列，获得重组p53腺病毒体。
实质上，该重组体可在任何原核细胞中以同源重组的方式获得。
根据上述方案，将PCR扩增腺病毒5两侧的LTR序列，分别引入PacI酶切位点。将两侧的LTR序列均克隆到pUC18载体中，构成重组载体pGT-1；将构建的pGT-1载体与腺病毒5基因组共转染大肠杆菌株BJ5183(赛百诺公司保存，保存号P-e012)，使腺病毒5基因组与pGT-1发生同源重组，阳性病毒克隆经扩增、PCR筛选和酶切鉴定，获得含有腺病毒5全基因组的重组载体pGT-2。
以5′ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC和5′ATATCTGCAGAATTCCAGCAC作为引物，通过PCR扩增人类肿瘤抑制因子p53基因，将扩增的全长p53基因(含有5′和3′端非翻译区序列)克隆到原核质粒pUC19，进行测序验证。随后，PCR分别扩增RSV(rous sarcoma virus)的LTR序列(含启动子)、BGH的PA序列和腺病毒E1区序列，并于一侧分别引入linker序列，测序验证。再次进行PCR反应时，将LTR和PA序列分别拼接到紧靠p53基因的5′和3′端。将腺病毒E1区及其上游序列分别拼接到p53基因的最外侧，构成p53复合基因(见图1)。
将构建好的重组载体pGT-2和p53复合基因共转染大肠杆菌株BJ5183，使二者发生同源重组。同上，阳性克隆经扩增、PCR筛选和酶切鉴定。获得重组载体pGT-3，该载体中含有腺病毒5大部分序列(其E1区及上游部分序列被p53基因表达盒置换)。重组载体pGT-3经PacI酶切线性化，去除来源于pUC18的载体序列，转染293细胞(赛百诺公司冻存，保存号E-393)培养。在细胞内包装成含有腺病毒顺式活化序列(cis-acting sequence)与LTR的启动子操纵的人肿瘤抑制基因p53。组建成转染效率高、可操作性强、由单启动子控制的重组p53腺病毒体。
该重组p53腺病毒体具有下列特点它是由腺病毒载体和p53基因人工表达盒两部分构成，1、结构特点其本质是一个活的重组腺病毒体，不同于现有的化学合成药物、中药、基因工程药物，是直接实现目的基因的体内表达，生物学活性高，可有效达到治疗作用；腺病毒载体能携带较大的基因、转染率高、可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低，尤其是经改建后的腺病毒载体免疫原性大大下降，使目的基因易于在机体内稳定、持久表达；p53基因人工表达盒是用腺病毒载体单启动子直接调控p53基因的表达，且有完整的多聚腺苷酸加尾信号，从而构成一个完整的表达盒(expression cassette)，可调控p53基因在靶细胞中高效表达。
2、应用特点该重组p53腺病毒体为广谱抗瘤药，具有对各种恶性肿瘤的治疗作用。II期临床实验显示，该重组p53腺病毒体对头颈部鳞癌、肺癌等十多种肿瘤具有明显的治疗作用；该重组p53腺病毒体具有预防肿瘤发生的独特作用。I期临床试验及术后3年随访表明，该重组p53腺病毒体可预防喉癌等肿瘤病人的术后复发，起到肿瘤疫苗的作用。
利用本发明的重组p53腺病毒体可制备治疗各种恶性肿瘤的药物，并可制备预防肿瘤的发生和手术切除后的肿瘤再生的药物。
本发明的重组p53腺病毒体还可用于制备进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的药物。
本发明利用所制备的重组p53腺病毒体，先转染到基因工程改造过的特定细胞中培养、繁殖，浓缩纯化成可用于临床的重组腺病毒p53抗癌注射液。
其中本发明实验所用的293细胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，1997年6月13日从ATCC订购)来源于经5型腺病毒(Ad5)DNA转化人胚胎肾上皮细胞获得，含有Ad5 5′端的11％的基因组(包括E1a)。该细胞对腺病毒的感染和生长是高度许可的。
应用该重组p53腺病毒体对12例中、晚期喉癌病人进行里I期临床实验，治疗后并随访31-36个月。结果显示，该重组p53腺病毒体使用安全，全部12例病人无肿瘤复发。目前，临床上中晚期喉癌病人3年生存期只有44％，手术后6-12个月的复发率约20％。本发明的实验结果显示，该重组p53腺病毒体具有治疗和预防肿瘤复发的双重作用。从2001年开始进行II期临床实验，已显示良好的治疗作用。实施例附图9至13的结果显示，一些对常规治疗方法(化疗和放疗)无效的病人，使用本发明的重组p53腺病毒体仍具有良好的治疗作用。
本发明的贡献在于，它利用人类肿瘤抑制基因p53能抑制多种肿瘤细胞生长的特点，将其克隆到腺病毒E1-株，通过瘤体注射，使腺病毒有效地将p53基因导入肿瘤组织，表达出P53蛋白后，抑制肿瘤组织的生长，使肿瘤细胞出现生长阻滞或凋亡，从而达到抑制肿瘤的目的。该发明同时也解决了由于P53蛋白半衰期短(约20分钟)、不稳定、无法体外制备成为重组基因工程产品的问题，即实现了p53基因的肿瘤治疗。
该重组p53腺病毒体利用腺病毒携带人类肿瘤抑制基因p53，直接在肿瘤细胞中表达，从而解决了由于P53蛋白不稳定、无法用基因工程的方法体外制备成重组基因工程产品的问题。用腺病毒以及腺相关病毒进行癌症治疗，病人可在体内持续、高效表达P53蛋白，并在蛋白质分子修饰程序上，如蛋白质磷酸化、蛋白质折叠以及多聚化等方面都具有与体内真核生物相同的特性。本发明的重组p53腺病毒体可直接介导p53基因在真核细胞中表达，也就是说可以直接导入实体瘤部位让其表达，使受治疗者自身变成一个可生产人类肿瘤抑制因子P53蛋白的“源泉”。这种方法实现将外源p53基因的体内转移并在病人瘤体内高效表达而达到治疗目的，使得肿瘤及其它疾病的基因治疗成为现实。
图1是本发明的重组p53腺病毒体的构建过程示意图。
图2是本发明的重组p53腺病毒体的技术路线框图。
图3是重组p53腺病毒体经多次传代后，以5′CCACGACGGTGACA CGCTTC和5′CAAGCAAGGGTTCAAAGAC为引物，以p53cDNA为模版，通过PCR扩增得到的p53基因的琼脂糖凝胶电泳图，以鉴定其稳定性。
图4是重组p53腺病毒体(赛百诺公司冻存，保存号No-1，下同)感染293细胞后36小时，经细胞裂解、提取病毒DNA经PCR鉴定的琼脂糖凝胶分析结果。
图5是重组p53腺病毒体感染293细胞后36小时，经细胞裂解、提取后经Western blot分析结果。
图6是重组p53腺病毒体不同剂量对Hep-2细胞的杀伤效应的曲线示意图。
图7是重组p53腺病毒体对Hep-2细胞生长的抑制作用的曲线示意图。
图8是重组p53腺病毒体感染Hep-2细胞36小时后的光镜照片。
图9是重组p53腺病毒体对临床鼻咽癌病人治疗作用(II期临床)的CT照片。
图10是重组p53腺病毒体对临床肺癌病人治疗作用(II期临床)的CT照片。
图11是重组p53腺病毒体对临床甲状腺癌病人治疗作用(II期临床)的CT照片。
图12是重组p53腺病毒体对临床宫颈癌病人治疗作用(II期临床)的CT照片。
图13是重组p53腺病毒体对临床食道癌病人治疗作用(II期临床)的CT照片。
具体实施例方式
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。
实施例1如图1和图2所示，构建重组p53腺病毒体及鉴定
1、已发表的p53基因cDNA全序列，设计合成两段引物5′ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC和5′ATATCTGCAGAATTCCAGCAC作为引物，两端分别引入linker序列。以HeLa细胞cDNA为模板，经PCR方法扩增得到人p53基因，其中，反应条件为第一循环94℃变性4分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；以后各循环94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环。由此得到大量的p53基因，用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到p53基因全长，片段纯化后再用此酶切割p53基因，插入到同样酶切的pUC19载体中测序，测得编码区的碱基序列和和推导的氨基酸序列(与GenBank Acc XM_058834一致)，随后酶切回收。
2、PCR反应扩增LTR和PA序列，引物分别为5′TCTGACATGCGATGTCGACTCG，5′CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG；5′TCACAGAGTGCATTGTGAGGG，5′GCTCTAGCGTGGGGATCCC。分别于5′引物和3′端引物引入linker序列。同上的退火条件下，PCR扩增LTR和PA序列，纯化后克隆测序验证。
3、PCR反应分开扩增腺病毒的E1序列，反应条件同上，两端引物分别引入Bam HI和Eco RI酶切位点，扩增后测序验证。
4、将1所得序列分别与2所得的两条序列进行PCR反应，反应条件同前，得到PCR拼接产物LTR-p53-PA，进一步测序验证。
5、将3所得序列与4所得序列LTR-p53-PA经T4 DNA粘接酶粘接，获得p53复合基因。
6、PCR反应分别扩增腺病毒两端IRT序列，反应条件同上，测序验证后分别将两段序列克隆到pUC18载体中构成重组载体pGT-1。
7、提取野生型腺病毒5(ATCC-VR-5，腺病毒株75，滴度10(6.75)TCID(50)/ml)DNA，与重组载体pGT-1共转染大肠杆菌BJ5183，经4℃孵育30分钟，42℃热休克50秒钟，再在4℃孵育1分钟，加1ml LB培养液1小时，将温育的工程菌转入含安卞青霉素的琼脂培养板，24小时后，用灭菌牙签挑取单个细菌克隆，然后放入干净的含有LB的培养瓶中，24小时后，按常规方法提取质粒，用PacI切割筛选，获得阳性克隆为pGT-2(含有Ad5全序列)。
8、将p53复合基因与重组载体pGT-2共转染大肠杆菌BJ5183，同上方法培养，筛选和鉴定，获得阳性克隆pGT-3，含有腺病毒全基因组序列及插入的p53基因表达盒，再用PacI酶切，使之线性化，去除来源于pUC18的载体序列。
9、将分离的阳性质粒线性化后经CsCl2纯化，经CaCl2方法转染293细胞。7天后，收集细胞，1000rpm离心15分钟，弃上清，细胞经37℃-80℃冻融，裂解三次，4000rpm离心30分钟，取上清，弃沉淀，上清经二次感染，扩增病毒，以同样方法裂解病毒，上清经CsCl2密度梯度离心，条件为4℃60000rpm，16小时。经7号注射针头取重组腺病毒体分离带。用SpectraMW6000透析袋在N1H缓冲液中透析4小时，整个过程保持4℃。取出病毒液，用0.25μm的滤膜过滤除菌，分装。于-80℃保存，一部分作空斑形成试验及病毒颗粒含量测定。
10、重组p53腺病毒体的结构稳定性鉴定，经多次传代后，提取其基因组DNA，以p53基因两端5′CCACGACGGTGACACGCTTC和5′CAAGCAAGGGTTCAAAGAC为引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果见图3；以重组p53腺病毒体表达装置两侧的腺病毒臂5′TTT CTC AGG TGT TTT CCG C和5′CATCGT ACC TCA GCA CCT TC为引物，PCR鉴定结果见图4。以上结果均表明重组p53腺病毒体经多次传代后结构稳定。
12、重组p53腺病毒体介导的p53基因在Hep-2和H1299细胞的表达鉴定。用重组p53腺病毒体感染293细胞36小时后，常规方法裂解细胞，以P53蛋白特异性抗体进行western blot分析，结果见图5。
13、重组p53腺病毒体对Hep-2细胞作用的时间与剂量关系。重组p53腺病毒体感染Hep-2细胞36小时后，分别研究其不同剂量和不同作用时间对Hep-2细胞的杀伤作用。以苔酚蓝染色记数死亡细胞数，结果见图6和图7。
实施例2重组p53腺病毒体对肿瘤细胞杀伤作用将重组p53基因腺病毒常规方法转染培养的Hep-2细胞。各组细胞数相同，实验分以下各组1.空白对照；2.MOI 200；3.MOI 150；4.MOI 100；5.MOI 50；6.MOI 10。7.GFP virus MOI 200；8.GFP virus MOI 150。转染后继续培养36小时，光镜观察，可见在MOI＞50时，均可见到重组p53腺病毒体对Hep-2细胞的杀伤作用，且随着剂量的增加杀伤作用更加明显。光镜观察细胞出现明显的固缩变小等凋亡表现，如图8所示。
实施例3重组p53腺病毒体的临床治疗作用(鼻咽癌)如图9所示，重组p53腺病毒体在国家药品监督管理局指定的医院进行II期临床实验(下同)，图9显示为一位鼻咽癌患者在接受重组重组p53腺病毒体治疗前后的CT照片，左图为治疗前的癌肿块，右图为接受治疗后(肿块缩小87％，伴瘤内出现坏死)。目前已有超过60例患者接受了II期临床实验，疗效确凿。
实施例4重组p53腺病毒体的临床治疗作用(肺癌)如图10所示，II期临床实验。重组p53腺病毒体在II期临床实验中对肺癌的治疗作用。女性左肺腺癌患者、左胸腔积液，伴肝转移、骨转移和脑转移。经多次抽液和化疗后，胸腔中仍有大量积液出现。病人接受胸腔内注射重组p53腺病毒体一个月后，胸腔内积液完全消失。
实施例5重组p53腺病毒体的临床治疗作用(甲状腺癌)如图11所示，II期临床实验。重组p53腺病毒体在II期临床实验中对甲状腺癌的治疗作用。女性甲状腺癌患者，术后1年局部复发，右上颈淋巴转移，病理诊断为低分化鳞癌，经放疗-化疗-热疗联合治疗1个年后无效，颈前肿瘤压迫气管，呼吸困难。随后接受重组p53腺病毒体的治疗，共注射8次，肿块明显缩小(缩小48％)。
实施例6重组p53腺病毒体的临床治疗作用(宫颈癌)如图12所示，II期临床实验。重组p53腺病毒体在II期临床实验中对宫颈癌的治疗作用。宫颈癌患者，病理诊断为鳞癌。接受重组p53腺病毒体的治疗(共注射8次)后，肿块明显缩小(约91％，)，三个月后复查，肿块完全消失。
实施例7重组p53腺病毒体的临床治疗作用(食道癌转移)如图13所示，II期临床实验。重组p53腺病毒体在II期临床实验中对食道癌淋巴结转移的治疗作用。食道癌左锁骨上淋巴结转移患者，病理诊断为鳞癌。经放疗后无效，接受重组p53腺病毒体的治疗后，共注射8次，肿块明显缩小(缩小29％，)。
权利要求
1.一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体，其特征在于，该重组体是由DNA克隆技术构建的病毒载体与人肿瘤抑制基因表达盒相结合，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中表达肿瘤抑制蛋白的融合序列。
2.如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体的载体可以为DNA病毒或RNA病毒的任一种。
3.如权利要求2所述的重组体，其特征在于，该重组体的载体是腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体。
4.如权利要求1所述的重组体，其特征在于，所述人肿瘤抑制基因可以是具有对肿瘤抑制作用的基因中的任一种。
5.如权利要求4所述的重组体，其特征在于，所述人肿瘤抑制基因为p53基因。
6.如权利要求1所述的重组体，其特征在于，它是由腺病毒载体与p53基因构建而成，其融合序列为腺病毒5基因组序列右侧-ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848-腺病毒5基因组序列左侧其中1)腺病毒5基因组序列右侧和腺病毒5基因组序列左侧见腺病毒5基因组全序列(Genbank NoNC_001406)2)1-70腺病毒右侧臂(70位碱基位于腺病毒5基因组序列正向3328位)3)71-523Rous肉瘤病毒的LTR(启动子)4)524-6555’端非翻译区5)656-1837p53基因的编码序列6)1838-27333’端非翻译区(其中从2298开始为多聚腺苷酸尾poly A)7)2734-2848腺病毒左侧臂(2734位碱基位于腺病毒5基因组序列正向452位碱基)
7.如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体的基因表达盒是由启动子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸构成的特征序列。
8.如权利要求7所述的重组体，其特征在于，所述基因表达盒的上游为任一真核细胞启动子、原核细胞启动子或病毒启动子，下游为任何真核基因的多聚腺嘌呤核苷酸。
9.如权利要求1所述的重组体，其特征在于，该重组体是在原核细胞中同源重组获得的，首先是腺病毒与质粒pGT-1(含有腺病毒两侧反向重复序列)在大肠杆菌中同源重组获得重组体pGT-2，再与人工构建的“腺病毒右侧臂/启动子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸/腺病毒左侧臂”在大肠杆菌中同源重组获得重组体pGT-3，随后经内切酶PacI线性化去除原核质粒序列，获得重组p53腺病毒体。
10.如权利要求9所述的重组体，其特征在于，该重组体在任何原核细胞中以同源重组的方式获得。
11.如权利要求1所述的重组体用于制备治疗各种恶性肿瘤的药物。
12.如权利要求1所述的重组体用于制备预防肿瘤的发生和手术切除后的肿瘤再生的药物。
13.如权利要求1所述的重组体用于制备进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的药物。
全文摘要
一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体及其应用，该重组体是将由DNA克隆技术构建的病毒载体与人肿瘤抑制基因表达盒相结合，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中表达肿瘤抑制蛋白的融合序列。本发明将腺病毒载体与人p53基因在原核细胞(E.coli)中同源重组，获得腺病毒载体与人p53基因表达盒构建的重组p53腺病毒体。其人p53基因表达盒是由启动子－p53cDNA－多聚腺嘌呤核苷酸构成的特征序列。使用本发明的重组p53腺病毒体，可制备成临床级基因治疗制品，用于治疗和预防人类各种恶性肿瘤。
文档编号C12N15/31GK1401778SQ02115228
公开日2003年3月12日 申请日期2002年5月8日 优先权日2002年5月8日
发明者彭朝晖, 张晓志 申请人:彭朝晖, 张晓志