专利名称：一种重组人b淋巴细胞刺激因子表达载体的构建、dna免疫制备单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真核表达载体，特别是pcDNA3/hBLyS真核表达载体。本发明还涉及该载体应用于制备单克隆抗体以及所制备单克隆抗体的应用。
(二)背景说明BLyS(B lymphocyte stimulator)是肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)家族的一个新成员，它含有285个氨基酸，是II型跨膜蛋白。BLyS主要由T淋巴细胞和树突状细胞合成，其受体仅位于B淋巴细胞膜表面。
BLyS被不同的研究小组分别命名为THANK(TNF homologue that activatesapoptosis，nuclear factor κB，and c-jun NH2-terminal kinase)、TALL-1(TNF andapoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)、zTNF4、BAFF(B cellactivating factor belonging to the TNF family)等。BLyS对保持生发中心B淋巴细胞的增生和延长成熟B淋巴细胞的存活发挥重要作用。BLyS转基因小鼠表现出外周血B淋巴细胞数量增加、B淋巴细胞存活时间延长以及血浆IgM、IgG、IgA、IgE、IgD显著增加等表现，5个月小鼠出现免疫复合物沉积在肾脏和蛋白尿现象。而动物实验证明，BLyS的过度表达可以导致自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)，而用抗鼠的BLyS抗体可以阻断BLyS分子与其受体的结合，减轻模型鼠SLE的症状。
采用抗hBLyS单克隆抗体研究BLyS与人类自身免疫性疾病的关系，以及探讨阻断BLyS与B淋巴细胞膜上受体结合从而达到抑制B淋巴细胞活化的目的等方面的研究越来越受到人们重视，并且将成为治疗自身免疫性疾病新途径研究的热点。BLyS分子主要存在于激活的T淋巴细胞膜上，要想得到纯化的抗原免疫动物研制抗体十分困难。
(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组质粒载体，该载体含有人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)基因。
本发明的另一目的在于上述载体在制备抗hBLyS的单克隆抗体的应用。
本发明的另一目的在于上述单克隆抗体在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物和在制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂的应用。
本发明构建含全长hBLyS基因的真核表达质粒，用基因免疫制备抗hBLyS单克隆抗体。
本发明全长hBLyS基因的获得是分离健康人外周血淋巴细胞，提取总RNA，以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，设计合成一对引物，然后进行常规PCR扩增，取少量PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定。
本发明采用的真核表达载体为pcDNA3，采用分子克隆方法将hBLyS目的基因插入pcDNA3，转化大肠杆菌，筛选重组子。
本发明用此pcDNA3/hBLyS免疫BALB/c鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA法筛选阳性克隆，用免疫印迹和流式细胞技术进一步鉴定抗体的特异性，结果表明，筛选出的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合IFN-γ激活的人T淋巴细胞膜表面BLyS蛋白的膜外区。
本发明的目的是获得pcDNA3/hBLyS重组质粒DNA，并以此制备能够特异性结合人T淋巴细胞上BLyS蛋白膜外区的单克隆抗体——抗hBLyS单克隆抗体。
图1为hBLyS的核苷酸和氨基酸序列；图2为hBLyS cDNA PCR产物凝胶电泳；图3为重组质粒pcDNA3/hBLyS的酶切鉴定；图4为重组质粒pcDNA3/hBLyS序列测定结果；图5为单克隆抗体特异性的Western blot分析；
图6为单克隆抗体与INF-γ激活的人外周血CD3+细胞结合的FACS结果。
图2中PCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片段与预期的一致，约为876bp(含保护碱基和酶切位点)。
图3中用重组质粒转化大肠杆菌DH5a，然后把大肠杆菌DH5a铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，筛选重组子后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，可见经EcoR I和XhoI双酶切后，成为两个片段，分别为约5.4kb和约864bp的目的基因片段。
重组表达质粒测序结果如图4所示，重组质粒中含有目的基因片段，对阅读框架分析，证明该重组质粒已正向插入了目的基因。。
(五)实施例以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1、hBLyS cDNA的获得分离健康人外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，用5’端和3’端引物进行PCR扩增，所产生的条带均位于对照DNA Marker的900bp和800bp之间，与预期的876bp目的基因片段大小接近(含酶切位点和保护碱基)，用此对引物重复进行多次PCR扩增均显示出特异性条带，表明我们设计的引物是合理的，扩增所得条带是我们预期的目的基因片段。
实施例2、pcDNA3/hBLyS重组质粒的构建hBLyS基因的PCR扩增产物经EcoR I和XhoI双酶切后，插入pcDNA3的EcoR I和XhoI双酶切窗口，得到含hBLyS基因的重组质粒，转化至大肠杆菌后培养，从氨苄青霉素LB平板随机挑取10个菌落，震荡摇菌过夜扩增重组子DNA，酚/氯仿抽提和琼脂糖电泳初筛，有6个重组子位于空质粒pcDNA3的后方，再分别扩增此6个重组子DNA进一步鉴定。
将筛选到的重组子，扩增后，提取质粒DNA，用EcoR I和Xho I双酶切产生2个条带，大小分别约为5.4kb和864个bp。
实施例3、抗人BLyS单克隆抗体的制备(1)DNA免疫BALB/c鼠大量纯化pcDNA3/hBLyS质粒，选取3只健康雌性5周龄的BALB/c小鼠，直接将质粒注入BALB/c小鼠股四头肌进行DNA免疫，每3周注射1次，共免疫3次，末次免疫后4周，用ELISA检测小鼠血清中抗体的效价。(2)细胞融合、阳性克隆的筛选和亚克隆 取效价高的BALB/c鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，阳性克隆的筛选采用ELISA，然后采用显微操作技术，将阳性克隆连续3次亚克隆，最后达到单克隆。(3)ELISA 分别我们用表达的谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作为包被抗原，取与GST-hBLyS融合蛋白反应，而与GST蛋白不反应的培养上清作为阳性结果。(4)蛋白印迹(Western blot)分析 分别用我们表达的GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作为抗原，取与GST-hBLyS融合蛋白反应，而与GST蛋白不反应的单克隆抗体作为阳性结果。(5)流式细胞技术(flow cytometry，FACS)从人外周血分离淋巴细胞，用IFN-γ激活3天后，加入单克隆化后的杂交瘤细胞培养上清孵育，4℃作用1小时，用预冷的PBS洗三次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG，4℃作用1小时，用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测培养上清中单克隆抗体与淋巴细胞表面BLyS的结合情况，取结合率高的单克隆抗体为阳性结果。(6)结果用大量纯化的pcDNA3/hBLyS重组质粒免疫BALB/c鼠，融合鼠脾细胞和杂交瘤细胞；采用ELISA鉴定和显微操作挑选将阳性克隆连续克隆3次，得到能分泌抗hBLyS单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
通过以下方法进行抗hBLyS单克隆抗体的特异性鉴定ELISA结果 杂交瘤细胞株的培养上清均与GST-hBLyS融合蛋白反应，与GST蛋白不反应。说明单克隆抗体是针对hBLyS蛋白的单克隆抗体。Western blot结果 分别用GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作抗原，经Western bolt鉴定，结果在相对分子质量为58000处(融合蛋白)有1条抗原-抗体结合的条带，而相对分子质量为26000处(GST蛋白)无特异性条带。进一步证明杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体是特异性结合hBLyS的单克隆抗体。FACS结果 用IFN-γ激活的人外周血淋巴细胞作抗原，与杂交瘤细胞的培养上清孵育1小时后，FACS双标结果显示，杂交瘤细胞株的培养上清与激活的人外周血CD3+T细胞结合率达到6.3％(对照组为0.6％)，说明此杂交瘤细胞株分泌的抗体是特异性针对T淋巴细胞膜上hBLyS蛋白的细胞外段。实施例4系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞表达BLyS的变化抽取健康人和系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血，每人15ml，肝素(50U/ml)抗凝，用RPMI-1640培养液将抗凝血做1∶1稀释。采用密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640洗涤三次后，用10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为1×106/ml，与杂交瘤细胞的培养上清孵育，4℃作用1小时，用预冷的PBS洗三次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG，4℃作用1小时，用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测BLyS阳性淋巴细胞分辨率，结果见表1。SLE患者外周血表达BLyS的淋巴细胞百分率明显高于正常人(P＜0.05)。表1 SLE患者外周血BLyS+淋巴细胞的变化(％)
1 M D D S T E R E Q S R L T S C L 161 ATG GAT GAC TCC ACA GAA AGG GAG CAG TCA CGC CTT ACT TCT TGC CTT 4817 K K R E E M K L K E C V S I L P 3249 AAG AAA AGA GAA GAA ATG AAA CTG AAG GAG TGT GTT TCC ATC CTC CCA 9633 R K E S P S V R S S K D G K L L 4897 CGG AAG GAA AGC CCC TCT GTC CGA TCC TCC AAA GAC GGA AAG CTG CTG 14449 A A T L L L A L L S C C L T V V 64145 GCT GCA ACC TTG CTG CTG GCA CTG CTG TCT TGC TGC CTC ACG GTG GTG 19265 S F Y Q V A A L Q G D L A S L R 80193 TCT TTC TAC CAG GTG GCC GCC CTG CAA GGG GAC CTG GCC AGC CTC CGG 24081 A E L Q G H H A E K L P A G A G 96241 GCA GAG CTG CAG GGC CAC CAC GCG GAG AAG CTG CCA GCA GGA GCA GGA 28897 A P K A G L E E A P A V T A G L 112289 GCC CCC AAG GCC GGC CTG GAG GAA GCT CCA GCT GTC ACC GCG GGA CTG 336113 K I F E P P A P G E G N S S Q N 128337 AAA ATC TTT GAA CCA CCA GCT CCA GGA GAA GGC AAC TCC AGT CAG AAC 384129 S R N K R A V Q G P E E T V T Q 144385 AGC AGA AAT AAG CGT GCC GTT CAG GGT CCA GAA GAA ACA GTC ACT CAA 432145 D C L Q L I A D S E T P T I Q K 160433 GAC TGC TTG CAA CTG ATT GCA GAC AGT GAA ACA CCA ACT ATA CAA AAA 480161 G S Y T F V P W L L S F K G G S 176481 GGA TCT TAC ACA TTT GTT CCA TGG CGG CTC AGC TTT AAA GGG GGA AGT 528177 A L E E K E N K I L V K E T G Y 192529 GCC CTA GAA GAA AAA GAG AAT AAA ATA TTG GTC AAA GAA ACT GGT TAC 576193 F F I Y G Q V L Y T D K T Y A M 208577 TTT TTT ATA TAT GGT CAG GTT TTA TAT ACT GAT AAG ACC TAC GCC ATG 624209 G H L I Q R K K V H V F G D E L 224625 GGA CAT CTA ATT CAG AGG AAG AAG GTC CAT GTC TTT GGG GAT GAA TTG 672225 S L V I L F R C I Q N M P E T L 240673 AGT CTG GTG ATT TTG TTT CGA TGT ATT CAA AAT ATG CCT GAA ACA CTG 720241 P N N S C Y S A G I A K L E E G 256721 CCC AAT AAT TCC TGC TAT TCA GCT GGC ATT GCA AAA CTG GAA GAA GGA 768257 D E L Q L A I P R G N A Q I S L 272769 GAT GAA CTC CAA CTT GCA ATA CCA AGA GGA AAT GCA CAA ATA TCA CTG 816273 D G D V T F F G A L K L L * 286817 GAT GGA GAT GTC ACA TTT TTT GGT GCA TTG AAA CTG CTG TGA 858
权利要求
1.一种重组质粒载体，其特征是该载体含有人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)基因。
2.如权利要求1所述的载体，其特征是该载体为真核表达载体。
3.如权利要求2所述的载体，其特征是该载体为pcDNA3/hBLyS。
4.权利要求2所述的载体在制备抗hBLyS的单克隆抗体中的应用。
5.权利要求4所述的单克隆抗体在制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物的应用。
6.权利要求4所述的单克隆抗体在制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组质粒载体，该载体含有人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)基因，本发明还公开了上述该表达载体在单克隆抗体制备中的应用。该单克隆抗体可以应用于制备治疗B淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病药物，以及应用于制备人外周血细胞上BLyS表达以及血浆中BLyS浓度的检测剂。
文档编号C12P21/08GK1401777SQ02115269
公开日2003年3月12日 申请日期2002年5月24日 优先权日2002年5月24日
发明者张志方, 张春艳 申请人:张志方, 张春艳