专利名称：可高产果胶酶的塔宾曲霉及在固态发酵生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可高产果胶酶的塔宾曲霉(Aspergillustubingensis Moss)新菌株及其在果胶酶固态发酵中的应用。
背景技术：
近几十年来，由于人口的迅速增加和生活水平的不断提高，对肉禽蛋的需求量也在逐年提高。饲料是畜禽的食物，如何提高饲料的利用率和动物的生长性能、如何保护环境和保障农牧业的持续、健康、稳定发展已成为人类迫切需要解决的重要问题。
由微生物发酵生产的饲用复合酶是一类无毒、无害、无污染残留的绿色饲料添加剂，在饲料中添加适量的与饲料日粮相匹配的酶制剂能明显提高饲料利用率，减少对环境的污染。
果胶酶是一种用于饲料的重要的酶制剂，能明显提高饲料的消化利用率，同时还可以减少畜禽的死亡率。在动物饲养早期能起到替代金霉素的作用。
然而，迄今为此，还没有一种用于果胶酶制备的优良的微生物菌株。目前工业上用于果胶酶制备的微生物菌株主要是黑曲霉，在1993年以前，关于高产果胶酶的黑曲霉研究报道很多，但是发酵酶活力上升有限，最高值在100u/g左右(pH5.5测定值)，以后基本没有突破。因此工业上迫切需要一种可高产果胶酶的微生物新菌株。
发明内容要解决的问题本发明的目的是提供一种可高产果胶酶的微生物新菌株和该菌株在果胶酶固态发酵生产中的应用。
技术方案本发明发明人从发霉的桔子皮分离到一株曲霉菌，以此作为出发菌株，采用诱变剂处理菌体细胞，获得了本发明的新菌株。具体诱变选育过程如下1.出发菌的筛选从发霉的桔子皮取样制成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的菌悬液，接种在固体马铃薯琼脂培养基上，(固体马铃薯琼脂培养基配比为去皮马铃薯100-130克、干酪素4-6克、小麦粉15-24克、琼脂16-20克、蒸馏水1000ml、青霉素3-6ppm，pH 6.8-7.0，121℃高压灭菌15-20分钟)28-32℃恒温培养5天，在10-5稀释度的琼脂平板上分离获得1株曲霉。以此为出发菌株，进行后续的诱变选育。
2.诱变选育对上述出发菌进行诱变筛选和摇瓶培养，测定分析其产酶能力。主要分析指标是果胶酶。
诱变选育过程出发菌株→紫外诱变→γ射线诱变→NTG处理孢子→挑选单菌落。
菌落的筛选和产酶性能测定依据下列方法挑选30-50个单菌落，做摇管试验，测定产酶能力→选择2-3株，摇瓶试验-→选择1株。
紫外灯的功率为15W，照射距离为20cm，照射时间为10分钟。用无菌生理盐水制备孢子菌悬液，菌悬液的孢子数在106-107个/ml之间，液层的厚度为0.3-0.5cm。照射后在增菌液中静息培养6-10小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养5天，挑选单菌落，用于下一步诱变。
γ射线来源于Co60，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，照射剂量为600-800居里。诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养5天，挑选单菌落，用于下一步诱变。
NTG药物诱变剂的浓度为150-200ppm，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，作用时间为20-30分钟，作用温度为30-40℃。诱变后在增菌液中静息培养6-10小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养5天，挑选单菌落，用于下一步诱变。
以第一轮循环获得的高产菌作为出发菌，再次进行复合诱变、筛选，如此重复3次，最终获得了可高产果胶酶的突变菌株数十株，其中优选的是菌株Mafic-003，其固态发酵干曲的果胶酶活力为120u/g(pH为5.5)。在pH值为2.5-4.2的范围内，果胶酶性能稳定，酶活力保持在250u/g以上。
固体斜面培养基配方NaNO30.2-0.4％、KCl 0.03-0.06％、KH2PO40.08-0.12％、FeSO40.001-0.002％、MgSO4 0.03-0.06％、蔗糖2.0-3.5％、琼脂1.8--2.0％、pH值6.6-6.8。培养温度28--30℃，培养时间5-6天。孢子呈黑色，斜面菌种在4℃条件下保藏，6个月转接一次。
增菌培养液配方NaNO30.2-0.4％、KCl 0.03-0.06％、KH2PO40.08-0.12％、FeSO40.001-0.002％、MgSO40.03-0.06％、蔗糖2.0-3.5％、pH值6.6-6.8。
按照中国专利法和其实施细则的规定，本发明的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis Moss)Mafic-003新菌株已于2002年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 0826。
通过对数十株可高产果胶酶的菌株进行研究，发现所有这些高产突变株都具有如下特征a.菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃6天直径45-60毫米，平坦或接近平坦，边缘具有白色的菌丝体，菌落背面带黄色。
b.质地丝绒状或稍带絮状，分生孢子遏黑色。
c.分生孢子梗发生于基质，孢梗茎呈黄色或黄遏色。
因此，本发明菌株包括可高产果胶酶的属于塔宾曲霉(Aspergillustubinensis Moss)的微生物菌株。尤其是具有以下特征的菌株a.菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃6天直径45-60毫米，平坦或接近平坦，边缘具有白色的菌丝体，菌落背面带黄色。
b.质地丝绒状或稍带絮状，分生孢子遏黑色。
c.分生孢子梗发生于基质，孢梗茎呈黄色或黄遏色。
本发明的微生物菌株还包括所述菌株的可高产果胶酶的塔宾曲霉突变体、变异体或其各种后代。本发明最优选的菌株是本发明最优选的菌株是CGMCC 0826。
本发明在进行果胶酶活力的测定(pH 5.5)中采用了以下方法1.酶活定义在实验条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个酶活单位u。
2.试剂缓冲液称取三水乙酸钠23.14g(精确至0.01g)，加入冰乙酸1.7ml(精确至0.01ml)。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值，如果pH值偏离5.5，再用0.1mol/L的乙酸溶液或0.1mol/L的乙酸钠溶液调节至5.5。
底物溶液称取1.00克果胶(Fluka76280或Sigma P9135)，用pH5.5的缓冲液溶解，磁力搅拌2小时，定容至100ml。储藏在4℃冰箱内，有效期2天。
DNS试剂用400ml蒸馏水溶解3.15克3，5--二硝基水杨酸，逐步加入200mlNaOH溶液(含20克NaOH)，同时不断搅拌。温水浴(不超过48℃)，同时不断搅拌，直到溶液透明清澈。再逐步加入91克四水酒石酸钾钠、2.5g苯酚和2.5g无水亚硫酸钠，同时不断搅拌。温水浴(不超过48℃)，直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，保存在棕色瓶中。5天后可以使用，有效期为6个月。
3.标准曲线制备标准一水D-半乳糖醛酸溶液。
溶解1.0克一水半乳糖醛酸，定容至100ml，获得浓度为10mg/ml的半乳糖醛酸溶液。然后用缓冲液作系列稀释，配制浓度为0、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml和0.7mg/ml的标准溶液。吸取2.0ml标准溶液和2.0ml蒸馏水，加入到试管中。震荡，加入4mlDNS试剂，震荡、蒸煮5分钟。然后迅速用自来水冷却。再用蒸馏水定容至20ml。震荡摇匀，用Whatman 6号滤纸过滤。取滤液，以浓度为0的反应液(标准空白样)作为基准，调零。在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。每次更换DNS试剂，标准曲线需要重新绘制。
4.酶活测定精确称取1.000克样品用缓冲液溶解酶样，稀释至适当浓度。
酶样吸光度AX吸取2.0ml酶稀释液，加入到试管中，加入2.0ml果胶底物溶液，在40℃平衡，震荡。在40℃精确水浴30分钟。加入4mlDNS试剂，混合。用帽塞盖住试管。在沸水中精确保温5分钟。然后，迅速用自来水冷却以终止反应。再蒸馏水定容至20ml。用Whatman 6滤纸过滤或者在3000rpm条件下离心10分钟。取上清液，以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度(吸光度在0.15-0.7之间，如果超过此范围，重新确定稀释度。)。测定值做2个重复，取平均值。(重复值之间的相对误差不超过8.0％，否则重新测定。)酶空白样吸光度AO吸取2.0ml果胶溶液，在40℃精确保温30分钟。加入4mlDNS试剂，震荡。加入2.0ml酶的稀释液，混合。在沸水中精确蒸煮5分钟。然后迅速用自来水冷却以终止反应。用蒸馏水定容至20ml，用Whatman 6滤纸过滤或者在3000rpm条件下离心10分钟，取上清液。以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。
5.酶活计算酶活A＝[AX-AO]×K×1000×Df/W×t(u/g)
AX酶样的吸光度；AO酶空白样的吸光度；K标准曲线的斜率；1000转换因子1mmol＝1000μmol；Df稀释倍数；W一水半乳糖醛酸的分子量(212.16g/mol)；t反应时间(分钟)。
本发明的微生物菌株可以用于果胶酶的固态发酵生产中。果胶酶的固态发酵生产中，用于本发明的菌株发酵培养基没有特别限定，只要含有可同化的碳源、氮源和必需生长因子的培养基都适用于本发明的菌株。可以用于培养本发明的微生物的的营养源包括碳源、氮源、无机盐和微量营养物，其中碳源包括D-葡萄糖、D-果糖、D-山梨醇、D-甘露糖、淀粉水解糖、淀粉等；氮源包括有机氮、和无机氮，有机氮如玉米浆、酵母膏、干酵母、鱼粉、肉膏、蛋白胨等，无机氮包括氨水、氨气、硫酸胺、硝酸铵、氯化铵、碳酸胺、磷酸胺等；另外，培养基中还含有各种金属离子、维生素、氨基酸和特殊微生物生长所必需的其他物质。这些成分可预先一次性加入培养基中，或者间歇或连续地加入培养基中。
对于本发明微生物菌株，优选地可以采用如下固态发酵培养基配方麦麸90％、磷酸铵4.0％、甜菜渣4.0％、桔子皮粉2.0％。磷酸铵先溶解，然后与甜菜渣、桔子皮粉和麦麸混合，调节pH值到6.5-7.0之间。
固态发酵过程包括消毒灭菌、接种，三角瓶恒温培养，培养温度为30-35℃。在发酵进行到30小时以后，菌体的生长速度逐渐下降，发酵产热也降低，菌体开始产生孢子，酶活开始急剧增加。发酵到48小时以后，酶活的增长速度逐渐下降，60小时以后酶活增加很少。
有益效果用本发明的菌株生产的果胶酶在pH值为2.5-4.2的范围内性能稳定，酶活力(40℃)能够稳定保持在250u/g以上。在pH值为5.5的条件下，酶活力(40℃)达到120u/g以上。发酵时间为60小时左右，生产成本不超过8元/kg(干曲)。
采用本发明的菌株进行固态发酵制备果胶酶具有投资少，操作方便等特点。以单位体积计算，固态发酵果胶酶的活力要比液态发酵高5-6倍。生产原料主要是麦麸、桔子皮粉和甜菜渣等农副产品。
本发明以选育饲用复合酶高产菌种为突破口，采用符合我国国情的固态发酵法进行规模化生产；不仅有利于提高饲料工业经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动我国畜牧业持续、健康、稳定地发展。
具体实施方式
下面以非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例1取塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis Moss)CGMCC 0826斜面菌种一支，加入5ml无菌水，洗涤塔宾曲霉的孢子。然后吸取孢子液，接种到在由麦麸(96％)、硫酸铵(2.0％)和磷酸二氢钾(2.0％)组成的50g种子培养基(pH6.0、含水量为50％)中，30℃培养48小时后，接入由麦麸(90％)、硫酸铵(2.0％)、磷酸二氢钾(2.0％)和桔子皮粉(6.3％)组成的2kg固态培养基(pH6.8，含水量为60％)中。在28℃下培养58小时，培养基中果胶酶活力达到122.4u/g。
实施例2取塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis Moss)CGMCC 0826斜面菌种一支，加入10ml无菌水，洗涤塔宾曲霉的孢子。然后吸取孢子液5ml，接种到由麦麸(96％)、硫酸铵(2.0％)和磷酸二氢钾(2.0％)组成的50g种子培养基(pH6.0、含水量为50％)中，30℃培养48小时后，接入由麦麸(90％)、硫酸铵(2.0％)、磷酸二氢钾(2.0％)、桔子皮粉(2.0％)和甜菜渣(4.0％)组成的2kg固态培养基(pH6.7，含水量为60％)中。在28℃下培养60小时，培养基中果胶酶活力达到132.2u/g。
实施例3取塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis Moss)CGMCC 0826斜面菌种一支，加入5ml无菌水，洗涤塔宾曲霉的孢子。然后吸取孢子液3ml，接种到在由麦麸(90％)、硫酸铵(2.0％)、磷酸二氢钾(2.0％)、桔子皮粉(2.0％)和甜菜渣(4.0％)组成的20g固态培养基(pH6.8，含水量为50％)中，培养基装在250ml三角瓶中30℃培养62小时后，培养基中果胶酶活力达到120.5u/g。
权利要求
1.一种可高产果胶酶的属于塔宾曲霉(Aspergillus tubingensisMoss)的微生物菌株。
2.按照权利要求1的菌株，其具有以下特征a.菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃下6天直径45-60毫米，平坦或接近平坦，边缘具有白色的菌丝体，菌落背面带黄色；b.质地丝绒状或稍带絮状，分生孢子遏黑色；c.分生孢子梗发生于基质，孢梗茎呈黄色或黄遏色。
3.按权利要求2的菌株，其是可高产果胶酶的塔宾曲霉突变体、变异体或其各种后代、衍生物。
4.按权利要求2的菌株，其是塔宾曲霉CGMCC 0826。
5.权利要求1至4之任一的菌株在果胶酶固态发酵上的应用，其特征在于将所述的菌株用于果胶酶的固态发酵生产中。
全文摘要
本发明涉及一种可高产果胶酶的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis Moss)新菌株和其在果胶酶固态发酵中的应用。用本发明的菌株生产的果胶酶在pH值为2.5－4.2的范围内性能稳定，酶活力(40℃)能够稳定保持在250u/g以上。在pH值为5.5的条件下，酶活力(40℃)达到120u/g以上。发酵时间为60小时左右，生产成本不超过8元/kg(干曲)。
文档编号C12N1/14GK1498962SQ0214677
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者李德发, 陆文清, 朴香淑, 邢建军, 范石军, 张丽英, 胥学新, 龚利敏, 王春林 申请人:中国农业大学