专利名称：新的癌标记物及其在癌症诊断中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在人和非人哺乳动物受试者中诊断癌症的新癌标记物，特别是涉及这样的癌标记物，其包含质荷比(m/z)约为991的带负电荷分子。此处描述的癌标记物可用于确定来自受试者的生物样本(如体液)中一种或多种癌细胞或肿瘤的存在，这是通过测试来自该受试者的生物样本中该癌标记物水平的降低而确定的。
背景技术：
尽管在医学研究中已取得了无数的进步，癌症仍是世界范围内主要的死亡原因，且因此需要用于癌症早期诊断的快速和简便的方法，以利于通过外科切除、放射治疗、化学治疗或其他已知的治疗方法进行适当的医疗处理。用于癌症的好的诊断方法的可用性对于评价病人的治疗反应或对于评价由于原位再生或癌转移而导致的复发也是重要的。
癌标记物，例如肿瘤基因产物、生长因子和生长因子受体、生血管因子、蛋白酶、粘附因子和肿瘤抑制基因产物等的特性可提供有关在人或非人哺乳动物受试者中癌症的风险、存在、状态或未来行为的重要信息。确定一种或多种癌标记物的存在、表达或活性水平可有助于对具有不确定性临床异常的患者进行鉴别诊断，例如用以鉴别良性和恶性异常。
此外，对于已确定为恶性的患者，癌标记物可用于预测未来复发的风险，或用于预测特定患者对所选择的治疗方法出现反应的可能性。通过分析高特异性癌标记物或标记的组合甚至可获得更为具体的信息，所述信息可预测患者对特定药物或治疗方案的反应。
已公知异常糖基化是多数癌症类型的共有特征，且丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖(即O-聚糖)水平的显著变化也可发生于癌症患者。″O-聚糖″为一糖蛋白，其中N-乙酰半乳糖胺加入到新生蛋白质的丝氨酸和/或苏氨酸残基。癌症患者共有的O-聚糖核心结构水平例如可降低，或唾液酸化聚糖或神经节苷脂的水平提高，或唾液酸的修饰减少。癌症患者的0-聚糖特定肽部分的合成也可发生改变，由此使O-聚糖水平发生变化，这是由于糖蛋白的肽部分部分地指导O-聚糖的合成。备选地，癌症患者的唾液酸转移酶活性也可增强，因此产生过度唾液酸化的O-聚糖。
通常，肿瘤特异抗原为高分子量分子(＞10,000Da)，与正常细胞相比其在癌细胞上特异表达或表达的水平提高。但是，也存在低分子量(＜10,000Da)的肿瘤特异抗原，所述抗原通常为糖脂，更具体地为包含聚乳糖胺结构的鞘脂。″糖脂″只是具有一个或多个糖部分的脂类或脂肪酸分子。
″鞘脂″为包含脂肪酸残基、极性首基和鞘氨醇或相关碱基的脂类，包括神经酰胺及其衍生物、鞘磷脂(即在羟基基团上包含磷酸胆碱部分的神经酰胺)或鞘糖脂(即在羟基基团上包含糖部分的神经酰胺)，包括神经节苷脂。
″神经节苷脂″为含有唾液酸的鞘糖脂(即其中脂肪酸取代的鞘氨醇与寡糖连接的糖脂，所述寡糖包括D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和/或N-乙酰神经氨酸)，且其在多数哺乳动物细胞膜上表达。根据与唾液酸糖基化的程度，神经节苷脂有单-、二-、三-或多-唾液酸神经节苷脂。根据标准的命名法，使用了术语″GMn″、″GDn″、″GTn″，其中″G″表示神经节苷脂、″M″表示单唾液酸神经节苷脂、″D″表示为二唾液酸神经节苷脂，且″T″表示为三唾液酸神经节苷脂；其中″n″为赋值至少为1的数字标示，或赋值至少为1a的字母数字标示(例如1a、1b、1c等)，代表观测分子的结合方式[Lehninger，生物化学(Biochemistry)，294-296页(WorthPublishers，1981)；Wiegandt，糖脂新的综合生物化学(GlycolipidsNew Comprehensive Biochemistry)，199-260页，(Neuberger等编辑，Elsevier，1985)]。
根据其聚乳糖胺单位的结构，通常将聚乳糖胺分为两类，具体地说是1型聚乳糖胺，其包含半乳糖基-(ョ1-3，)N-乙酰葡糖胺，或备选地，是2型聚乳糖胺，其包含半乳糖基-(ョ1-4)N-乙酰葡糖胺。
神经节苷脂，例如GM2(Livingston等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，2911-2915，1987)、GD2(Schulz等，癌症研究(Cancer Res.)44，5914-5920，1984)或GD3(Cheresh等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81，5767-5771，1984；Reisfeld等，对癌症的免疫(Immunity to Cancer)(M.S.Mitchell，编辑)，69-84页，1985)，已被鉴定为多种神经外胚层来源肿瘤的主要细胞表面组成，其中所述肿瘤如恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、软组织肉瘤和肺的小细胞癌。这些神经节苷脂在多数正常组织中不存在，或仅以低水平存在。也讨论了神经节苷脂作为肿瘤特异抗原的作用，例如，Ritter和Livingston等，癌生物学论坛(Sem.Canc.Biol.)2，401-409，1991；Chatterjee等，USSN 5,977,316，1999年11月2日授权；Hakomori癌症研究(Hakomori Cancer Res.)45，2405-2414，1985；Miraldi，核医学论坛(Seminars in Nuclear Medicine)XIX，282-294，1989；以及Hamilton等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)53，1-8，1993。
存在于主要癌症中的共有肿瘤相关抗原为包含2型链聚乳糖胺结构的神经节苷脂，或备选地，为岩藻糖化形式的神经节苷脂。例如，神经节苷脂唾液酸-Lewis A和唾液酸-Lewis X参与癌细胞与血管内皮细胞的粘附，并有助于癌症的血原性转移。唾液酸-Lewis A通常在结肠癌、胰腺癌和胆道癌中表达，而唾液酸-Lewis X通常在乳腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌中表达。癌细胞表面唾液酸-Lewis A或唾液酸-Lewis X的糖配基的表达程度与癌症患者的血原性转移和预后密切相关。
另一方面，包含1型聚乳糖胺结构的神经节苷脂，例如2-3唾液酸Lewis A，在正常细胞和组织中大量存在，并且也是癌症相关的。Levery等(USSN 6.08 3,929，于2000年7月2日授权)认为具有或不具有唾液酸和/或岩藻糖残基的乳糖系列1型链的延长形式存在于癌症组织中。Levery等(见上)显示从结肠腺癌细胞系Colo205的糖脂级分分离的同种型包含以下的鞘糖脂单位同源二聚体的LewisA，、异源二聚体的LewisB-LewisA和延伸的唾液酸LewisA-LewisA，后者被认为是肿瘤相关的鞘糖脂和潜在的肿瘤标记物。
但是，尽管在鉴定用于检测癌症的唾液酸化抗原方面取得了进展，仍急切需要癌标记物以助于癌症的诊断和特定癌症类型的检测。特别是，尽管在癌症中观察到的糖基化有些混乱，但几乎所有的(如果有的话)已知癌标记物必然为唾液酸化化合物或O-连接的糖蛋白，和/或均为肿瘤特异抗原。
癌标记物的优选特征在于可应用快速或高通量的分析方法对其实施检测，所述分析方法例如质谱或高压液相色谱(HPLC)-质谱。
此外，适宜的癌标记物应适于在体液(例如血液、血清、尿液、粘液、唾液、汗液、泪液或其他液体分泌物)中进行检测，因此可有助于使用非侵入性试验进行常规测试。
发明概述在导致产生本发明的工作中，本发明人意在鉴定出存在于人和非人哺乳动物受试者体液中的高分子量以及低分子量的癌标记物，并研发相关的高通量诊断方法用以检测体液中与该癌标记物水平降低相关的恶性改变，其中此类诊断并不依赖于分离分子探针，所述探针如抗体或核酸探针，和/或避免了应用该类分子探针所需的费时的结合步骤。
因此本发明的第一方面提供了包含质荷比约为991的带负电荷分子的癌标记物，与健康受试者相比所述标记物在患癌症的受试者中存在的水平降低，或提供了该带负电荷分子的衍生物。
本发明的第二方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括(i)测定来自疑患癌症受试者的测试样本中的癌标记物水平，其中所述癌标记物包含质荷比约为991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)中的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本中的癌标记物或衍生物的水平，或与制定的用于健康受试者的水平进行比较，其中与健康受试者或与用于健康受试者的制定水平相比，该癌标记物或衍生物水平的降低作为癌症的征兆。
本发明的第三方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括(i)测定来自疑患癌症受试者的测试样本中的癌标记物水平，其中所述癌标记物包含质荷比约为991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)中的癌标记物或衍生物的水平与加到测试样本中的内标水平进行比较，其中与内标水平相比该癌标记物或衍生物的水平降低作为癌症的征兆。
本发明的第四方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括测定来自疑患癌症受试者的测试样本中的癌标记物水平，其中所述癌标记物包含质荷比约为991的带负电荷分子或其衍生物；与在同一测试样本中的另一标记物的水平相比，其中癌标记物与另一标记物比率的变化作为癌症的征兆。
本发明的第五方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中监测癌症治疗的方法，其包括(i)测定来自进行癌症治疗的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含质荷比约为991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)中的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本中癌标记物或衍生物的水平，或与用于健康受试者的已制定的水平进行比较，其中癌标记物或衍生物水平的提高作为成功治疗的征兆。
本发明的第六方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中诊断成功治疗后的癌症复发的方法，其包括(i)测定来自癌症治疗的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含质荷比约为991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)中的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本中的癌标记物或衍生物、与用于健康受试者的已制定的水平或与来自成功治疗癌症后的受试者样本中的水平进行比较，其中癌标记物或衍生物水平的降低作为癌症复发的征兆。
定义在本说明书中，除非上下文需要另外指出，单词″comprise″或其改变形式如″comprises″或″comprising″理解为包括所说明的一个步骤、成分或整数，或包含一组步骤、成分或整数，但不排除任何其他的步骤、成分或整数或一组成分或整数。
本领域的技术人员理解此处描述的本发明允许改变和变更为并非仅限于那些具体描述。应明晓本发明包括所有此类改变和变更。本发明也包括在本发明书中单独或总起来提及或指出的所有步骤、特征、组成和化合物，并包括任何或全部的组合或任何两个或更多的所述步骤、特征、组成和化合物。
本发明并非限定在此处描述的特定实施方案的范围之内，所述实施方案仅意在用于例证的目的。功能等同产物、组成和方法也明确包括在本发明的范围之内，如此处所描述的。
本说明书中任何现有技术文献的参考仅用于进一步描述本发明的目的，且不应作为这样的指示或认可，即该文献构成了在澳大利亚或其他地区的技术人员公知常识的一部分。
此处应用的单词″from″或″of″，和术语″derived from″应理解为可从特定来源、生物体、组织、器管或细胞中获得的特定产物，特别是分子，例如多肽、蛋白质、基因或核酸分子、抗体分子、Ig片段或其他分子或包含所述分子的生物样本，但所述特定产物并非必须是从该来源、生物体、组织、器管或细胞中直接获得。
此处应用的″癌症″意指任何一种或多种广泛的良性或恶性肿瘤，包括那些能够在人或非人哺乳动物身体或身体一部分中浸润生长并转移的肿瘤，例如通过淋巴系统和/或通过血流进行浸润生长和转移。如此处所应用，″肿瘤″包括良性和恶性的肿瘤和实体生长物，尽管本发明特别针对恶性肿瘤和实体癌症的诊断和检测。典型的癌症包括但不限于癌、淋巴瘤或肉瘤，例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴性白血病、何杰金病、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。
如此处所描述和由权利要求所定义的本发明上下文中，术语″癌标记物″应意指可在来自人和非人哺乳动物受试者的生物样本中可检测到的且其为受试者中癌症征兆的任一分子，所述生物样本如体液(血液、尿液、粘液、唾液、汗液、泪液或其他液体分泌物)，所述分子特别是指与健康受试者体液中的水平相比在受试者体液中其水平降低的分子。术语″癌标记物″也应包括由正常细胞或在正常细胞上表达但不在癌细胞上表达的分子，或与正常细胞相比由癌细胞或在癌细胞上的表达降低了的分子。
在本发明的上下文中，术语″带负电荷的分子″与术语″带负电荷的含糖分子″或″含糖的分子″互换使用，这些术语指质荷比约为991的本发明的癌标记物，无论该标记物事实上是否含有糖作为分子的一部分。这些术语也包括分子衍生物在其范围内，例如包含磷酸酯或硫酸酯的衍生物。
当分子包含糖时，其优选地包含单糖、二糖或寡糖(即至少为三个且不多于约九个单糖单位)。
附图简述
图1A为以水为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的未被处理的大鼠血清级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出显著负离子(m/z 991)的位置，其在患腺癌的受试大鼠中降低(图1B)。
图1B为以水为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的荷瘤大鼠的血清级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。在皮下注射具高度恶性和转移性的大鼠乳腺腺癌13762 MAT(106个细胞/大鼠)13天后对荷瘤大鼠进行试验。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出负离子(m/z 991)的位置，其在未被处理的大鼠质谱图中是显著的(图1A)。
图2A以甲醇为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的正常未被处理小鼠的血清级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出显著负离子(m/z 991)的位置，其在荷瘤小鼠中降低(图2B)。
图2B为以甲醇为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的荷瘤小鼠的血清级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。在皮下注射具高度恶性和转移性的B16F1黑素瘤(106个细胞/小鼠)15天后对荷瘤小鼠进行试验。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出负离子(m/z 991)的位置，其在未被处理的小鼠质谱图中是显著的(图2A)。
图3A以水为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的正常未被处理的人的血清级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子种类的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出显著负离子(m/z 991)的位置，其在结肠癌患者中降低(图3B)。
图3B为以水为洗脱液从C18固相Seppak cartridge柱洗脱的结肠癌患者的血浆级分的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标指与最高丰度分子的丰度相比每一分子种类的相对百分比丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。箭头标示出负离子(m/z 991)的位置，其在正常未被处理的人类受试者的质谱图中是显著的(图3A)。
图4A为正常未处理小鼠血清的负离子(m/z 991)片段(图1A)的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示，该片段通过应用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱的源后衰变(postsource decay)断裂而获得。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标表示每一片段的丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。主要片段的质荷比，图中从左到右为241、644、705、749和947。完整的m/z 991负离子的位置也在图谱的最右端标出。m/z 241离子片段与磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或与硫酸己糖一致。
图4B为正常未处理大鼠血清的负离子(m/z 991)片段(图2A)的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示，该片段通过应用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱的源后衰变断裂而获得。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标表示每一片段的丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。主要片段的质荷比，图中从左到右为241、644、705、749和947。完整的m/z 991负离子的位置也在图谱的最右端标出。m/z 241离子片段与磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或与硫酸己糖一致。高本底最可能是样本中存在少量的完整m/z 991负离子的结果。
图4C为健康人血清的负离子(m/z 991)片段(图3A)的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱图的图示，该片段通过基于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱的源后衰变断裂而获得。x轴表示质荷比(m/z)，且纵坐标表示每一片段的丰度。每一峰顶端的数值指该峰的质荷比。主要片段的质荷比，图中从左到右为241、644、705、749和947。完整的m/z 991负离子的位置也在图谱的最右端标出。m/z 241离子片段与磷酸己糖部分(例如磷酸肌醇)或与硫酸己糖一致。
优选实施方案的详细说明本发明的一个方面提供了包含质荷比约为991的带负电荷分子的一种癌标记物，与健康受试者相比该标记物在癌症受试者中的存在水平降低，或提供了该带负电荷分子的衍生物。
优选地，本发明的带负电荷分子以分离的形式提供。″分离的″是指例如在此处定义的条件下通过质谱进行测定基本不含同种的糖脂、二糖、单糖或寡糖。由于MALDI-TOF MS的高分辨率，技术人员将会理解，m/z 991离子的源后电离片段的质谱图对应于该分子的″指纹″。
优选地，当存在糖时，其包含磷酸己糖或硫酸己糖。在此方面，源后衰变断裂数据显示，分离的带负电荷分子产生通过MALDI-TOF MS估计其质荷比约为241的片段，所述片段为磷酸己糖的特征，其中所述磷酸己糖例如磷脂酰肌醇(即肌醇-1，2环磷酸)。
甚至更优选地，糖部分包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)。
更优选地，含糖的分子包含含有至少一个磷酸己糖、磷脂酰肌醇或GPI单位的二糖或寡糖部分。
同样在本上下文中，术语″含带负电荷的糖的分子″或以上提出的其可替换术语，应意指含糖的分子具有足够的亲水性以使其不能与疏水基质，特别是C-18基质牢固结合，且优选地包含一个或多个磷或硫原子。在此方面，应用质谱，特别是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对本发明的癌标记物进行电离，表明本发明分离的癌标记物为带负电荷的离子。因此，术语″含带负电荷的糖的分子″包括磷脂、磷酸甘油酯、含磷酸酯的N-连接糖蛋白、含磷酸酯的O-连接糖蛋白、含磷脂酰肌醇的脂类或蛋白质或含糖基磷脂酰肌醇(GPI)的脂类或蛋白质。
此处描述的癌标记物已根据其特性的选择对其进行了分析，且认为该癌标记物的糖部分可在原位与其他功能基团连接。例如单糖、二糖或寡糖部分可原位与蛋白质部分(例如氨基酸、肽或多肽)进行O连接或N连接以形成糖肽/糖蛋白，备选地或另外地，可原位与脂类部分连接，例如脂肪酸(棕榈酸和/或油酸和/或肉豆蔻酸和/或花生四烯酸，或其他)；三酰基甘油；磷脂；磷酸甘油酯(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺，或其他)；鞘脂类；鞘氨醇或胆固醇激素。所有此类变体可在此处描述的上下文中用作癌标记物。相应地，本发明明确地包括糖部分的肽类或脂类变体，此类变体的唯一要求是包含m/z 991离子。
更为优选地，癌标记物包含糖脂，且甚至更优选地，包含磷脂酰肌醇和选自肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸的一种或多种脂肪酸的糖脂。应用本领域内技术人员公知的一种或多种技术可对此处描述的癌标记物的脂类部分的结构进行阐明，而无需进行实验，所述技术特别是快原子轰击(FAB)、碰撞活化解离(CAD)、串联质谱(基本上如Ladisch等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264，12097-12105，1989中所描述的)或P-NMR技术，以及其他。
本发明的该实施方案明确包括该糖脂的衍生物，例如包含一个或多个荧光配基、酶配基、放射配基、肽配基(例如FLAG)或抗体配基的衍生物，其中所述配基共价连接到m/z 991离子以便于检测。
在本发明特别优选的实施方案中，癌标记物包含二肉豆蔻酰-磷脂酰肌醇(即二肉豆蔻酰-PI)，任选地用额外的脂肪酸如棕榈酸或油酸进行酰化。本发明的含糖的癌标记物的特征与完整分子进行MALDI-TOF MS时的m/z991离子值一致并与源后断裂分析中m/z 241峰的出现一致。本发明的该实施方案明确包括该糖脂的衍生物，例如包含一个或多个荧光配基、酶配基、放射配基、肽配基(例如FLAG)或抗体配基的衍生物，其中所述配基与糖脂其价连接以便于检测。
可通过本领域内公知的任何方法测定本发明的含糖分子的分子质量和/或质荷比或其他物理特性，所述方法包括凝胶过滤、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱、HPLC、FPLC，或由组成或结构数据预测化合物的分子质量。优选地，通过质谱包括MALDI-TOFMS、串联MS、电喷雾MS等测定质荷比。
此处提及的质荷比或m/z比″约″为一个特定的值，本领域内技术人员应理解为包括可接受的差异而无需进一步对其进行定义。优选地，此处例举的由样本质谱测定所估计的m/z比包括m/z±5的允许误差，更优选地为m/z±4，，更优选地为m/z±3，更优选地为m/z±2，且甚至更优选地为m/z±1。相应地，应当理解，估计约991的m/z比所包括的m/z比在986-996的范围内，优选地在987-995的范围内，更优选地在988-994的范围内，更优选地在989-993的范围内，且更优选地在990-992的范围内，或甚至为991。
如此处所应用，″衍生物″应意指由此处描述的m/z比约为991的含糖的亲本分子所产生的任何分子。
本发明的衍生物因此包括本发明的含糖分子的任何及全部的片段，以及包括其作为癌标记物的用途，唯一必需的条件是所述片段保留亲本分子有关癌检测试验的特异性。此处提供的公开(特别是在图4A、4B和4C中)中显而易见的是，本发明的含糖的分子在后源电离后产生特异的″指纹″，并产生m/z约241、约644、约705、约749和947的片段。样本中高本底的单糖或磷酸肌醇可掩盖一个或多个特征片段峰。在此情况下，领域内的技术人员将会意识到，两个片段、优选地三个片段、更优选地四个片段且更优选地所有五个片段的存在可用作具有亲本分子特异性的癌标记物。
含糖的负电荷分子的优选衍生物包括，例如，通过在糖生物学中为技术人员所公知的标准方法产生的该分子糖部分的片段。由于此类分析通常依赖于化学修饰以便于对其进行检测，本发明因此也包括本发明的m/z 991癌标记物的任何化学修饰片段，所述修饰片段通过泛甲基化法(permethylation)、高碘酸氧化法、NaBH4还原法、还原氨化(例如应用2-氨基吡啶)或与全氟苄基氨基苯甲酸酯或烷基-氨基苯甲酸酯孵育或其他方法实现。衍生物进一步包括由前述方法的组合所产生的任何含糖的分子。
本领域内的技术人员将会认识到用于测定所述癌标记物的糖部分精确结构的几种公知的方法，其中可产生衍生物(例如酶消化或指纹图谱技术、质谱、串联质谱、高压液相色谱(HPLC)-质谱、分子模建、凝集素亲和层析(特别是与高效液相亲和层析联合，以下称为″凝集素-HPLAC″)、反相法、大小排阻法等)。
为提供单糖残基的数目或类型或确定N-乙酰半乳糖胺或O-聚糖的存在，例如通过酸水解或甲醇分解从而分别作为还原糖或甲基糖苷将单糖释放来测定全部糖组份。然后应用气相色谱(GC)和/或液相色谱在低或高压下分辨并定量所释放的单糖。应用GC，且任选地用液相色谱时，单糖通常被衍生化，例如通过泛甲基化作用。也可应用具脉冲电流测定的高pH阴离子交换层析(HPAEC/PAD)，基本上如由Hardy，酶学方法(MethodsEnzymol.)179，76-82，1989中所描述的进行。
为阐明糖蛋白的糖部分，必须释放出较小的糖单位(单糖、二糖、寡糖)，例如应用化学和/或酶学方法。酶消化法包括与有效量的肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)或其他内切糖苷酶或N-聚糖酶(参见Takahashi，N.和Muramatsu，T编辑(1992)内切糖苷酶和N-聚糖酶的CRC手册(CRCHandbook of Endoglycosidase and Glycoamidases)，CRC出版社，Inc.，Boca Raton，FL)或内切-β-N-乙酰葡糖苷酶(EC 3.2.1.96)或如Endo H或Endo F(参见Maley，F.等，Anal.Biochem.180，195-204，1989)的糖苷酶孵育以进行释放。化学法包括在足以达到糖释放的条件和时间下与无水联氨或强碱及还原剂孵育，所述还原剂任选地为NaBH4。
所释放糖的结构例如通过应用外切糖苷酶的顺序消化、区域专一的化学降解、甲基化分析(GC-MS)、FAB-MS和/或强磁场质子(high-fieldproton)和多维NMR法实现。为提高产生的含糖片段的分辨率，用发色团或荧光团或放射性化学物质进行衍生化。也可应用脉冲电流计(PAD)以提高非衍生化糖的分辨率。
光谱测定技术如质谱、高压液相色谱(HPLC)或组合技术如串联质谱、高压液相色谱(HPLC)-质谱为优选的用于分离含糖分子的复杂混合物的技术。可从文献中获得极好的综述(参见，例如Honda，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)140，1-47，1984；Townsend.(1993)生物技术中的色谱(Chromatography in Biotechnology)ACS论坛系列529(Horva′th，C.和Ettre，L.S.编辑.)美国化学学会，Washington，D.C；Scott(1992)应用HPLC进行食物分析(Food Analysis by HPLC)(L.M.L.Nollet，编辑)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)；以及Lee，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)179，404-412，1990)。
例如，应用结合胺的二氧化硅基质的标准相HPLC可用于解析非衍生化的糖和放射标记的糖醇(Mellis和Baenziger，Anal.Biochem.114，276-280，1981)。应用ODS-二氧化硅的反相方法有利于解析衍生化的糖(Tomiya等，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)163，489-499，1987)。如应用DEAE(Pharmacia)或Mono-Q(Pharmacia)的阴离子交换法可用于解析唾液酸化、磷酸化或硫酸化的糖(Watson和Bhide，液相色谱/气相色谱(Liq.Chrom/Gas Chrom.)11，216-220，1993)。应用高pH下的强阴离子交换剂(例如Dionex或CarboPac)的高压阴离子交换色谱法也可用于此方面(Townsend和Hardy，糖生物学(Glycobiol.)1，139-147，1991)。
应用一系列固定的凝集素配基的系列凝集素亲和层析法，特别是与HPLAC联合应用时，可用于解析多种糖，例如半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、甘露糖、葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)(参见Cummings等，细胞生物学方法(Methods Cell Biol.)32，141-183，1989；和Virgilio(1998)凝集素，生物学，生物化学，临床生物化学(Lectins，Biology，Biochemistry，Clinical Biochemistry)，12卷，其中包括来自第17届国际凝集素会议的进展，Wurzburg，1997(van Driessche，E.，Beeckmans，S.，和Bog-Hansen，T.，编辑)，Textop出版社，Hellerup，丹麦(ISBN87-984583-0-2)。凝集素的示例包括直生刀豆(Canavalia ensiformis)的伴刀豆球蛋白A(ConA)、半乳糖凝集素-1(galectin-1)、美国商陆(Phytolacca americana)的商陆有丝分裂原(PWM)、美国商陆(P.americana)Pa-2和来自以下的任何一种或多种凝集素二孢蘑菇(Agaricus bisporus)(ABA-I)、橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)(AAA)、独角仙(Allomyrina dichotoma)(Allo A-1/11)、落花生(Arachis hypogea)(PNA)、紫羊蹄甲(Bauhinia purpura)(BPA)、曼陀罗(Datura stramonium)(DSA)、双花豆(Dolichos biflorus)(DBA)、鸡冠刺桐(Erythrinacristagalli)(EcIA)、龙芽菜(Erythrina corallodendron)(EcoA)、刺酮(Erythrinia variegata)(EVA)、雪花莲(Galanthus nivalis)(GNA)、柴胡(Griffonia simplicifolia)(I A4或GSA-A4；I B4或GSA-B4；II或GSA-II)、兵豆(Lens culinaris)(LCA)、翅荚豌豆(Lotustetragonolobus)(LTA)、番茄(Lycopersicon esculentum)(LEA)、朝鲜槐(Maakia amurensis)(MAA)、稻(Oryza sativa)(OSA)、菜豆(Phaseolusvulgaris)(红细胞凝集素或E-PHA；白细胞凝集素或L-PHA)、豌豆(Pisumsativum)(PSA)、蓖麻(Ricinus communis)(RCA-I，RCA-II)、西洋接骨木(Sambucus nigra)(SNA)、槐树(Sophora japonica)(SJA)、普通小麦(Triticum vulgaris)的小麦胚芽(WGA)、荆豆(Ulex europeaus)(UEA-I)、蚕豆(Vicia faba)(VFA)、Vicia graminea(VGA)、柔毛野豌豆(ViciaVillosa)(VVB4)或多花紫藤(Wisteria floribunda)(WFA)。
备选地，或另外地，高压阴离子交换色谱法如HPAEC/PAD用于分离含糖的复杂混合物，特别是用于本发明的含糖的阴离子分子或其含磷酸酯或含硫酸酯的片段。
备选地，或另外地，大小排阻色谱法(Kobataet等，酶学方法(MethodsEnzymol.)138，84-94，1987；Oxford GlycoSystem′s GlycoMap 1000)用于片段的分辨，片段的分离基于片段的大小。
本发明人也显示了反相HPLC(RP-HPLC)可用于将本发明的癌标记物与其他更疏水的分子区分开来，所述更疏水分子如疏水的神经节苷脂和神经酰胺。这是由于糖部分是亲水的。尽管如此，RP-HPLC用于分辨糖部分的片段，特别是当它们例如通过应用2-氨基吡啶进行还原性氨化的化学衍生而导入一疏水的发色团或荧光团时。用2-氨基吡啶标记的糖易于进行作图，基本上如Tomiya等，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)171，73-90，1988描述的。
电泳方法例如纸电泳、毛细管电泳以及优选地应用高比例聚丙烯酰胺胶片的凝胶电泳用于分离含糖片段的荧光衍生物(例如荧光团辅助的糖电泳(FACE)，Millipore)。
质谱(MS)或串联MS(例如MS/MS、MALD-TOF/电喷雾MS、电喷雾MS/MALDI-TOF、MALDI-TOF/源后MALDI-TOF等)的应用对于解析含糖的片段是特别优选的，特别是当它们与NMR、化学法、外切糖苷酶降解联合应用来测定包括任何被解析的单糖、二糖或寡糖的含糖片段的特性、连接部位和端基异构(anomericity)时。本领域内的技术人员将会认识到质谱是用于精确确定分子量、鉴定化学结构、确定混合物组成以及定性元素分析的一种分析技术。在实施中，质谱产生所研究样本分子的离子，根据它们的质荷比分离这些离子，并测定每一离子的相对丰度。优选地，质谱系统应用MALDI-TOF MS或电喷雾MS或源后断裂法。进行质谱分析的一般步骤如下(i)从样本中产生气相离子；(ii)基于离子的质荷比在空间或时间上分离它们；以及(iii)测定每一所选择的质荷比的离子的数量。
飞行时间(TOF)质谱，如在USSN 5,045,694和USSN 5,160,840中所描述的TOF质谱，产生所研究样本材料的离子，并通过测定所产生的离子行至检测器所需的时间，根据质荷比分离这些离子。TOF质谱由于其相对简单、设备价廉且实际上具有不受限的质荷比范围而存在优势。TOF质谱与扫描仪器相比具有潜在的更高的敏感性，这是由于其能够记录每次电离产生的所有离子。TOF质谱在测定大的有机分子的质荷比时特别有用，而常规磁场质谱对此缺乏敏感性。由特定电位加速的离子的飞行时间与其质荷比成正比。因此离子的飞行时间是其质荷比的函数，并大约与质荷比的平方根成正比。如果仅存在单一的带电荷离子，最轻的离子最先到达检测器，随后质量较重的基团顺序到达。TOF质谱因此提供了对所研究分子的质荷比极为精确的估计，且误差一般不大于m/z±5，所述误差主要是由于相同质量和电荷的离子没有恰好同时到达检测器。该误差的发生主要是由于所产生离子的初始时间、空间和动能分布导致质谱峰加宽，因此限制了TOF质谱仪的分辨力。初始时间分布产生于离子形成时间的不确定性。离子形成时间的确定性通过脉冲电离技术得以加强，所述技术例如等离子解吸和激光解吸，它们在非常短的时间内产生离子并导致最小的初始空间分布，这是由于离子从样本表面充分定义的区域产生，因此离子形成的初始空间不确定性可以忽略不计。脉冲电离如等离子解吸(PD)电离和激光解吸(LD)电离产生具有最小空间和时间不确定性但相对宽的初始能量分布的离子。因为长脉冲长度可严重限制质量分辨率，常规LD一般使用足够短的脉冲(经常小于10毫微秒)以将时间不确定性降至最小。通过在激光波长处将小的有机基质分子加到高吸附性的样本材料中可提高LD的性能(即基质辅助激光解吸/电离，以下称为″MALDI″)。基质促进样本的解吸和电离。MALDI促进分子量超过100,000Da的生物大分子的解吸和电离而不会将其分裂，因此特别适用于生物应用。用于实施本发明的优选基质包含2-(4-羟基苯偶氮基)苯甲酸(HABA)，也称作4-羟基苯-2-羧酸。在MALDI中，样本通常放置在光滑金属表面上并由于脉冲激光束对样本表面的撞击而使样本解吸到气相中。这样，在与激光脉冲持续时间基本对应的短时间间隔内，以及在与吸收足够的激光能量而蒸发的固体基质和样本部分对应的很小空间区域内产生离子。MALDI提供了用于飞行时间(TOF)质谱的近乎理想的离子源，当初始离子速度很小时更是如此。在MALDI离子源中使用脉冲离子引出可获得质量分辨率的显著改进。也已知离子反射器(也称作离子镜和反射器(reflectron)，由一个或多个均一、减速的静电场组成)可补偿分析物离子初始动能分布的影响，特别是当其放置在自由飞行区域末端时。有关表面离子产生的对MALDI的其它改进在本领域内是公知的，所述改进通过提高分辨率、改进质量精确度、提高信号强度以及减少背景噪音实现，如在USSN 6,057,543中所描述的改进。
应用电喷雾MS或电喷雾电离MS用于从液体样本基质中产生气相离子，以允许将样本导入质谱仪。因此电喷雾MS用于提供液相色谱和质谱仪间的接口。在电喷雾MS中，通过毛细管(下文中称为″针″)泵入，且在针尖和对面墙、毛细入口或类似结构间建立电位差(例如三到四千伏)。从针尖发出的液流通过电场扩散成高度带电的小滴，形成电喷雾。也可通过周围的毛细管导入惰性干燥气体(例如干燥的氮气)以提高液流的喷雾作用。电喷雾小滴在电场中传送并注射入维持在高真空状态的质谱仪。通过干燥气体和真空的联合作用，小滴中的携带液体逐渐蒸发，导致产生更小的、愈加不稳定的小滴，表面离子从小滴中释放到真空中用于分析。溶解的离子通过样本锥和分离器透镜，并在RT透镜聚焦后，进入质谱仪的高真空区域，在此区域根据质量将离子分开并用适宜的检测器(例如光电倍增管)进行检测。根据溶剂组成，使用的优选液流速度为20-30微升/分钟。更高的液流速度可导致溶解的样本离子化的不稳定和低效率，在此情况下可应用气动辅助电喷雾针。
用于将其导入MS环境的样本制备通常包括脱盐，基本如在实施例1中所描述的，优选地为在分析前应用至少一个标准的色谱分离或纯化步骤而进行的额外分级分离(例如，应用反相技术)。例如，通过顺序的高碘酸盐氧化、NaBD4还原和泛甲基化(Nilsson，1993，生物药物中的糖蛋白分析(Glycoprotein Analysis in Biomedicine)(E.F.Hounsell，编辑)Humana出版社，Totowa，NJ，35-46页)或用全氟苄基氨基苯甲酸酯对含糖的片段进行衍生化或用烷基氨基苯甲酸酯对片段进行还原性末端修饰以增强其表面活性，可提高该方法的灵敏性和/或分辨能力。当应用MALDI-TOF MS时，样本与适宜的基质混合并干燥，而当应用电喷雾MS时，样本将在适宜的载体溶液中以液体样本形式进行直接注射。
此外，此处描述的癌标记物或其片段的衍生物也应包括通过将一种或多种荧光配基、发色团、酶配基、放射性配基、肽配基(例如FLAG)或抗体配基加入到该分子的糖部分而产生的含糖的任何分子。用于将此类配基加入到糖的方法在领域内公知。
用于分析糖和糖聚合物的方法以及可由其产生的衍生物的类型的进一步综述参见Hounsell，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.，50，311-350，1994；Hounsell，(1997)糖科学现状和展望(GlycoscienceStatus andPerspectives)(H.J.Gabius和S.Gabius，编辑)，Chapman和Hall.15-29页；以及Hounsell(1997)编辑，分子生物学中的糖科学方法(Glycoscience Protocols Methods in Molecular Biology)，Humana出版社。
不被任何理论或作用方式所限制，本发明的含糖的分子也可能依赖免疫系统，由此需要激活的或功能性免疫系统的存在以用于分子的表达，和/或该分子在健康受试者中分泌到循环和其他体液中。因此肿瘤发生使其表达和/或分泌减少和/或使其从细胞上脱落，其中在肿瘤发生期间例如在转移之前该分子在细胞上正常产生。
由本发明人确定的该m/z 991离子癌标记物，特别是对其在正常和癌细胞上表达特征的阐明，以及用于对其进行检测的测试系统的制定，促进了多种用于人和非人哺乳动物受试者的癌诊断方法的产生。
因此，本发明的另一方面提供了在人和非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的一种方法，其包括(i)测定疑患癌症的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含质荷比约991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)的癌标记物或衍生物水平与健康受试者的对照样本的癌标记物或衍生物水平进行比较，其中与健康受试者中的水平相比该癌标记物或衍生物水平的降低作为癌症的征兆。
但是，如果先前已建立了对照的健康受试者范围，可不必应用对照样本，这样测试样本中进行的测量可与对照范围进行比较。此外，可应用内部样本对照以评估癌标记物水平降低的程度。例如，可选择测试样本中的另一分子(即另一标记物)用以计算比率，其中所述该另一标记物在测试样本和对照样本中的水平稳定，其中癌标记物与该另一标记物比率的变化作为癌症的征兆。备选地，测试样本可″钉入″适宜的标准标记物，以提供内标。已有多种此类标记物存在，或可容易地由质谱领域内的技术人员进行制备。
任何本领域内认知的方法，例如免疫检测、色谱法(疏水作用色谱法、高压液相色谱法、反相色谱法或凝集素亲和层析等)可用来测试受试者中癌标记物的水平并与健康受试者的水平进行比较。优选地，尽管并非必须，质谱用于诊断。用于检测或测定本发明的含糖分子或其片段的那些方法在本说明书上文中概括描述。
本发明特别针对于神经外胚层来源的癌症的诊断，所述癌症优选地选自癌、淋巴瘤和肉瘤，例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴性白血病、何杰金病、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和软组织肉瘤。在本发明特别优选的实施方案中，癌症选自黑素瘤、腺癌和结肠癌。
显然，此处描述的诊断方法并非限定于对癌症的诊断，也可用于监测特定受试者中疾病的发展，所述监测通过随着时间比较受试者中癌标记物的水平而实现。当病人在缓解期时，在缓解早期采取的样本可用于与后期样本比较的标准。优选地用来自相同体液的样本作为早期样本，以测定受试者的状态，这是由于癌标记物水平的任何进一步的改变可指示出缓解期已经结束。类似地，由于癌标记物水平的任何改变可指示出复发或转移，对于已成功治疗并导致恢复、治愈或没有出现任何癌转移的患者，治疗后或癌转移前立即采取的样本可用作与后期样本比较的标准，以确定受试者是否发生肿瘤复发或转移。
术语″疑患癌症的受试者″将意在理解为已经呈现出一种或多种与癌症相关的症状的受试者，或在先前已获得的测试样本作为测试样本时用本发明的方法诊断为患有癌症的受试者，包括其中缓解期疑为接近尾声或正处于监测之中的癌症缓解期的受试者。
如此处所应用，术语″健康受试者″应意指采取对照样本时未呈现出任何与癌症相关的症状的受试者，或采取对照样本时与癌症相关的症状处于缓解期的受试者，或采取血液级分时先前在血、尿或其他体液中诊断出的肿瘤未出现任何转移表现的受试者。因此，″健康受试者″不必与疑患癌症的受试者截然区分。例如，某特定个体，例如为处于罹患癌症风险中的个体，可在不同的时间提供体液样本，在此例子中任何症状产生之前采取的较早样本可用作后期测试样本的对照样本。备选地，从缓解期或治疗后受试者中采取的体液样本可用作较早或之后采取的同一受试者的样本的对照样本，例如，用以监测疾病的进程。
″对照样本″意指具有一特定整体的已知组成或含量的样本，以此与测试样本进行比较。对照样本来源的唯一要求是其不含有与疾病状态一致的待检测癌标记物的水平。
此处描述的试验中所应用的测试样本或对照样本可为来自疑患癌症的受试者或健康受试者的任何体液样本，例如血液级分、血浆级分、尿液、唾液、粘液、痰液或泪液，以及其他。在一特别优选的实施方案中，对照样本或测试样本为血液级分，优选地为血浆级分。
如此处所应用，″血液级分″意指任何来自血液的物质，且应包括血液的上清或沉淀、血清级分或血浆级分、血沉棕黄层级分、富含T细胞的级分、富含血小板的级分、富含血小板红细胞的级分、富含嗜碱性细胞的级分、富含嗜酸性细胞的级分、富含淋巴细胞的级分、富含单核细胞的级分、富含嗜中性粒细胞的级分、任何部分纯化或纯化的组份或血液，无论其是否与血液的任何其他组份混合。血液级分的获得，例如可通过用沉淀剂(例如低温、酸、碱、硫酸铵、聚乙二醇等)或色谱分级分离(例如大小排阻、离子交换、疏水相互作用、反相、质谱等)处理血液实现。
在本上下文中，术语″血清级分″意指源自血清的样本。示例性的血清级分包括血浆蛋白质级分(例如白蛋白级分、纤维蛋白原(因子I)级分、血清球蛋白级分、因子V级分、因子VIII级分或包含因子VI1、IX和X的凝血酶原复合体)、血浆的冷上清或冷沉淀、新鲜冷冻血浆的冷上清或冷沉淀、血浆级分的冷上清或冷沉淀、或血清的部分纯化或纯化的任何组份，无论其是否与其他血清组份混合。血清级分的获得，例如可通过用沉淀剂(例如低温、酸、碱、硫酸铵、聚乙二醇等)或用色谱分级分离(例如大小排阻、离子交换、疏水相互作用、反相、质谱等)处理血清实现。
由于本发明的方法是用体液样本进行的，因此其便于进行且不具有侵入性。
根据所应用的分析技术，通过领域内技术人员已知的标准方法或根据此处描述的方法制备体液样本，而避免不适当的实验。本发明明确包括进行此处描述的诊断试验的样本的制备和处理。
″将(i)中的癌标记物或衍生物的水平与健康受试者的对照样本中的癌标记物或衍生物的水平进行比较″意指在对照样本和测试样本间比较本发明分子的癌标记物或衍生物的量或浓度。该比较易于进行，例如当用质谱分析时两样本中的癌标记物表示为与最高丰度峰百分比的相对量。例如，可调控用于样本质谱的条件以保证特定分子的峰高度或特定峰的面积与样本中该分子的丰度成正比。因此，并非严格需要对收集的峰样本进行进一步的试验用以测定其中分子的丰度，这是由于可重叠这两样本的图谱以确定峰高的差异。备选地，或除了测定癌标记物的相对水平之外，将峰高度整合或通过进一步的对与癌标记物对应的峰进行生化试验或免疫试验来测定癌标记物的绝对浓度也是可能的。但是，用于定量时，优选地仅进行粗样本制备。
本发明明确包括测定测试样本或对照样本中本发明的癌标记物丰度的步骤，和/或测定样本中癌标记物相对丰度的步骤。其包括测定来自血液或血清中的任何血液级分或血清级分癌标记物的丰度或相对丰度。标准试验可用于此目的，所述试验如峰级分的免疫化学分析。
优选地，本发明的此方面进一步包括第一步，即获得体液样本，或由其获得的任何中间体级分(例如聚糖、糖脂和糖粗混合物的沉淀)。
优选地，根据本发明此方面的方法包括进一步说明癌标记物或衍生物的特性，特别是根据其质荷比和/或分子量和/或结构，以确认其特性。前述讨论将表明，应用领域内已知的方法可容易地测定这些特性。在一特别优选的实施方案中，测定了本发明的含糖分子的质荷比，或测定了其一个或多个后源电离片段的质荷比，或测定了其后源电离片段的特征，用以证实癌标记物的特性，所述测试如通过针对标定的标记进行质谱实施，该测试所估算质荷比的最大误差为±5，更优选地为±4，甚至更优选地为±3，仍更优选地为±2，且甚至仍更优选地为±1。
对于本发明癌标记物的免疫学试验，制备针对癌标记物的单克隆抗体，优选地针对该癌标记物的纯化分子或其衍生物，例如来自质谱的级分，且然后在标准免疫试验技术中应用以用于随后的癌症诊断。
为制备单克隆抗体，用低剂量环磷酰胺(15mg/Kg非人哺乳动物体重)注射小鼠或其他哺乳动物进行预处理以降低其抑制细胞的活性，然后以短时间间隔(即3-4天和一周之间)用不同剂量的含糖分子进行免疫。依靠糖磷酸肌醇部分，含糖分子可导入到脂质体中，随后用脂质体免疫动物，基本如在USSN 5,817,513中所描述的。应用与标准方法一致的皮下、静脉内或腹膜内注射进行免疫。免疫之前及其间，从动物中采取血液的血清样本，通过任何已知的用于检测抗原抗体反应的免疫试验监测以含糖分子为抗原所产生的抗体滴度。通常，以短时间间隔的约5-9次累积剂量的脂质体制备物可提高对含糖分子的抗体反应。产生抗含糖分子的血清抗体滴度的小鼠接受脂质体制备物的再次免疫，所述免疫在获得抗体产生细胞的约三天前进行，然后分离产生抗体的细胞，优选地为脾细胞。根据用于制备单克隆抗体的标准技术，将前述细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。然后通过免疫试验方法测试杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的滴度。
优选地，应用免疫酶试验，其中杂交瘤细胞上清与含抗原的测试样本结合，然后用与单克隆抗体结合的酶标记的第二抗体检测抗原抗体结合。一旦通过例如极限稀释筛选并亚克隆到所需的杂交瘤细胞，即可在足量的培养基中体外扩增所产生的单克隆抗体，经过适宜的时间后，从上清中回收所需的抗体。所选择的培养基及适当的培养时间为技术人员公知，或易于确定。
另一产生方法包括将杂交瘤细胞注射到同源小鼠体内。在此条件下，杂交瘤细胞引起非实体肿瘤的形成，所述肿瘤可在小鼠的血流和腹膜渗出液(腹水)中产生高浓度的所需抗体。
然后应用标准免疫试验测试测试样本和/或对照样本中含糖分子的存在。
本发明的第三部分明确包括与本发明含糖分子或其糖部分、脂类部分或蛋白质部分交叉反应的单克隆抗体。
本发明的第四部分包括用于在人或其他哺乳动物受试者中检测癌症的诊断试剂盒，该试剂盒包含一定量的本发明分离的含糖分子，所述分子适于用作校正标准，以及包含一种或多种适用的缓冲液。
″校正标准″意指用于辅助测定所述分子的量和/或该分子的一种或多种物理特性的参考样本。通常校正标准为分离形式以使由污染物产生的误差结果减至最小。因此，文中描述的诊断试验的对照样本可为校正标准。
缓冲液可为适于悬浮校正标准或对照样本和/或测试样本的任何缓冲液，用于接下来应用免疫学方法、质谱或其他检测方法进行试验。备选地，或另外地，缓冲液可为对本发明含糖分子进行免疫检测试验时适于进行抗体抗原结合反应的任何缓冲液。
在一备选实施方案中，本发明包含用于在人或其他哺乳动物受试者中检测癌症的诊断试剂盒，该试剂盒包含与分离的含糖分子特异结合的一定量的抗体，以及包含一种或多种适用的缓冲液。
优选地，抗体为单克隆抗体。
在进一步备选的实施方案中，本发明包含用于在人或其他哺乳动物受试者中检测癌症的诊断试剂盒，该试剂盒包含一定量本发明的分离的含糖分子，所述分子适于用作校正标准，包含与分离的含糖分子特异结合的抗体，以及包含一种或多种适用的缓冲液。
根据前述的一个或多个实施方案的试剂盒优选地提供使用说明书。根据文中提供的说明书，本领域内的技术人员了解这些试剂盒的应用。
以下提供的非限定性实施例意在进一步描述本发明分离的含糖分子，以及其在人或其他哺乳动物中检测多种不同癌症的用途。
实施例实施例1荷瘤动物和人的血液中含糖的m/z 991离子的缺失材料和方法1.肿瘤模型大鼠大鼠为雌性Fischer 344大鼠，携带有高转移性大鼠乳腺癌13762 MAT(Parish等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)40，511-518，1987)。以先前描述的方法体外维持肿瘤细胞(Parish等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)40，511-518，1987)。为在大鼠中诱发肿瘤，动物(10-13周龄)s/c注射106个13762 MAT细胞且约13天后出现肿瘤(直径为15-17mm)。
小鼠将高度恶性和转移性的B16F1黑素瘤细胞系s/c注射(106个细胞/小鼠)到雌性C57BL/6小鼠，其约15天后出现肿瘤(直径为12-14mm)。
人应用诊断为结肠癌的受试者，并从其收集柠檬酸化的血浆。
2.血清和血浆样本从健康人受试者和患结肠癌的受试者中，或备选地从健康和荷瘤的C57BL/6小鼠或者从健康或荷瘤的Fischer 344大鼠中收集带有或不带有抗凝剂(柠檬酸-磷酸葡萄糖)的血液。收集后，不含抗凝剂的血液在37℃孵育30分钟，4℃过夜储存，然后收集血清。通过离心(4000xg，12分钟)加抗凝剂的血液获得血浆样本。
3.血清的级分-硫酸铵/吡啶法用盐酸(HCl)使血清或血浆(2-3ml)酸化(pH 5.5到pH 5.8)。用1倍体积的过饱和硫酸铵与血清混合，置4℃3小时以沉淀部分蛋白质。置4℃以10,000xg离心10分钟并收集上清。加入硫酸铵粉使其饱和度为90-95％，然后置4℃混匀过夜以进一步去除蛋白质。4℃于100,000xg离心混合物1小时并收集上清。然后在4℃持续搅拌中将乙腈(四倍体积)加入到上清。混合物放置5分钟后倒出并收集乙腈层。将余下的混合物于1500xg离心5分钟并收集残余的乙腈层。将乙腈级分合并并挥发掉溶剂。剩余物重悬在氯仿/甲醇/水(CMW；2/43/55；1ml)中并两次加到预平衡的C18Seppak cartridge柱(Waters，Taunton，MA)。收集洗出液(未吸附级分)。用CMW(1ml)洗涤容器并将洗涤液通过cartridge柱。该洗出液收集至未吸附级分。然后分别用2ml的水、甲醇/水、甲醇、氯仿/甲醇和氯仿顺序洗脱cartridge柱。分别收集所有的洗脱级分。真空(SpeedVac)干燥洗脱级分。将未吸附级分和水级分重悬在最小量的水中并用1kDa分子量截止透析膜用水进行彻底透析。真空(SpeedVac)干燥透析液。将其再溶解在10μl的相关溶剂中并用如以下描述的MALDI-TOF MS进行分析。
4.MALDI-TOF MS分析为制备质谱样本，真空干燥级分。将直流级分及甲醇/水级分溶解在水(200μl)中，并用1kDa分子量截止透析膜用水进行彻底透析，并蒸发干燥。所有级分再溶解到10μl的相关溶剂中，以将其加载到质谱仪。
如先前所描述的制备级分(1μl)并通过涡旋与基质溶液[2-(4-羟基苯偶氮基)苯甲酸(HABA)溶于甲醇中的溶液，为3.5mg/ml，从中取出2μl]混合。将混合物(1μl)加载到具有96个加载位置的样本平板上，并室温干燥。然后将样本平板装入MALDI-TOF MS(TofSpec-2e；Micromass，Manchester，UK或Voyager Elite-DE；BioPerceptive)中。用氮激光(337nm)进行电离，并以线性或反射器负离子模式进行分析。对含目的离子的一些样本进行源后衰变(PSD)断裂。以m/z比给出的数据显示每一峰的质荷比，峰高表示为样本中检测到的最大丰度分子的百分比高度。
结果我们发现，当用MALDI-TOF MS分析时(图1A、2A和3A)，通过健康大鼠、小鼠或人的血清的直流级分(即不吸附到C18Seppak柱的级分)含有非常显著的质荷比约为991的负离子。该负离子在荷瘤大鼠的血清(图1B)、荷瘤小鼠的血清(图2B)和结肠癌患者的血浆中(图3B)缺失。
所有三种受测试的m/z 991离子的源后衰变断裂(图4A、图4B和图4C)基本相同，提示该分子在大鼠、小鼠和人中是相同的。
进一步的研究发现，皮下注射106个B16黑素瘤细胞仅两天后，m/z 991离子即在小鼠血清中缺失。此时小鼠中并不存在明显的肿瘤，这进一步表明了该癌标记物在癌症早期诊断中的应用潜力。
尽管本发明参照特定的优选实施方案和实施例进行了描述，领域内的技术人员将会明晓，本发明的变更和改变形式，如果其与本发明的总原则和精神一致，也包括于本发明中。
权利要求
1.一种癌标记物，其包含与健康受试者相比较在患有癌症的受试者中以降低水平存在的质荷比约为991的带负电荷分子或所述带负电荷分子的衍生物。
2.权利要求1的癌标记物，其为分离的形式。
3.权利要求1或权利要求2的癌标记物，其中带负电荷的分子包含糖、磷酸酯或硫酸酯。
4.权利要求3的癌标记物，其中带负电荷分子包含原位O-连接或N-连接到蛋白质部分或原位连接到脂类部分的糖部分。
5.权利要求1的癌标记物，其中衍生物包含带负电荷分子的片段。
6.权利要求5的癌标记物，其中片段具有的m/z比选自约241、约644、约705、约749和约947。
7.权利要求6的癌标记物，其包含至少两个所述片段。
8.权利要求6的癌标记物，其包含至少三个所述片段。
9.权利要求6的癌标记物，其包含至少四个所述片段。
10.权利要求6的癌标记物，其包含所有所述片段的指纹。
11.权利要求1的癌标记物，其中衍生物包含共价连接荧光配基、酶配基、放射性配基、肽配基或抗体配基的带负电荷分子。
12.在人或非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括(i)测定来自疑患癌症的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含m/z比为约991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本的癌标记物或衍生物的水平进行比较，或与已制定的用于健康受试者的水平进行比较，其中与健康受试者的水平或已制定的用于健康受试者的水平相比该癌标记物或衍生物降低的水平为癌症的征兆。
13.在人或非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括(i)测定来自疑患癌症的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含m/z比为约991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)的癌标记物或衍生物的水平与加到测试样本中的内标水平进行比较，其中与内标的水平相比该癌标记物或衍生物降低的水平为癌症的征兆。
14.在人或非人哺乳动物受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括测定来自疑患癌症的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含m/z比为约991的带负电荷分子或其衍生物；与同一测试样本中的另一标记物的水平相比较，其中癌标记物与该另一标记物的比率的变化为癌症的征兆。
15.权利要求12到14中任何一项所述的方法，其中所述癌标记物、内标或另一标记物的水平通过质谱或色谱技术进行测定。
16.权利要求15的方法，其中癌症为神经外胚层起源的癌症。
17.权利要求15的方法，其中癌症选自癌、淋巴瘤和肉瘤。
18.权利要求15的方法，其中癌症为黑素瘤。
19.权利要求15的方法，其中癌症为腺癌。
20.权利要求15的方法，其中癌症为结肠癌。
21.权利要求15的方法，其中测试样本和/或对照样本为体液或其级分。
22.权利要求21的方法，其中体液为血液。
23.权利要求21的方法，其中级分为血清或来自血清的级分。
24.权利要求12到23中任何一项所述的方法，其还包括测定测试样本或对照样本中癌标记物的丰度，和/或测定所述样本中癌标记物的相对丰度。
25.权利要求12到23中任何一项所述的方法，其还包括第一个步骤即获得样本。
26.权利要求12到23中任何一项所述的方法，其还包括通过确定其片段特性来证实癌标记物的特征。
27.在人或非人哺乳动物受试者中监测癌症治疗的方法，其包括(i)测定来自正进行癌症治疗的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含m/z比为约991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本的癌标记物或衍生物的水平进行比较，或与已制定的用于健康受试者的水平进行比较，其中水平的提高作为成功治疗的征兆。
28.在人或非人哺乳动物受试者成功治疗癌症后诊断其复发的方法，其包括(i)测定来自经癌症治疗的受试者的测试样本中癌标记物的水平，其中所述癌标记物包含m/z比为约991的带负电荷分子或其衍生物；以及(ii)将(i)的癌标记物或衍生物的水平与来自健康受试者的对照样本的癌标记物或衍生物的水平进行比较，或与制定的用于健康受试者的水平进行比较，或与来自癌症成功治疗后的该受试者样本中的水平进行比较，其中降低的水平为癌症复发的征兆。
全文摘要
提供了用于在人或非人哺乳动物受试者中诊断癌症的新的癌标记物，特别提供了包含质荷比(m/z)约为991的带负电荷分子的癌标记物。本发明的癌标记物可用于通过测试生物样本中该癌标记物水平的降低，来确定该样本中一种或多种癌细胞或肿瘤的存在。
文档编号C12Q1/68GK1554021SQ02817623
公开日2004年12月8日 申请日期2002年8月5日 优先权日2001年8月3日
发明者C·R·帕里什, V·M·卡巴尔达－克兰, C R 帕里什, 卡巴尔达-克兰 申请人:生物环境有限公司