专利名称：基因重组伊卡因及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型多肽。更具体地说，本发明涉及一种特异性活化凝血酶原的基因重组伊卡因(ecarin)及所述基因重组伊卡因的制备方法。
背景技术：
一些动物具有强效毒液，如蛇毒、蜘蛛毒、蝎毒和蜂毒。研究表明，这些毒液实际上包含一些有用的物质，包括神经毒素、出血毒素、血栓毒素、生理活性肽、细胞生长因子等。
伊卡因是一种从锯鳞蝰(Echis carinatus)分离的蛇毒来源蛋白酶(T.Morita等，J.Biochem.83，559-570，1978)，可特异性地活化凝血酶原。S.Nishida等(Biochemistry，34，1771-1778，1995)克隆了编码伊卡因的cDNA以揭示其结构。伊卡因(一种糖蛋白)是一种金属蛋白酶，成熟的伊卡因共有426个氨基酸残基，有一个包含螯合Zn2+的镶嵌结构、单链蛇毒多肽域和富含Cys域，和RVV-X(拉塞蝰蛇毒X激活子)的H链具有61％的同源性。伊卡因是一种与Xa因子截然不同的酶，因为它的酶活性可以被EDTA灭活，而不能被DFP或抗凝血酶III灭活。
伊卡因活化的靶底物之一，即凝血酶原是凝血酶的前体，而凝血酶是多种血液凝固因子之一。活化后生成的凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，能与多种底物相互作用，在生物体内以凝固与抗凝固方式发挥作用。在人体血液里，Xa因子通过在凝血酶原的两个位点即Arg-Thr和Arg-Ile限制性裂解凝血酶原而使之活化，而伊卡因只在Arg-Ile位点水解凝血酶原，产生分子量相对较大的间凝血酶(meizothrombin)。基于伊卡因的底物高度专一性，它可通过Arg-Ile位点裂解将前凝血酶(prethrombin)-2(凝血酶原去除Gla域和Kringle域的产物)转化为具活性的凝血酶(α-凝血酶)。尽管同属于丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶同样能使Arg-Ile位点裂解，但其更倾向于裂解别的位点，而伊卡因由于其对于Arg-Ile位点裂解的高度专一性只裂解该位点而不裂解任何其它位点。用胰蛋白酶活化前凝血酶-2，尽管可观察到前凝血酶-2部分活化成α-凝血酶，大部分得到的α-凝血酶会进一步降解，因此将前凝血酶-2完全转化为α-凝血酶是不可能的。相较之下，将伊卡因加入前凝血酶-2中能定量地将前凝血酶-2转化为α-凝血酶而没有任何副产物，因为伊卡因仅裂解凝血酶原-2中唯一的Arg-Ile位点。
如上所述，在凝血酶原转化为α-凝血酶的生物过程中，凝血酶原经过称为间凝血酶的中间体而活化。在生物体内，Xa因子首先对凝血酶原的Arg-Ile位点进行切割，形成间凝血酶。然后Xa因子进而对间凝血酶的Arg-Thr位点进行切割将之完全活化成α-凝血酶。众所周知，间凝血酶虽然有蛋白酶活性，但其底物专一性与α-凝血酶截然不同。在保留其活化蛋白酶C的能力的同时，它凝聚纤维蛋白原的活性极低。尽管间凝血酶显示这样的特征性底物专一性，如上所述因为Xa因子切割凝血酶原的两处位点即Arg-Thr和Arg-Ile，间凝血酶易于转化成α-凝血酶因而不能稳定存在于生物体内。然而用伊卡因活化凝血酶原可制备稳定的间凝血酶，因为伊卡因仅裂解Arg-Ile位点。而且，既然伊卡因可以作用于无维生素K存在条件生物合成的异常凝血酶原，它也用于测定血液中这种异常凝血酶原的水平。
发明内容
如上所述，人们发现伊卡因具有工业上有用的活性。然而到目前为止，其唯一来源为锯鳞蝰，因而由于其有限的可用量而不能用于工业化生产中。在目前的情况下，伊卡因由试剂制造商作为试剂出售，但由于其价格高并且不能充足供应，在工业上大规模应用中使用伊卡因活化前凝血酶-2或制备间凝血酶是不可能的。另外，不能保证作为来源的野生锯鳞蝰可以稳定地供应。而且从蛇毒角度讲，还必须考虑饲养蛇的工作人员的安全问题。综合这些因素，要获得大量的伊卡因显然是非常困难的。考虑到从锯鳞蝰制备伊卡因的危险和局限性，必须找到以更安全、更稳定的方式制备伊卡因的其他来源和方法。
在这种情况下，本发明需要解决的问题之一是致力于建立一种在工业规模上有效制备凝血酶的方法，利用基因重组技术提供伊卡因用于凝血酶的生产。
为了解决上述问题，本发明人进行了认真的研究，并成功完成本发明，提供了利用基因重组技术有效制备伊卡因的方法。
因此，本发明的目的之一是提供基因重组伊卡因(以下亦称“重组伊卡因”)，它能通过切割Arg-Ile位点将前凝血酶-2转化为α-凝血酶或将凝血酶原转化为间凝血酶。为达到此目的，提供了一种具有SEQ ID NO1的氨基酸序列、分子量约为80,000的蛋白质，或所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基发生缺失、替换或添加的一个或一系列肽段，或上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列的部分序列，或包含上述氨基酸序列中任一种氨基酸序列作为一部分的氨基酸序列。
本发明也提供了一种编码上述重组伊卡因、具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的基因片段，或编码具有所述蛋白部分氨基酸序列的多肽的基因片段，和包含这些基因片段的质粒。本发明还包括用所述质粒转化的重组微生物和动物细胞。本发明进一步包括使用这些转化的微生物或动物细胞制备目的重组伊卡因或具有重组伊卡因部分氨基酸序列的多肽的方法。
附图简述
图1.表达载体pCAGG-S1(Sal).dhfr图解。
图2.所示为凝胶过滤所得级分的SDS-PAGE和蛋白染色结果，在对产生伊卡因的SP2/0细胞的培养上清液进行伊卡因纯化中，凝胶过滤是最后一个步骤。
图3.凝血酶原加入重组伊卡因后对S-2238的裂解活性。
实施本发明的最佳方式以文献(S.Nishida等，Biochemistry，34，p.1771-1778，1995)报道的序列为模板，以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4序列为引物，进行PCR，获得编码重组伊卡因蛋白的基因。
伊卡因或其部分蛋白可以通过如下方法获得，将编码全长伊卡因结构区一部分的cDNA片段引入表达载体，用所得表达载体转化合适的微生物或动物细胞，培养转化体微生物或动物细胞以产生伊卡因或其部分蛋白。对于伊卡因的部分蛋白的生产来说，可使用肽合成仪。
将微生物或动物细胞内合适的分泌信号肽连接到编码本发明蛋白质的DNA的上游，以使该蛋白得以表达并分泌到培养基中。对于这种用于分泌目的的改进DNA来说，其优势在于分泌入培养基的蛋白易于回收。这种信号肽序列包括用于大肠杆菌的pel B信号肽序列(S.P Lei等，J.Bacteriology Vol.169，4379-4383，1987)、用于酵母的α因子信号肽(A.J.Brake，Yeast Genetic Engineering，p269，Butterworth，1989)、用于动物细胞的免疫球蛋白信号肽序列SG-1(H.Maeda等，Hum.Hybridomas Vol.2，124-134，1991)和C25信号肽序列(专利，国际
发明者米村宏, 今村隆幸, 中武博, 副岛见事, 野崎周英, 事, 幸, 英 申请人:财团法人化学及血清疗法研究所