专利名称：一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法。
嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列(K.Titani，M.A.Hermodson，L.H.Ericsson，K.A.Walsh，andH.Neurath，Nature(London)New Biol.，1972，283，35)和三维空间结构(P.Mcolman，J.N.Jansonius，and B.W.Matthews，J.Mol.Biol.，1972，70，701)都已确定。嗜热菌蛋白酶的活性中心是由锌离子、Glu-143和His-231组成(W.R.Kester，andB.W.Matthews，Biochemistry，1977，16，2056)。每摩尔分子中含有1mol的Zn2+和4mol的Ca2+。Ca2+对酶的热稳定性起决定作用，而Zn2+对于酶的活性是必须的。嗜热菌蛋白酶在成熟前以酶原前体的形式存在，肽段从N端开始依次为引导肽(pre-peptide)、前导肽(pro-peptide)和成熟肽(mature-peptide)。嗜热菌蛋白酶的成熟肽本身并不能自然获得酶活性，只有在自身剪切后的前导肽的辅助下，没有活性的成熟肽才能正确折叠成为有活性的成熟肽。
嗜热菌蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点，具有广泛的应用价值，可用于食品、医药、制革、纺织等方面，目前应用较多的是在工业上生产二肽甜味剂(NagayasuT，Miyanaga M，Tanaka T，et al.Biotechnol Bioengineer，1994，431108～1117.)。
目前对嗜热菌蛋白酶的研究较多，但从天然菌株中分离得到的嗜热菌蛋白酶成本非常昂贵。也有采用基因工程的方法，通过基因重组的方式得到，但酶产量也较低，生产成本也很高。
本发明提出的生产嗜热菌蛋白酶的方法，是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。其具体步骤如下1、蛋白酶全长基因的克隆根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)(购自Stretagene公司)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm。
2、表达载体的构建以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒(购自Novagen公司)重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；其中pnmthm1为AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT和ptmthm3为AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；载体构建图见
图1。
3、表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。最后对所得蛋白进行干燥和复性处理，并对酶活性进行测定。
本发明中，分离纯化方法如下将表达菌体洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.0-3.0mol/L尿素的洗液(50mMolTris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，1.0-3.0mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含6-10mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，6-10mol/L尿素)中使蛋白变性。
蛋白的干燥方法如下将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～30℃中干燥10～20小时后得到变性蛋白干燥粉。
蛋白的复性方法如下将上述变性蛋白干燥粉以一定比例溶解并迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，4μMZnCl2，6-10mM dTT)中，1-2小时，，使之复性，lhr后加入1/2体积的3X SDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
酶活的测定方法如下将嗜热菌蛋白酶用醋酸钙缓冲液配成0.1mg/mL的酶液，在试管中，加入1.9mL 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)及1mL2％酪蛋白溶液(pH8.0)，加入0.1mL酶液，摇匀后在35℃的恒温水浴中反应10分钟，加入2mL 1.2mol/L三氯乙酸溶液，在35℃的恒温水浴中放置30分钟，过滤，于280nm处测定滤液的吸光度。
本发明首次选用嗜热蛋白酶全长基因为模板，用大肠杆菌进行表达，嗜热蛋白酶的收率高，且得到的嗜热菌蛋白酶活性高，可达300-400万U/g；成本低。
1、表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)后经接种于1000mL培养液中培养至OD600为0.4时以IPTG诱导表达3小时，收集一定量的表达菌体，洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.5mol/L尿素的洗液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，1.5mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含6mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，6mol/L尿素)中使蛋白变性。
2、蛋白的干燥将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-40℃～28℃中干燥18小时后得到变性蛋白干燥粉4g。
3、蛋白的复性将上述变性蛋白溶液以一定比例迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMolCa2+，pH7.4，4μMZnCl2，6mM dTT)中，1小时，使之复性，1hr后加入1/2体积的3XSDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
4、酶活的测定按照上述方法测定得到酶活为300万U/g.实施例2蛋白酶全长基因的克隆和表达载体的构建同前述。
1、表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)经接种10L培养液中培养至OD600为0.6时以IPTG诱导表达6小时，收集表达菌体，洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含3.0mol/L尿素的洗液(50mMolTris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，3.0mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含9mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，9mol/L尿素)中使蛋白变性。
2、蛋白的干燥将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～25℃中干燥16小时后得到变性蛋白干燥粉50g。
3、蛋白的复性将上述变性蛋白溶液以一定比例迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMolCa2+，pH7.4，4μMZnCl2，10mM dTT)中，70分钟，使之复性，lhr后加入1/2体积的3XSDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
4、酶活的测定按照上述方法测定得到酶活为350万U/g。
权利要求
1.一种嗜热菌蛋白酶的生产方法，其特征在于是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶，具体步骤如下(1)蛋白酶全长基因的克隆根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm；(2)表达载体的构建以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；其中pnmthm 1为AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT，ptmthm3为AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；(3)表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以异丙基硫代半乳糖苷诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于分离纯化的步骤如下将表达菌体洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.0-3.0mol/L尿素的洗液反复多次洗涤包含体，溶于含6-10mol/L尿素的溶液中使蛋白变性。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于还对所得蛋白进行干燥，具体步骤如下将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～30℃中干燥10～20小时后得到变性蛋白干燥粉。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于对所得蛋白还进行复性，具体步骤如下将上述变性蛋白干燥粉以一定比例溶解并迅速稀释到复性液中，1-2小时，使之复性，1小时后加入1/2体积的3X SDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
全文摘要
本发明是一种人工基团生产嗜热菌蛋白酶的方法。它通过构建表达载体—转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。本发明蛋白酶收率高，得到的蛋白酶活性也高，达到300－400万U/g，且生产成本低。
文档编号C12P21/00GK1446911SQ03115320
公开日2003年10月8日 申请日期2003年2月8日 优先权日2003年2月8日
发明者吴奇能 申请人:复旦大学