专利名称：多形链霉菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有乙酰胆碱酶抑制作用的微生物。
背景技术：
神经生理学研究揭示，乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)水解中枢神经系统和副交感神经节后纤维和主神经节前纤维冲动时所释放的乙酰胆碱(Ach)以保证神经兴奋与抑制的协调统一。Ach是记忆形成的必需神经递质和长期记忆的生理基础。Ach通过脑干网状结构上行激动系统维持大脑觉醒状态，增加Ach合成或减少Ach的分解，可影响学习记忆功能。人类随年龄增加而记忆功能退变，与中枢胆碱系统功能下降平行。抑制乙酰胆碱酯酶的活性，可改善人的记忆。
发明内容
本发明的目的是提供一种其发酵液具有抑制乙酰胆碱酯酶作用的微生物——多形链霉菌。
本发明所述的多形链霉菌命名为多形链霉菌Streptomyces pleomrphus YIM32065，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏编号为CCTCC NOM203018。
本发明所述的多形链霉菌系从我国云南丽江玉龙雪山采集的土壤样品中分离得到。现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2003年2月14日，保藏编号为M203018。
本发明所述的链霉菌在大多数培养基上生长良好，气生菌丝呈黄白至粉红灰色，基内菌丝黄白至黄褐色。孢子链波曲，或穗状。孢子短杆状，孢子表面光滑或不规则形状，表面粗糙。明胶液化、淀粉水解、硝酸还原呈阳性，牛奶凝固、胨化呈阴性，不产生硫化氢，不形成黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸。细胞壁含有L-DAP和甘氨酸，全细胞水解物含有半乳糖和木糖。
培养条件(一)斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
(二)种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
(三)发酵培养条件按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g葡萄糖10g；蛋白胨3g氯化钠2.5g；碳酸钙2g蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。即得到发酵液。
本发酵液对乙酰胆碱酯酶抑制试验1.原理血液中胆碱脂酶(acetylcholinesterase)催化乙酰胆碱水解。一定温度和一定pH的条件下作用一定时间，水解的乙酰胆碱量与酶的活性有关，加入一定量的乙酰胆碱后，测定剩余的乙酰胆碱量即可计算出水解的乙酰胆碱量，从而得知胆碱脂酶活性。
2.测定方法
a)试剂I.磷酸盐缓冲液取磷酸氢二钠(3级品)16.72g和磷酸二氢钾(3级)2.72g，加蒸馏水溶解，稀释至1000ml，其pH为7.2，室外温较高时可保存于冰箱内。
II.基质称取1.2716g氯化乙酰胆碱，加蒸馏水至100ml，配成0.07mol/L乙酰胆碱贮备液，保存于冰箱内，临用前再将此溶液稀释至0.007mol/L。
III.1mol/L盐酸羟胺(NH2OH·HCl)溶液称取盐酸羟胺13.9g，加蒸馏水稀释至200ml，室温过高时(30℃以上)可保存于冰箱内。
IV.3.5mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠(3级)14.0g，加蒸馏水稀释至100ml。
V.1∶2盐醛溶液量取比重为1.18的浓盐酸(3级)100ml，加蒸馏水200ml。
VI.10％三氯化铁溶液称取三氯化铁(3级)10.0g，加蒸馏水10ml左右，然后加浓盐酸0.84ml，在加温溶解后，再加蒸馏水至100ml。
b)操作步骤*样品管I.取0.98ml磷酸盐缓冲液和0.02ml全血于试管内，置37℃水浴中预热3-5min。
II.按加入本发酵液的乙醇抽提物样品编号次序迅速正确地加入1.0ml0.007mol/L乙酰胆碱溶液，置37℃温水浴中。
III反应30min后立即按同样次序迅速加入碱性羟胺溶液(由1mol/L羟胺溶液与3.5mol/L氢氧化钠溶液在临用前20min等体积混合而成)4.0ml，并充分振荡2min。
IV继续加入1∶2盐酸溶液2.0ml，充分振荡约2min后，再加入10％三氯化铁溶液2.0ml，充分振荡。
V用普通滤纸将上述溶液(共10ml)过滤，滤去蛋白的滤液盛入比色杯中用绿色滤光片(530nm波长)。以蒸馏水调零进行比色。
*对照管I对照管1反应液由1.0ml缓冲液与1.0ml蒸馏水代替。其它操作与样品管相同，该管为无血无乙酰胆碱的试剂空白对照。
II对照管2反应液由0.98ml缓冲液、0.02ml全血及1.0ml蒸馏水代替。其它操作与样品管相同，该管为血与试剂的空白对照。
III对照管3反应液由1.0ml缓冲液及1.0ml缓冲液及1.0ml 0.007mol/L乙酰胆碱液配成。其它操作与样品管相同，该管为未水解的全量乙酰胆碱的对照。
上述三种对照管在每批试验时都应与样品管同时配制(做一管或二管即可)c)计算I.酶活性单位的计算全血胆碱酯酶活性值以水解μmol/L乙酰胆碱/0.02m1血·30min表示。
II.酶活性值百分数的计算 本菌株具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用，其发酵液对乙酰胆碱酯酶的抑制率达100％，抑制率89.47％，IC50＝2.63×10-6μg/ml，而且药效持久、稳定、无毒，具有从中开发出新型、高效、无毒的天然药物的巨大潜力。
本发明所述的链霉菌命名为多形链霉菌已于2003年2月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏编号为M203018，保藏单位地址武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072。
图1为本发明所述的多形链霉菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的电镜照片。
图2为本发明所述的多形链霉菌的培养特征。
图3为本发明所述的多形链霉菌的生理生化特征。
图4为本发明所述的多形链霉菌的碳氮源利用情况。
图5为本发明所述的多形链霉菌和部分相关菌在GenBank数据库的16SrDNA序列及登录号。
图6为本发明所述的多形链霉菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施例方式
实施例从我国云南省丽江玉龙雪山采集的土壤样品，在实验室中按下列条件培养，即可获得本发明所述的多形链霉菌。
(一)菌株培养条件1.斜面培养条件；培养基；葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
2.种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，PH7.2，培养温度为28℃。
按以下发酵培养条件培养，即可获得发酵液按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
本发明所述的链霉菌的16S rDNA部分序列如下GCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCATTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGAGCCTCCATCGCATGGTGGGGGCTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCGGAGACGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAACTCTTCGGAGGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCG(ATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCCTTGTGGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGC
权利要求
1.一种多形链霉菌，其特征在于命名为多形链霉菌Streptomycespleomorphus YIM 32065，现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称；中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203018。
2.根据权利要求1所述的多形链霉菌，其特征在于该菌种的16S rDNA部分序列如下GCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCATTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGAGCCTCCATCGCATGGTGGGGGCTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCGGAGACGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAACTCTTCGGAGGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCCTTGTGGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGC
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的微生物，本发明特征在于命名为多形链霉菌Streptomyces pleomorphus YIM 32065，现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203018。本发明具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性，其发酵液对乙酰胆碱酶的抑制率在100％，IC
文档编号C12N15/31GK1542128SQ03124238
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月29日 优先权日2003年4月29日
发明者姜成林, 姜怡, 李文均, 文孟良, 李铭刚, 徐丽华 申请人:云南省微生物研究所