专利名称：红白链霉菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有抗植物病作用的微生物。
背景技术：
稻瘟病是由Pyricularia oryzae引起的水稻病害；瓜白粉病是由Sphaerothariafuliginea引起的病害，很多农作物都有发生。引起这些农作物病害的致病菌都是真菌。有效的抑制这些真菌是亟待研究的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种其发酵液具有抗致病真菌作用的微生物—红白链霉菌。
其发酵液还对藤黄微球菌有较强抗菌活性。
本发明所述的红白链霉菌命名为红白链霉菌Streptomyces roseoalbus YIM31634，保藏编号为CCTCC NOM203016。
本发明所述的红白链霉菌系从我国云南省永胜县采集的土壤样品中分离得到。现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2003年2月14日，保藏编号为CCTCCNOM203016。
本发明所述的红白链霉菌在大多数培养基上生长良好，气生菌丝呈粉红白至黄白色，基内菌丝浅橙黄至褐黄色。基丝分枝不断裂；气丝发育良好，直或波曲，长孢子链；孢子表面光滑。明胶液化、牛奶凝固、胨化、硝酸还原、淀粉水解呈阳性，产生硫化氢，形成黑色素，纤维素上不生长。能利用葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸；不利用乳糖、棉子糖、肌醇、山梨醇。细胞壁含有L-DAP和甘氨酸，全细胞水解物不含特征性糖。
培养条件(一)斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
(二)种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基；糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
(三)发酵培养条件按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。得到发酵液。
本发酵液的抗病试验(一)、黄瓜白粉病盆栽生物测定法(上海农药研究所协助测定)试验用药前一天选择一张真叶2/3大小，长势一致瓜苗，用油性记号笔写上标签编号、插入盆栽稻苗盆内，按序排放，供试验用。或者选择子叶长足后期，即将长真叶时长势一致瓜苗，同法排号。用喷雾法将药剂(本发酵液的乙醇抽提物)喷洒于瓜苗叶片上。喷好药后将试剂在喷药廊或温室中晾三小时左右。选择合适的接种时间，接种诱发。白粉病菌分生孢子培养参见“白粉病菌培养管理标准”。用加有少量表面活性剂(如吐温80等)的纯净水，洗取长满白粉菌黄瓜叶片上的新鲜孢子，用双层纱布过滤，制成孢子悬浮液，用血球计数板镜检计数，控制孢子浓度10万个/ml左右，备用。用细雾手喷枪及WM-4型无油气体压缩机控制压力0.1MP(1kgf/cm2)，在排列整齐的瓜苗真叶表面均匀喷雾接种孢子悬浮液，每盘(80-90盆苗)喷菌液40ml左右，后仍置喷药廊中，自然风干，然后移至恒温室(26-28℃)中，7-8天后调查。按有关标准进行数据处理及分析。
(二)水稻稻瘟病盆栽生物测定法(上海农药研究所协助测定)试验用药前一天选择二叶一心或三叶一心、长势一致盆栽稻苗，按序排放，供试验用。参见“药剂喷洒标准”进行喷雾，喷好药(本发酵液的乙醇抽提物)后将试材在喷药廊或温室中晾干(3小时左右)。或者使用灌根法，按每亩用有效量50g、100g、200g三种剂量，分别根据所用盆栽用盆大小，按量均匀施于有浅水层的各盆稻苗中。
接种诱发选择合适的接种时间接种诱发。孢子培养参见“稻瘟病菌培养管理标准”。在已长满孢子的培养基皿中，加入纯净水，用不锈钢平勺轻轻刮取表面孢子，尽量注意不要弄碎表面菌丝层，用双层纱布过滤，制成孢子悬浮液，取0.1ml孢子悬浮液，从血球计数板盖玻片边缘加入计数板中，在显微镜下用计数器计数，控制孢子浓度在20-30万个/ml，备用。用细雾手喷枪及WM-4型无油气体压缩机控制压力0.1MP(1kgf/cm2)，在稻苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液每盘(80-90盆小苗)喷菌液40ml左右，立即小心移至恒温室(26-28℃)中下层保湿箱中保湿，保湿(RH100％)诱发，24小时后再将稻苗从中下层移至顶层有灯光照射(2000勒克司光照强度)的保湿箱中，逐渐打开保湿箱通气孔，使箱内湿度维持80-90％，不使稻苗过湿发黄，并每天观察稻苗生长有无异常，五天左右空白对照病斑稳定后即可根据病斑多少进行分级调查。
普筛时2级以下方可进入再筛。按有关规定进行数据处理及分析。
(三)菌株YIM 31634的筛选结果见附图7。
本菌株具有抗真菌作用，其发酵液对稻瘟病(Pyricularia oryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)等的抗菌作用强，而且药效持久、稳定、无毒，其发酵液还对藤黄微球菌有较强抗菌活性。具有从中开发出新型、高效、无毒的天然农药的巨大潜力。
本发明所述的红白链霉菌已于2003年2月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏编号为M203016，保藏单位地址武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072。
图1为本发明所述的红白链霉菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的电镜照片。
图2为本发明所述的红白链霉菌的培养特征。
图3为本发明所述的红白链霉菌的生理生化特征。
图4为本发明所述的红白链霉菌的碳氮源利用情况。
图5为本发明所述的红白链霉菌和部分相关菌在GenBank数据库的16SrDNA序列及登录号。
图6为本发明所述的红白链霉菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
图7为本发明所述的红白链霉菌菌株YIM3 1634的筛选结果。
具体实施例方式
实施例从我国云南省永胜县采集的土壤样品，在实验室中按下列条件培养，即可获得本发明所述的红白链霉菌。
(一)菌株培养条件1.斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
2.种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
按以下发酵培养条件培养，即可获得发酵液按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
本发明所述的链霉菌是依据其形态学特征、细胞壁化学组分及16S rDNA序列的系统进化分析。该菌的16S rDNA全序列如下GCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAANCCCTTCNGGGTGGATTANTGGCGAACGGGTGAGTAACACNTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATGACACTTTCTCTCGCATGGGAGAAGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCACGATGAGCCCGCGGNCTATCAGCTAGTTGGTGAGGNAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCANACTCCTACNGGAGGCANCAGTGGGGAATATTNCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGT
AGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACNAGCGCAACCCTTGTTTTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGNAGACTGCCGGGGTCAACTCGNAGNAAGGTGGGGACGANGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCNGCACACGTGNTNCAATGGCAGGTNCAATNAGNTGCGAANCCGTAAGGNGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTNTCAGTTNGGATTGGGGTNTGCAACTCGNCCCCATGAAGTNGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGNTGCGGTGAATANGTTCC CGGNCC TTGTACACNCCGCCNGTCANGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCANCCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGCATCTCTGTAGTCAGCTCGNGTCGTGANATGTTGNG
权利要求
1.一种红白链霉菌，其特征在于命名为红白链霉菌Streptomyces roseoalbusYIM 31634，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203016。
2.根据权利要求1所述的红白链霉菌，其特征在于该菌种的16S rDNA全序列分析为GCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAANCCCTTCNGGGTGGATTANTGGCGAACGGGTGAGTAACACNTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATGACACTTTCTCTCGCATGGGAGAAGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCACGATGAGCCCGCGGNCTATCAGCTAGTTGGTGAGGNAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCANACTCCTACNGGAGGCANCAGTGGGGAATATTNCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACNAGCGCAACCCTTGTTTTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGNAGACTGCCGGGGTCAACTCGNAGNAAGGTGGGGACGANGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCNGCACACGTGNTNCAATGGCAGGTNCAATNAGNTGCGAANCCGTAAGGNGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTNTCAGTTNGGATTGGGGTNTGCAACTCGNCCCCATGAAGTNGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGNTGCGGTGAATANGTTCCCGGNCCTTGTACACNCCGCCNGTCANGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCANCCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGCATCTCTGTAGTCAGCTCGNGTCGTGANATGTTGNG
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种具有抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)等作用的微生物，本发明命名为红白链霉菌(Streptomyces raseoalbus)，现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203016。本发明菌株的发酵液具有抗稻瘟病(Pyriculariaoryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)的作用，效果稳定而持久，具有从中开发出新型、高效、无毒天然农药的巨大潜力。
文档编号C12N15/31GK1542129SQ03124239
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月29日 优先权日2003年4月29日
发明者徐丽华, 姜怡, 李文均, 文孟良, 李铭刚, 姜成林 申请人:云南省微生物研究所