专利名称：启动子与其应用的制作方法
技术领域：
本发明是有关于启动子及其应用。
背景技术：
在亚洲国家，红曲霉(Monascus)长期被用作为食品添加物。经红曲霉发酵的谷物呈现鲜红至紫色，且保有稻米原来形状。此外，红曲霉发酵产物也被认为具有促进健康的功效。将红曲霉应用于米酒制造是由于其具有高量的α-淀粉酶，可促使淀粉转化成葡萄糖。目前研究已确认红曲霉发酵产物如Monacolin K等的医疗效果。且红曲霉发酵产物所具有的保存效果也经实验证明。
本领域的主要研究焦点为红曲霉的基因产物或培养、生产的方法，然而，对于红曲霉序列标签(EST)基因库的研究正方兴未艾，红曲霉的序列标签可能提供重组DNA技术更多的信息。
发明内容
本发明人等对于由财团法人食品工业发展研究所所收集的红曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因库进行搜寻研究，发现两个高表达量的基因，经比对为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因)以及热休克蛋白基因(heat shock protein gene，简称Hsp基因)，并检测与确认此二基因上游区域的启动子区域。由此而完成本发明。
(I)acuF启动子因此，本发明的一型态为一种分离的DNA分子，其包括序列识别号1的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号1的核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。上述具有启动子活性的DNA分子亦可包括序列识别号1中第117至1116个连续核苷酸序列，或序列识别号1中约第117至约1116个连续核苷酸序列，较佳地为序列识别号1中第367至1116个连续核苷酸序列，或序列识别号1中约第367至约1116个连续核苷酸序列，更佳地为序列识别号1中第517至1116个连续核苷酸序列，或序列识别号1中约第517至约1116个连续核苷酸序列；或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由细菌或真菌取得，特别是由红曲霉属(Monascus sp.)，更特别是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可经基因工程方式， 由财团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，简称acuF)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因库建构、菌落杂交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶链式反应(PCR)。此外，熟悉此技艺人士亦可依据本发明所揭示的DNA序列，经由已知的PCR、杂交反应、或人工合成等获得本发明所述序列。上述严苛杂交条件可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P7 节。
本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码区域。上述启动子区域包括序列识别号1的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号1的核苷酸序列杂交的序列。特别是，上述启动子区域可包括序列识别号1中第117至1116个连续核苷酸序列，或序列识别号1中约第117至约1116个连续核苷酸序列，较佳地为序列识别号1中第367至1116个连续核苷酸序列，或序列识别号1中约第367至约1116个连续核苷酸序列，更佳地为序列识别号1中第517至1116个连续核苷酸序列，序列识别号1中约第517至约1116个连续核苷酸序列；或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。且上述启动子区域可由红曲霉属(Monascus sp.)取得，特别是由红曲霉属Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可经基因工程方式，由财团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，简称acuF)的起始子上游序列克隆而得。而上述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。所需蛋白质包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰岛素或生长因子。
本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子，上述启动子包括序列识别号1的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号1的核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是如以上重组DNA的启动子区域所定义。用于建构本发明载体的工具是指在适当的宿主细胞中可自行复制或可整合入宿主细胞的染色体的分子序列，例如质粒，噬菌体，或病毒。上述表达载体可任择地包括编码所需蛋白质的核苷酸序列。上述所需蛋白质包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰岛素或生长因子。
本发明的另一型态是有关于一种表达系统，包括上述定义的表达载体，以及一适于表达所需蛋白质的宿主细胞。上述载体是经由一转化方法被转化入上述宿主细胞。上述宿主细胞意指任何可用于表达所需蛋白质的细胞。适当的宿主细胞包括细菌、酵母菌、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或丝状真菌。上述丝状真菌可为红曲霉属(Monascus sp.)，特别是红曲霉属Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特别是BCRC38072。转化方法可采用目前已知的宿主-载体系统，对于属于曲菌属(Aspergillus)的丝状真菌施予一转化步骤。可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P5 节所述的方法。
本发明亦有关于一种转化株，包括a)序列识别号1，或b)序列识别号1的第117至第1116个连续核苷酸，或序列识别号1的约第117至约第1116个连续核苷酸，或c)序列识别号1的第367至第1116个连续核苷酸，或序列识别号1的约第367至约第1116个连续核苷酸，或d)序列识别号1的第517至第1116个连续核苷酸的核苷酸序列，或序列识别号1的约第517至约第1116个连续核苷酸的核苷酸序列，或在严苛条件下可与上述任一序列杂交的核苷酸序列。上述转化株更包括一编码所需蛋白质的核苷酸序列。
本发明亦有关于一种表达一蛋白质的方法。上述方法包括于一培养基培养上述含有编码所欲蛋白质的转化株，由转化株所在的培养基生产与累积所需蛋白质，以及由培养基收集所需蛋白质。
因此，本发明的一型态是提供一种分离的DNA分子，其包括序列识别号18的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号18的核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。
本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码区域。上述启动子区域包括序列识别号18的核苷酸序列或在严苛条件下可与该核苷酸序列杂交的序列，而上述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。
本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子。上述启动子包括序列识别号18的核苷酸序列或在严苛条件下可与该核苷酸序列杂交的序列。
本发明的又一型态提供一种分离的DNA分子，其包括序列识别号24的核苷酸序列或在严苛条件下可与该核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。
(II)Hsp启动子本发明的一型态提供一种分离的DNA分子，其包括序列识别号2的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号2的核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。上述具有启动子活性的DNA分子亦可包括序列识别号2中第443至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第443至约1478个连续核苷酸序列，较佳地为序列识别号2中第759至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第759至约1478个连续核苷酸序列，更佳地为序列识别号2中第982至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第982至约1478个连续核苷酸序列；或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由细菌或真菌取得，特别是由红曲霉属(Monascus sp.)，更特别是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可经基因工程方式，由财团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC 38072中热休克蛋白(heat shock protein，简称Hsp)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因库建构、菌落杂交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶链式反应(PCR)。此外，熟悉此技艺人士亦可依据本发明所揭示的DNA序列，经由已知的PCR、杂交反应、或人工合成等获得本发明所请序列。上述严苛杂交条件可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P7 节。
本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码区域。上述启动子区域包括序列识别号2的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号2的核苷酸序列杂交的序列。特别是，上述启动子区域可包括序列识别号2中第443至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第443至约1478个连续核苷酸序列，较佳地为序列识别号2中第759至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第759至约1478个连续核苷酸序列，更佳地为序列识别号2中第982至1478个连续核苷酸序列，或序列识别号2中约第982至约1478个连续核苷酸序列；或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。且上述启动子区域可由细菌或真菌取得，例如由红曲霉属(Monascus sp.)取得，特别是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可经基因工程方式，由财团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC 38072中热休克蛋白(heat shockprotein，简称Hsp)的起始子上游序列克隆而得。而上述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。所需蛋白质包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰岛素或生长因子。
本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子，上述启动子包括序列识别号2的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号2的核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是如以上重组DNA的启动子区域所定义。用于建构本发明载体的工具是指在适当的宿主细胞中可自行复制或可整合入宿主细胞的染色体的分子序列，例如质粒，噬菌体，或病毒。上述表达载体可任择地包括编码所需蛋白质的核苷酸序列。上述所需蛋白质包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰岛素或生长因子。
本发明的另一型态是有关于一种表达系统，包括上述定义的表达载体，以及一适于表达所需蛋白质的宿主细胞。上述载体是经由一转化方法被转化入上述宿主细胞。上述宿主细胞意指任何可用于表达所需蛋白质的细胞。适当的宿主细胞包括细菌、酵母菌、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或丝状真菌。上述丝状真菌可为红曲霉属(Monascus sp.)，特别是红曲霉属Monascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特别是BCRC38072。转化方法可采用目前已知的宿主-载体系统，对于属于曲菌属(Aspergillus)的丝状真菌施予一转化步骤。可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P5 节所述的方法。
本发明亦有关于一种转化株，包括a)序列识别号2，或b)序列识别号2的第443至第1478个连续核苷酸，或序列识别号2的约第443至约第1478个连续核苷酸，或c)序列识别号2的第759至第1478个连续核苷酸，或序列识别号2的约第759至约第1478个连续核苷酸，或d)序列识别号2的第982至第1478个连续核苷酸的核苷酸序列，或序列识别号2的约第982至约第1478个连续核苷酸的核苷酸序列，或在严苛条件下可与上述任一序列杂交的核苷酸序列。上述转化株更包括一编码所需蛋白质的核苷酸序列。
本发明亦有关于一种表达一蛋白质的方法。上述方法包括于一培养基培养上述含有编码所欲蛋白质的转化株，由转化株所在的培养基生产与累积所需蛋白质，以及由培养基收集所需蛋白质。
本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码区域。上述启动子区域包括序列识别号24的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号24的核苷酸序列杂交的序列，而上述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。
此外，本发明亦提供一种表达载体，其包括一启动子。上述启动子包括序列识别号24的核苷酸序列或在严苛条件下可与该核苷酸序列杂交的序列。
含有本发明启动子序列的表达载体的实施例可经由PCR方式增殖本发明的启动子序列，并于其下游接上具有标示功能的基因而得。所得表达载体可建构为筛选细胞转化的标志(marker)，例如，用于评估基因克隆的效率。此外，本发明的载体亦可作为红曲酶基因敲除(knockout)的工具，进行菌种改良，产生更安全及更具产业利用性的红曲霉种。
本发明的启动子序列尚可在其下游接上具有标示功能的基因及欲侦测的目标蛋白质基因，用于活体内(in vivo)或原位(in situ)侦测蛋白质间的交互作用及目标蛋白质的作用位置。
本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质方法的应用，可通过在启动子序列下游接上要表达的酶基因，采用本发明的表达系统，可缩短酶生产时间，亦可大为增加产量。例如，增加红曲霉蛋白酶的产量，可增进红曲霉以大豆粉作为培养基质的效率，降低生产成本，另增加红曲霉淀粉酶的产量，则可以增进红曲在酿酒时的糖化力，藉以改变制酒的制程及产生新风味。
本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质的方法的应用，亦可以在启动子的下游接上二次代谢产物基因，此表达系统可提前二次代谢产物的生产时间，增加产量，而大量减低生产成本。
此外，本发明的表达载体亦可以在启动子下游接上转录活化子(transcriptional activator)基因，通过大量表达此活化子，同时也活化其所调控的基因，而大为增加产量。
图1显示本发明实施例中的acuF启动子区域的克隆流程。
图2显示本发明实施例中的acuF启动子区域的重组载体。本发明的acuF启动子区域经转化进入载体pHygEGFP后形成重组载体pMS-acuF。
图3A与3B显示pMS-acuF转化后的绿色荧光蛋白表达情形。图3A为明视野下；图3B为荧光滤镜下。
图4显示本发明实施例中的Hsp启动子区域的克隆流程。
图5显示本发明实施例中的Hsp启动子区域的重组载体。本发明的Hsp启动子区域经转化进入载体pHygEGFP后形成重组载体pMS-hsp。
图6A与6B显示pMS-hsp转行后的绿色荧光蛋白表达情形。图6A为明视野；图6B为荧光滤镜之下。
图7显示PCR产物的电泳图。第1栏为1kb标记(Bio-1kbTM DNA ladder)；第2-5栏为编号1-4的转化株；第6栏为BCRC 38072野生型，(-)对照组；以及第7栏为pHygEGFP，(+)对照组。
大肠杆菌EP1300pMPF 001、大肠杆菌EP1300pMPF 002、大肠杆菌DH5αpMS-acuF、大肠杆菌DH5αpMS-Hsp已于公元2003年12月5日被寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110-2209，USA)，寄存编号分别为PTA-5685、PTA-5686、PTA-5687、PTA-5688。
具体实施例方式
由财团法人食品工业发展研究所所收集的红曲霉BCRC38072的EST基因库中搜寻得到高表达量的基因，经比对为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinasegene，简称acuF基因)以及热休克蛋白基因(heat shock proteingene，简称Hsp基因)，推测此二基因的上游应分别由一强大的启动子所调控，其可用于大量表达蛋白质。
将红曲霉BCRC 38072依照Hawksworth & Pitt(1983)的分类系统进行观察及鉴定，其型态特征如下宏观特征
CYA，25℃，7天。菌落直径25-26mm，菌丝体开始为白色，渐渐变成淡红橘色，复转为深红橘色。
MEA，25℃，7天。菌落直径48mm，亮红橘色，复转为鲜红橘色。
G25N，25℃，7天。菌落直径28-29mm，深红橘色，中央为深黄橘色。
微观特征分生粉孢子(aleuriocondia)通常为单生或成短链，为倒梨状(obpyriform)至球状(globose)，大小为10-13×8-10μm。其有性世代闭囊壳(Cleistothecia)为球状(globose)，直径37-72μm。子囊孢子(ascospore)为透明，椭圆形，大小为4.6-6.3(-6.6)×3.3-4.2μm。
根据以上观察，BCRC 38072的特征分析如下形态特征BCRC 38072介于M.pilosus与M.ruber之间。
1.依据菌落颜色与生长速度以及分生粉孢子的着生方式，BCRC 38072与M.pilosus较接近。
2.依据子囊孢子形态大小，BCRC 38072与M.ruber较接近。
序列分析BCRC 38072、M.pilosus与M.ruber的rDNAITS片段及β-微管蛋白(6-tubulin)基因部分序列100％相同。
综合形态特征与序列分析B CRC 380 72的学名暂定为Monascus pilosus K.Sato ex D Hawksw.& Pitt。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，简称acuF)是在动物淀粉新生(gluconeogenesis)中重要的淀粉，此酶在细胞中能持续且强烈的表达。
在动物淀粉新生的过程中，丙酮酸(pyruvate)经由丙酮酸羧基酶(pyruvate carboxylase)生成草酰乙酸(oxaloacetate)，再通过磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)生成磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)。其反应如下所示。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶热休克蛋白(heat shock protein，简称Hsp)是一类高度保守的蛋白质，属于一蛋白质家族(protein family)，广泛存在于原核生物与真核生物中，依其分子量分为四大类Hsp 90(83-90KDa)，Hsp 70(66-78 KDa)，Hsp 60，以及小Hsp家族。在生物体受到环境刺激时，此类蛋白质会大量表达。
将acuF与Hsp的启动子以BLAST方式比对目前公开数据库，发现并无与本发明红曲霉的acuF与Hsp启动子序列相似的序列。于是将acuF与Hsp启动子序列重组到一pHygEGFP载体上，其具有HPH(潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin Bphosphotransferase))与增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，简称EGFP)的融合蛋白。通过观察荧光蛋白的表达，证实上述两个启动子的确具有开启下游基因的活性。
以下将以实施例说明本发明。
实施例1acuF启动子1.材料(1)宿主红曲霉Monascus BCRC 38072、Monascus pilosus，BCRC 31527、Neurospora crassa BCRC 32685(财团法人食品工业发展研究所)。
(2)感受态细胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)质粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培养基a.大肠杆菌的培养基LB肉汁(USB)，琼脂(USB)。
b.红曲霉及粉红面包霉(Neurospora crassa)的培养基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培养基(参见*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培养基1.微量元素溶液将5g柠檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1gFe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的灭菌去离子水。最终总量100ml。
2.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
3.50X Vogel氏盐浓缩液150g柠檬酸钠·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先缓缓溶于20ml的水中)于750ml的灭菌去离子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最终总量1升。过滤、灭菌后，将溶液保存于室温。
4.修饰过的Vogel氏培养基将1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏盐液。
2.流程acuF启动子的制备流程是如图1所示。由财团法人食品工业发展研究所所收集的红曲霉Monascus B CRC 38072的EST基因库寻找到cDNA表达量最高的基因Contig IDMPTC00008457，经比对为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，简称acuF)，推测该基因由一强大启动子所调控。于是利用acuF基因5’端基因序列设计一段465bp的探针，以PCR方式由红曲霉染色体放大该段探针。之后，将PCR产物接到pGEM-T Easy Vector上，再以DIG(Digoxigenin)标示制成探针。利用此探针对红曲BCRC 38072的原生质体数据库(fosmid library)进行菌落杂交，找到含有acuF基因的原生质体，编号为mpf01014A4。利用引物步行方式对编号为mpf01014A4的原生质体进行定序，找出acuF基因前端的启动子序列。成功定序出1116bp的预定启动子序列，并将之以BLAST进行比对，并无比对相似序列。将此1116bp的acuF启动子序列以限制酶BglII与KpnI切位接到载体pHygEGFP上，并命名为pMS-acuF(又标记为pMS-a1)，如图2所示(右方的图谱)。将pMA-acuF转化至红曲霉中，成功观察到荧光蛋白的表达，如图3A与3B所示。图3A为明视野下，图3B为荧光滤镜下。此结果证明所推测的acuF启动子序列具有启动子活性。详细步骤说明如下。
A.acuF的探针基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的acuF探针序列。
由红曲霉EST基因库设计引子如下正向引物5`-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3`(序列识别号3)反向引物5`-AGTATGCGGTCAGAGCACC-3`(序列识别号4)反应条件如下100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×缓冲液10μl。
第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，53℃30秒，72℃30秒，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。
反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃冰箱。
B.重组质粒TA-acuF将PCR产物acuF探针片段纯化回收，将回收的DNA与pGEM-T Easy Vector以浓度3∶1的比例混匀，加入1μl的T4DNA接合与10×接合缓冲液，以灭菌去离子水调制总体积10μl，于室温进行接合1小时。待接合完成后，取出5μl接合反应产物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，进行转化作用，所得转化株已于93年12月7日寄存于财团法人食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 940474。筛选出3483bp的质粒，并以PCR确认，得到重组质粒TA-acuF。
C.acuF启动子片段的取得利用PCR克隆出原生质体mpf01014A4的acuF启动子序列。
所采用的引子与反应条件如下正向引物5`-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3`(序列识别号6)反向引物5`-ATGGTAC CTGTTTCTGAGTGAGGTC GAGTG-3`(序列识别号7)100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×缓冲液10μl。
第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，59℃30秒，72℃1分钟，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。
反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃冰箱。
D.重组质粒pMS-acuF的制备以限制酶BglII与KpnI分别和PCR产物acuF启动子片段与克隆载体pHygEGFP进行剪切作用4小时，再以DNA电泳鉴定分离，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。将回收的载体与acuF启动子片段以1∶3比列混匀，并以灭菌去离子水调制总体积10μl。于16℃进行接合反应4小时。待接合反应完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受态细胞DH5α，进行转化作用。经大肠杆菌质粒筛选出6.1kb的质粒，并以PCR确认，即得到重组质粒pMS-acuF。
E.Monascus原生质体(protoplast)的制备将Monascus孢子液接在PDA斜面培养基上，30℃静置培养5-7天。用无菌水刮下孢子，以两层灭菌的miracloth滤膜过滤孢子液，除去菌丝及琼脂块。于光学显微镜下，以血球计数盘计算滤液中的孢子数。接种孢子107个/ml至50ml的修饰过的Vogel氏培养基中，于30℃，200rpm震荡培养16-18小时。以两层灭菌的miracloth滤膜过滤萌芽的红曲孢子，以无菌水清洗后，接着以酶消化缓冲液润湿菌丝。
以10ml酶消化缓冲液洗下miracloth滤膜上的菌丝，加入5ml酶混合液，置于震荡器上，于室温快速摇晃反应半小时，每隔十分钟，于光学显微镜下观察细胞壁分解情形，直到约90％菌丝均释出原生质体。用两层miracloth滤膜过滤，滤液于4℃，1500rpm离心15分钟，收集原生质体。倒去上清液，以酶消化缓冲液清洗沉淀物两次，再以STC清洗两次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于显微镜下计算原生质体数目，分装107个/管，并置于-80℃保存。
F.转化作用采用STC清洗原生质体两次，于4℃、1500rpm离心15分钟。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生质体沉淀。加入1-10μg的质粒DNA，于200Ohms，25μF，0.7KV的条件下进行电转。加入1ml的再生缓冲液(regeneration buffer)，于30℃下静置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培养基，铺于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培养基上，于30℃静置培养，约3-5天可观察到转化株。
G.转化株的筛选与确认(1)用尖头镊子挑取少许转化株上的菌丝与孢子置于载玻片上，滴一滴无菌水后盖上盖玻片，于光学显微镜下观察。在观察绿色荧光蛋白所使用的滤镜下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可观察到绿色荧光蛋白的表达。
(2)将转化株接到PDB(potato dextrose broth)培养基中，于30℃，200rpm震荡培养5-10天。之后将菌体磨碎，抽取染色体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进行PCR，可得到1740bp的产物。
H.确认具有启动子活性的最小片段为更进一步确认acuF启动子片段(1116bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分别得到包含活性序列片段的1000bp，750bp，600bp，及500bp的PCR产物。所采用的模板为pMS-a1。获得上述PCR产物所使用的引子列示如下。
1000bp正向引物acuF-B2 gaagatctTGTCGATGCAATCGGGCAATCC(序列识别号13)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列识别号14)750bp正向引物acuF-B3 gaagatctTGATGATTGGGATCGGACTCGG(序列识别号15)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列识别号14)600bp正向引物acuF-B4 gaagatctTGCGGATCCGAGGATAAAAC(序列识别号16)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列识别号14)500bp正向引物acuF-B5 gaagatctCCCGGTATTGTCCGAGGCTC(序列识别号17)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列识别号14)将1000bp，750bp，600bp，及500bp的acuF启动子序列接到pMS载体，并命名为pMS-a2，pMS-a3，pMS-a4，及pMS-a5。将载体转化至Monascus BCRC 38072，并以含有Hygr30ug/ml的PDA培养基做筛选。结果如下所示。
1R抗性；N.R.无抗性。
2+阳性；-阴性。
N.D.未侦测。
具有功能活性的最小片段为600bp。且含有600bp片段的转化株亦可侦测到荧光反应。
将这些质粒亦转化到Monascus pilosus BCRC 31527，以含有Hygr 50ug/ml的PDA培养基进行筛选。结果如下表。
1R抗性；N.R.无抗性。
2+阳性；-阴性。
N.D.未侦测。
具有功能活性的最小片段亦为600bp。且含有600bp片段的转化株亦可侦测到荧光反应。
将这些质粒亦转化到Neurospora crassa BCRC 32685，并以含Hygr 50ug/ml的PDA培养基筛选之。结果如下表。
1R抗性；N.R.无抗性。
N.D.未侦测。
具有功能活性的最小片段亦为600bp。
由上述结果证明，acuF启动子序列中具有功能活性的最小片段为600bp(序列识别号18)，且其可表达于Monascus BCRC38072，Monascus pilosus BCRC 31527，以及Neurosporacrassa BCRC 32685。
实施例2Hsp启动子1.材料(1)宿主红曲霉Monascus BCRC 38072，Monascus pilosusBCRC 31527，以及Neurospora crassa BCRC 32685(财团法人食品工业发展研究所)。
(2)感受态细胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)质粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培养基a.大肠杆菌的培养基LB肉汁(USB)，琼脂(USB)。
b.红曲霉及粉红面包霉(Neurospora crassa)的培养基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培养基(参见*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培养基①.微量元素溶液将5g柠檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的灭菌去离子水。最终总量100ml。
②.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
③.50X Vogel氏盐浓缩液150g柠檬酸钠·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先缓缓溶于20ml的水中)于750ml的灭菌去离子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最终总量1升。过滤、灭菌后，将溶液保存于室温。
④.修饰过的Vogel氏培养基将1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏盐液。
2.流程Hsp启动子的制备流程是如图4所示。由财团法人食品工业发展研究所所收集的红曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因库寻找到25℃ 培养三天时表达量最高的基因，经比对为热休克蛋白(Heat shock protein，简称Hsp)，推测该基因由一强大启动子所调控。于是利用其5’端基因序列设计一段探针，以PCR方式由红曲霉染色体放大该段探针。之后，将PCR产物接到pGEM-TEasy Vector上，命名为TA-Hsp，再以DIG(Digoxigenin)标示制成探针。利用此探针对红曲BCRC 38072的fosmid基因库进行菌落杂交，找到含有Hsp基因的原生质体。利用基因枪(shotgun)的方式对此克隆株进行定序，找出Hsp基因序列及其5’端的启动子区域。针对Hsp基因5’启动子区域设计引子，利用PCR方法，自红曲染色体放大一段1478bp长的启动子区域。将此1478bp的Hsp启动子序列以限制酶BglII与XhoI切位接到载体pHygEGFP上，并命名为pMS-Hsp，如图5所示(右方的图谱)。将pMS-Hsp转化至红曲霉中，以潮霉素进行筛选，得到的转化株在荧光显微镜下可成功观察到绿色荧光蛋白的表达，如图6A与6B所示。图6A为明视野下，图6B为荧光滤镜下。此结果证明此段启动子区域具有活性。再以QIAGEN DNasePlant kit抽取红曲霉BCRC38072荧光转化株的染色体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进行PCR反应，转化株得到1740的产物，如图7所示。第1栏代表1kb标记(Bio-1KbTM DNA Ladder)，第2-5栏为标号1-4的转化株，第6栏为BCRC 38072野生型，(-)对照组，以及第7栏为pMS-Hsp，(+)对照组。详细步骤说明如下。
A.Hsp的探针基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的Hsp探针序列。
由红曲霉EST基因库设计引子如下正向引物mptc3161-A5`-GCTTATCTCCAATGCCTCCG-3`(序列识别号8)反向引物mptc3161-B5`-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3`(序列识别号9)反应条件如下所示。
100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×缓冲液10μl。
第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，55℃30秒，72℃30秒，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。
反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃冰箱。
B.重组质粒TA-Hsp将PCR产物Hsp探针片段纯化回收，将回收的DNA与pGEM-T Easy Vector以浓度3∶1的比例混匀，加入1μl的T4DNA接合 与10×接合缓冲液，以灭菌去离子水调制总体积10μl，于室温进行接合1小时。待接合完成后，取出5μl接合反应产物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，进行转化作用。筛选出3482bp的质粒，并以PCR确认，得到重组质粒TA-Hsp。
C.Hsp启动子片段的取得由Monascus EST基因库设计出Hsp启动子的引子，利用PCR克隆出Hsp启动子序列。
所采用的引子与反应条件如下正向引物Mps17-9259-F5`-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3`(序列识别号11)反向引物Mps17-7782-R5`-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3`(序列识别号12)100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×缓冲液10μl。
第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。
反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃冰箱。
D.重组pMS-hsp的制备以限制酶BglII与XhoI分别和PCR产物Hsp启动子片段与克隆载体pHygEGFP进行剪切作用16小时，再以DNA电泳鉴定分离，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。将回收的载体与Hsp启动子片段以1∶3比列混匀，并以灭菌去离子水调制总体积10μl。于16℃进行接合反应16小时。待接合反应完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受态细胞DH5α，进行转化作用，所得转化株已于93年12月7日寄存于财团法人食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 940473。经大肠杆菌质粒筛选出6215bp的质粒，并以PCR确认，即得到重组质粒pMS-hsp。
E.Monascus原生质体(protoplast)的制备将Monascus孢子液接在PDA斜面培养基上，30℃静置培养5-7天。用无菌水刮下孢子，以两层灭菌的miracloth滤膜过滤孢子液，除去菌丝及琼脂块。于光学显微镜下，以血球计数盘计算滤液中的孢子数。接种孢子107个/ml至50ml的修饰过的Vogel氏培养基中，于30℃，200rpm震荡培养16-18小时。以两层灭菌的miracloth滤膜过滤萌芽的红曲孢子，以无菌水清洗后，接着以酶消化缓冲液润湿菌丝。
以10ml酶消化缓冲液洗下miracloth滤膜上的菌丝，加入5ml酶混合液，置于震荡器上，于室温快速摇晃反应半小时，每隔十分钟，于光学显微镜下观察细胞壁分解情形，直到约90％菌丝均释出原生质体。用两层miracloth滤膜过滤，滤液于4℃，1500rpm离心15分钟，收集原生质体。倒去上清液，以酶消化缓冲液清洗沉淀物两次，再以STC清洗两次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于显微镜下计算原生质体数目，分装107个/管，并置于-80℃保存。
F.转化作用采用STC清洗原生质体两次，于4℃、1500rpm离心15分钟。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生质体沉淀。加入1-10μg的质粒DNA，于200 Ohms，25μF，0.7KV的条件下进行电转。加入1ml的再生缓冲液(regeneration buffer)，于30℃下静置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培养基，铺于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培养基上，于30℃静置培养，约3-5天可观察到转化株。
G.转化株的筛选与确认(1)用尖头镊子挑取少许转化株上的菌丝与孢子置于载玻片上，滴一滴无菌水后盖上盖玻片，于光学显微镜下观察。在观察绿色荧光蛋白所使用的滤镜下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可观察到绿色荧光蛋白的表达。
(2)将转化株接到PDB(potato dextrose broth)培养基中，于30℃，200rpm震荡培养5-10天。之后将菌体磨碎，抽取染色体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进行PCR，可得到1740bp的产物。
H.确认具有启动子活性的最小片段为更进一步确认Hsp启动子片段(1478bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分别得到包含活性序列片段的1036bp，720bp，及497bp的PCR产物。所采用的模板为pMS-hsp。获得上述PCR产物所使用的引子列示如下。
497bp
正向引物CCGAGAGCGCGTATATGTAACG(序列识别号19)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号20)720bp正向引物TGAATTGTGTGGGTGCGTGG(序列识别号21)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号20)1036bp正向引物CAGTGCATCTTAGCGGTTGG(序列识别号22)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号20)1478bp正向引物AGTGGCAGCCAACCCTCACC(序列识别号23)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号20)将1478bp，1036bp，720bp，及497bp的Hsp启动子序列接到表达载体，并将载体转化至Monascus BCRC 38072，以含有Hygr 30ug/ml的PDA培养基做筛选。结果如下所示。
1R抗性；N.R.无抗性。
2+阳性；-阴性。
具有功能活性的最小片段为497bp。且含有497bp片段的转化株亦可侦测到荧光反应。
将这些质粒亦转化到Monascus pilosus BCRC 31527与Neurospora crassa BCRC 32685，以含有Hygr 50ug/ml或200ug/ml的PDA培养基进行筛选。结果如下表。
1R抗性；N.R.无抗性。
2+阳性；-阴性。
具有功能活性的最小片段为497bp(序列识别号24)。且证实可于Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527与Neurospora crassa BCRC 32685表达。
其它实施型态含有本发明启动子序列的表达载体的实施例可经由P CR方式增殖本发明的启动子序列，并于其下游接上具有标示功能的基因而得。具有标示功能的基因为，例如，潮霉素抗性基因或Hyg-GFP基因。所得表达载体可建构为筛选细胞转化的标志(marker)，例如，用于评估基因克隆的效率。此外，本发明的载体亦可作为红曲基因敲除(knockout)的工具，进行菌种改良，如破坏橘霉素(citrinin)的生合成基因、抑制子(repressor)基因等有害基因，产生更安全及更具产业利用性的红曲霉种。
本发明的启动子序列尚可在其下游接上具有标示功能的基因及欲侦测的目标蛋白质基因，用于活体内(in vivo)或原位(in situ)侦测蛋白质间的交互作用及目标蛋白质的作用位置。
本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质方法的应用，可通过在启动子序列下游接上要表达的酶基因，例如蛋白酶，淀粉酶(amylase)，几丁质酶(chitinase)，植酸酶(phytase)，葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)。采用本发明的表达系统，可缩短酶生产时间，亦可大为增加产量。例如，增加红曲霉蛋白酶的产量，可增进红曲霉以大豆粉作为培养基质的效率，降低生产成本，另增加红曲霉淀粉酶的产量，则可以增进红曲在酿酒时的糖化力，藉以改变制酒的制程及产生新风味。
本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质的方法的应用，亦可以在启动子的下游接上二次代谢产物基因，例如，聚缩酮类合成酶(polyketide synthase)，或非核糖体羧氨酸合成酶(nonribosomal peptide synthase)基因。此表达系统可提前二次代谢产物的生产时间，增加产量，而大量减低生产成本。
此外，本发明的表达载体亦可以在启动子下游接上转录活化子(transcriptional activator)基因，通过大量表达此活化子，同时也活化其所调控的基因，而大为增加产量。
虽然本发明已以一较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，故本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表<110>财团法人食品工业发展研究所<120>启动子与其应用<140>
<141>
<160>24<210>1<211>1116<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>启动子<222>
<223>acuF启动子<400>1ACTATTAGCG AAAGACCGGC AAGTAGATGG AAGAGCCGGA ATTATTCTTG50TTCTTCGATA GTATTCCGTC CATGCCTAGG CACAGATAGT AAGATACACA100TCGTAATAGG ACCGCCTGTC GATGCAATCG GGCAATCCAG GAACCCACGC150AGCCCAAACA CGAGGCTAGA CTCGCGTCTG CTGCACATGG AAGCTGATGG200ATACATATAC CCCCAGCAGC ATGCGGTTCC CCCTGCAGAG ACCAGAGGCT250AGAAGTCTCT GGGCGCATGT ATGTATCTAT TATTACCTAT CAATCGGTTT300CGGGTACTCC TTGCCGGAGT CGCTGAAGCG CAGACGTGCC GACCCGGAAC350ATTTAGGAAG AAACCGTGAT GATTGGGATC GGACTCGGGC ACACATGGCA400CCGAATTGCC AAAAAATGGC GCATTCTGGG GAATCAAGCA TGCAGCACAT450CTTACTAGAT TCAATAGATT AAGGCACAGG CCATGTAGAG GGCAGTGGCA500ATACAATATG GGGCCGTGCG GATCCGAGGA TAAAACTTGC CCGTTAGTCC550GGCTGGGGGT TACGGCAGTC ATAACCATCT ACAGCCACGG CCGGGCCAGG600TGGTGCACAC GGCCGTCCCG GTATTGTCCG AGGCTCAGCC GAGAAGCCCT650AACCCCTAGC CGACCAGGGC TCCGCGTCTC CCCGCAAACT CGTTTTAAAC700TTGCAGCTTC CCGTGCTCCG TCGTGCCCTA GCCCGCGCTG ATTCGCCGCT750CGGGCGAATT CGGGCGTGTT TATGCCTCGT CCTGCTCTGA CTTCATCGTC800CGGAGCCCAA TTCCTGGCCG TCAATCGCTC TCCTTCGCTG CCCTGACGCA850AACCGCGCTG TCCACAGCGC TCCCCATCTC GCAACGACCC CGACATCTCC900CGTTATACGG TGGAGACGGA CGAGAAATCT TCTGCGGATG GGAGGCATAT950TCGACACTTT ACGACTTATC GTCGCCCTCA TGGTTTCCCC CGCTGCAAAC1000ATTCCATATA CCCCCCCTTC GGCCCTGCTT CTCCTGCTCC TGCAAACTCG1050
GATTTTGTTC GACAGCAAGT CGCGAGACAG CAGAAGAACG ACTACCACTC1100GACCTCACTC AGAAAC 1116<210>2<211>1478<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>启动子<222>
<223>Hsp启动子<400>2AGTGGCAGCC AACCCTCACC AAATCGGAAC TGAACAGATT TACGTTGAAG50AACGCCGTAC TCGTACCAAT ACCTACGGTG GAAATGCCAA CTTTGGAGCT100GGCAGGGGTG GCGCTGGCCG TGGTCGTGCT GGACAAGGCC GGGGCGGCTT150CCAACGAGAT GGCGGCCGTG GAGGGTTTGC TCCCCGTGGC CGTGGCGGAA200ACGTCACGCC CAAGGGCCGC AACCAGCCTC AAACTGCATA AAGTAAGGAT250GCCAATGAGA ATTCGAATGC GTGATGCTTT CTTTGTTTCT CCGGCTGACG300ATACCTCTTT TTCTTTTTTT CTACCAATCC CGCTGGTTGG TGCAGCGCTG350ATCTTTGTTA TATTGCTTAC GGAATTTCCA GGTTATGTAT TACTTTCCCA400TTTACCCATA ATGATATGTG TTATGTGGCT CTCATTTTGT CACAGTGCAT450CTTAGCGGTT GGAAAAAAGT TTTCATTTTT CCCAGCTCAG CACTTTTATT500TTCCATGGCC TCTTTGGTTT GTGTTTTATG AGCTCGTTTC TTTTGTTACT550TTCTGCCTTT GTATTGTCCG CATCCGTGTG ATCCTAGCAT AGCGCGCAGA600AAGCCTATAT TCTTCTCCCC TATTATTCCA CATATCCTTT TCTTTCTCCT650TGATGCTGTG TTTCAGATCT CAACCTAACA ACACTTAGTG TTCTCTTCTT700TCTATTTCTT ATTTTTATTT TTATTTATTT ATATTTTTTC ACATTGGTAT750TGGCACCCTG AATTGTGTGG GTGCGTGGAA TACTGTACAA TCAATCCACT800CAGGCGCAGT GAATTGGTTT GCAGGAAGGG AACAGTATAT GGATATCTGC850AAATATGCTA GAATACACTT TTAGCTAATG TAAAACAATC AGTGAATTCT900GAAGCTTCTC AGGGTTGCTG CGCCAACAGG GCTGGCGGAG AGCAAGGGCG950GAGGGCGGAC AGGCTTGTAC GATGACTGGC CCCGAGAGCG CGTATATGTA1000ACGGTACTGT AATGTAGTCA CCCGCGGCAG CGATATTGCA GTTAAGATAC1050TGTAATGCTC TGTAACGGCA GCCGGCCGAA CAATGGAATG GGTGGAGCGG1100AACGTTCTAG ATTGTTCAAG ACCTCAGGTA GCAATTGCCT CACCCCTCCA1150GTTTCCTCGA AGGCAGACTA GAAAAATGCA GAAGGAAAGA GAGGCTTCCA1200ACGGATTCGA TGGCTATATC CTGTGATTGG AAAAACACGA ATTTCCAGTG1250
TGTCCGGATC CACGGAAAGC ACTGGAACCA AGTGAAAGTG CAGAGTTCAA1300AGCTGGTTGA GCCCCCAAAG TGGTTTAGGG CACGGCGGAG CGCGTGGAAG1350TTGCTGGACG GCCGTAGAAT CGCAGATTCC TGCTCTCTTC CCTCGCAACT1400ATTTTATCCT CGCTTCCTCC GCTTCTCTCT CTCTCTTTCT TCCGCTTCAT1450CTATTCATCT ATCTATCTGC TCTATCAG1478<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-F<400>3TGTTAATAGG ACCGCCCTGC 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-R<400>4AGTATGCGGT CAGAGCACC 19<210>5<211>465<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>acuF probe<400>5
TGTTAATAGG ACCGCCCTGC ACCCTGGTGG TGTTCNTTAC GTCTTCCTTT50CCTGCCTTGT TGCTGCTGCT TCCGTTGCAT ACTACATCTA TCGCACCAAG100GACAACAACA GGTCTTGCTG TTCTCTTTTC TTATTGCTTT TTCTCTTTTT150TCTCCGTTCT ACTCTCCATC GTTCCTTCCC CATGACTCAA CCTCGCTAAC200ATCTGCTTTC TTTTCTGCTC TTTCTAGGCC GGGCAAAGGA CACACGGAGC250TTGAGGAGGA GCTCCATGAG ACAGCGCACA TTGACTATGA CCGAGTGGCA300ATCGTAAGAT CCCAGTCATC CTCTTGATGT TTTCCTCCTT GACAAGGACA350TGGCTAACGA ACGACTCTAG ATTGCGAATC CTTCCGTTGC TGCCCTCTAC400GAAGATGCCC TTGTCTATGA AACGGGAACC GCCATCACAT CCAGCGGTGC450TCTGACCGCA TACTC 465<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>6GAAGATCTCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGC 34<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>7ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG 30<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-结合<222>
<223>mptc3161-A<400>8GCTTATCTCC AATGCCTCCG 20<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>mptc3161-B<400>9CAAGGTCTCG CTCGTTAC 18<210>10<211>269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>Hsp probe<400>10GCTTATCTCC AATGCCTCCG ATGCCCTCGA CAAGATCCGC TATGAGTCCT50TGTCGGACCC TTCCAAGCTC GATTCGTGCA AGGACCTCCG TATCGACATC100ATCCCGGATA AGGAGTCTAA GACTCTCACC ATCCGCGATA CCGGTATTGG150TATGACCAAG GCTGATCTAA TCAACAACCT TGGTACCATT GCTCGCTCTG200GAACATAACC ATACTGGTTC CGACTAGATT AGTTGTTGGA ACCATGGTAA250CGAGCGAGAC CTTG 269<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>Mps 17-9259-F<400>11AGTGGCAGCC AACCCTCACC 20<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>Mps17-7782-R<400>12CGGGCTGATA GAGCAGATAG ATAGATG 27<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-B2<400>13GAAGATCTTG TCGATGCAAT CGGGCAATCC 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-KpnI<400>14ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-B3<400>15GAAGATCTTG ATGATTGGGA TCGGACTCGG 30<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-B4<400>16GAAGATCTTG CGGATCCGAG GATAAAAC 28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>acuF-B5<400>17GAAGATCTCC CGGTATTGTC CGAGGCTC 28
<210>18<211>600<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>启动子<222>
<223>
<400>18TGCGGATCCG AGGATAAAAC TTGCCCGTTA GTCCGGCTGG GGGTTACGGC50AGTCATAACC ATCTACAGCC ACGGCCGGGC CAGGTGGTGC ACACGGCCGT100CCCGGTATTG TCCGAGGCTC AGCCGAGAAG CCCTAACCCC TAGCCGACCA150GGGCTCCGCG TCTCCCCGCA AACTCGTTTT AAACTTGCAG CTTCCCGTGC200TCCGTCGTGC CCTAGCCCGC GCTGATTCGC CGCTCGGGCG AATTCGGGCG250TGTTTATGCC TCGTCCTGCT CTGACTTCAT CGTCCGGAGC CCAATTCCTG300GCCGTCAATC GCTCTCCTTC GCTGCCCTGA CGCAAACCGC GCTGTCCACA350GCGCTCCCCA TCTCGCAACG ACCCCGACAT CTCCCGTTAT ACGGTGGAGA400CGGACGAGAA ATCTTCTGCG GATGGGAGGC ATATTCGACA CTTTACGACT450TATCGTCGCC CTCATGGTTT CCCCCGCTGC AAACATTCCA TATACCCCCC500CTTCGGCCCT GCTTCTCCTG CTCCTGCAAA CTCGGATTTT GTTCGACAGC550AAGTCGCGAG ACAGCAGAAG AACGACTACC ACTCGACCTC ACTCAGAAAC600<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>19CCGAGAGCGC GTATATGTAA CG 22<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>20CTGATAGAGC AGATAGATAG ATG 23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>21TGAATTGTGT GGGTGCGTGG 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>22CAGTGCATCT TAGCGGTTGG 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-结合<222>
<223>
<400>23AGTGGCAGCC AACCCTCACC20<210>24<211>497<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>启动子<222>
<223>
<400>24CCGAGAGCGC GTATATGTAA CGGTACTGTA ATGTAGTCAC CCGCGGCAGC50GATATTGCAG TTAAGATACT GTAATGCTCT GTAACGGCAG CCGGCCGAAC100AATGGAATGG GTGGAGCGGA ACGTTCTAGA TTGTTCAAGA CCTCAGGTAG150CAATTGCCTC ACCCCTCCAG TTTCCTCGAA GGCAGACTAG AAAAATGCAG200AAGGAAAGAG AGGCTTCCAA CGGATTCGAT GGCTATATCC TGTGATTGGA250AAAACACGAA TTTCCAGTGT GTCCGGATCC ACGGAAAGCA CTGGAACCAA300GTGAAAGTGC AGAGTTCAAA GCTGGTTGAG CCCCCAAAGT GGTTTAGGGC350ACGGCGGAGC GCGTGGAAGT TGCTGGACGG CCGTAGAATC GCAGATTCCT400GCTCTCTTCC CTCGCAACTA TTTTATCCTC GCTTCCTCCG CTTCTCTCTC450TCTCTTTCTT CCGCTTCATC TATTCATCTA TCTATCTGCT CTATCAG 49权利要求
1.一种DNA分子，其包括序列识别号1中约517至约1116个连续核苷酸序列(即序列识别号18)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列，其中该DNA序列具有启动子活性。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其包括序列识别号1中约367至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其包括序列识别号1中约117至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的DNA分子，其包括序列识别号1的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号1的序列杂交的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自细菌或真菌。
6.根据权利要求1～4任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉属Monascus sp。
7.根据权利要求1～4任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
8.根据权利要求1～4任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
9.根据权利要求8所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因)的上游序列。
10.一种重组DNA，其包括一启动子区域，包括序列识别号1中约517至约1116个连续核苷酸序列(即序列识别号18)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列；以及一编码区域，包括一编码所需蛋白质的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号1中约367至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
12.根据权利要求10所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号1中约117至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号1的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号1的序列杂交的核苷酸序列。
14.根据权利要求10～13任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自细菌或真菌。
15.根据权利要求10～13任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉属Monascus sp。
16.根据权利要求10～13任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
17.根据权利要求10～13任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
18.根据权利要求17所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因)的上游序列。
19.一种表达载体，其包括一启动子，该启动子包括序列识别号1中约517至约1116个连续核苷酸序列(即序列识别号18)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的表达载体，其启动子包括序列识别号1中约367至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
21.根据权利要求19所述的表达载体，其启动子包括序列识别号1中约117至约1116个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
22.根据权利要求19所述的表达载体，其启动子包括序列识别号1的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号1的序列杂交的核苷酸序列。
23.根据权利要求19～22任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自细菌或真菌。
24.根据权利要求19～22任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自红曲霉属Monascus sp。
25.根据权利要求19～22任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
26.根据权利要求19～22任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
27.根据权利要求26所述的表达载体，其中该启动子区域是源自红曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因)的上游序列。
28.一种DNA分子，其包括序列识别号2中约982至约1478个连续核苷酸序列(即序列识别号24)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列，其中该DNA序列具有启动子活性。
29.根据权利要求28所述的DNA分子，其包括序列识别号2中约759至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
30.根据权利要求28所述的DNA分子，其包括序列识别号2中约443至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
31.根据权利要求28所述的DNA分子，其包括序列识别号2的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号2的序列杂交的核苷酸序列。
32.根据权利要求28～31任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自细菌或真菌。
33.根据权利要求28～31任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉属Monascus sp。
34.根据权利要求28～31任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
35.根据权利要求28～31任一项所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
36.根据权利要求35所述的DNA分子，其中该DNA分子是源自红曲霉BCRC 38072中热休克蛋白基因(heat shockprotein gene，简称hsp基因)的上游序列。
37.一种重组DNA，其包括一启动子区域，包括序列识别号2中约982至约1478个连续核苷酸序列(即序列识别号24)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列；以及一编码区域，包括一编码所需蛋白质的核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号2中约759至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
39.根据权利要求37所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号2中约443至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
40.根据权利要求37所述的重组DNA，其启动子区域包括序列识别号2的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号2的序列杂交的核苷酸序列。
41.根据权利要求37～40任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自细菌或真菌。
42.根据权利要求37～40任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉属Monascus sp。
43.根据权利要求37～40任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
44.根据权利要求37～40任一项所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
45.根据权利要求44所述的重组DNA，其中该启动子区域是源自红曲霉BCRC 38072中热休克蛋白基因(heat shockprotein gene，简称hsp基因)的上游序列。
46.一种表达载体，其包括一启动子，该启动子包括序列识别号2中约982至约1478个连续核苷酸序列(即序列识别号24)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
47.根据权利要求46所述的表达载体，其启动子包括序列识别号2中约759至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
48.根据权利要求46所述的表达载体，其启动子包括序列识别号2中约443至约1478个连续核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。
49.根据权利要求46所述的表达载体，其启动子包括序列识别号2的核苷酸序列，或于严苛条件下可与序列识别号2的序列杂交的核苷酸序列。
50.根据权利要求46～49任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自细菌或真菌。
51.根据权利要求46～49任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自红曲霉属Monascus sp。
52.根据权利要求46～49任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
53.根据权利要求46～49任一项所述的表达载体，其中该启动子是源自寄存于财团法人食品工业发展研究所的红曲霉BCRC 38072。
54.根据权利要求53所述的表达载体，其中该启动子区域是源自红曲霉BCRC 38072中热休克蛋白基因(heat shockprotein gene，简称hsp基因)的上游序列。
全文摘要
本发明涉及启动子及其应用。acuF启动子包括序列识别号1中约517至约1116个连续核苷酸序列(即序列识别号18)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。Hsp启动子，包括序列识别号2中约982至约1478个连续核苷酸序列(即序列识别号24)的核苷酸序列，或于严苛条件下可与上述连续序列杂交的核苷酸序列。含有上述两个启动子的相应的DNA分子、重组DNA、表达载体。含有本发明启动子序列的应用如表达载体可建构为筛选细胞转化的标志，用于评估基因克隆的效率。作为红曲酶基因敲除的工具，进行菌种改良，产生更安全及更具产业利用性的红曲霉种。
文档编号C12N15/74GK1644689SQ200410097179
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月13日 优先权日2003年12月12日
发明者陈怡静, 郭恩惠, 刘意如, 黄英娥, 吴文蓉, 李钟财, 陈智伟, 彭筱琦, 廖丽玲, 袁国芳 申请人:食品工业发展研究所