专利名称：一种水稻epsp合酶突变体及其编码基因、获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻来源的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSP合酶)突变体及其编码基因、获得该突变体的方法与其在培育抗草甘膦植物中的应用。
背景技术：
草甘膦是一种内吸传导型非选择性除草剂，是目前应用最广泛的广谱性除草剂，能有效地控制全世界危害最严重的78种杂草中的76种。它具有对动物无毒，土壤残效期短，易于降解等优点。广泛市售的商品除草剂RoundupTM中的主要成份即为草甘膦。自从二十世纪八十年代以来，人们一直热衷于培育抗草甘膦农作物，并通过基因工程技术成功地获得了很多抗草甘膦作物，这些作物的种植不但使田间的耕作管理更为简洁有效、增产增收外更降低了很多除草剂的用量，有利于环境的保护。1996年美国种植抗草甘膦大豆，每公顷除草剂用量减少了9％-39％，在加拿大的种植也使得每公顷除草剂用量较常规减少了1.0千克。美国孟山都公司开发的RoundupReadyTM系列作物，即抗草甘膦作物，已经在一些国家大面积种植，并产生了可观的经济效益。
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase，EPSPS，EPSP合酶)是芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)合成途径中的一个关键酶，同时也是草甘膦专一抑制的靶酶。EPSP合酶催化3-磷酸莽草酸(Shikimate-3-phosphate，S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyrurate，PEP)缩合成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP)，并释放出一个无机磷分子，其中EPSP是合成芳香族氨基酸的重要前体物质。草甘膦在分子结构上类似于EPSP合酶的底物PEP，是PEP的竞争性抑制剂。它与EPSP合成酶相结合后会妨碍EPSP合成酶与正常底物PEP的结合，从而导致EPSP合成酶活力下降乃至丧失，这将严重干扰苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成，使细胞内染色体失常(Steinrucken HC，Amrhein N(1980)The herbicide glyphosate is a potentinhibitor of 5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase.BiochemBiophys Res Commun 941207-1212)。
对于植物抗草甘膦的基因工程改造，有两种较为常见的策略
首先是在植物中过量表达EPSP合酶并以此拮抗草甘膦的竞争性抑制Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，加大草甘膦的选择压力，分离获得一个耐草甘膦的矮牵牛细胞系。分析这个细胞系中的EPSP合成酶，结果表明该细胞系的核中的EPSP合酶基因的拷贝数扩增了20倍，使酶大量产生(Amrhein N，Johanning D，Schab J，Schulz A(1983)Biochemical basis for glyphosate-tolerance in a bacterium anda plant tissue culture.FEBS Lett 157191-196)。利用来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S的启动子和矮牵牛的EPSP合成酶基因cDNA构建了嵌合的EPSP合成酶基因。花椰菜花叶病毒(CaMV)35S的启动子可使一些编码序列在所有植物组织中显示高水平的组成性表达，转基因植株对草甘膦施用量的耐受程度为杀死非转基因植株用量的4倍以上(Dilip M.Shah；et al，Engineering Herbicide Tolerance inTransgenic Plants，Science，New Series，Vol.233，No.4762.(Jul.25，1986)，pp.478-481.)。
其次是在植物中引入并表达突变的EPSP合酶基因，该突变的EPSP合酶在保持催化活性的同时具有对草甘膦的低亲和性甚至不亲合性。Stalker等研究人员1985年从鼠伤寒沙门氏菌中分离到对草甘膦表现抗性的菌株，研究表明其中aroA的结构基因发生点突变，导致酶第101位的脯氨酸为丝氨酸所取代，由此所产生的EPSP合酶降低了与草甘膦除草剂的亲和性，该突变体EPSP合酶基因转化的植物产生了一定程度的草甘膦抗性(Stalker DM，Hiatt WR，Comai L(1985)A single amino acidsubstitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthaseconfers resistance to the herbicide glyphosate.J Biol Chem 2604724-4728)。Padgette等人则将大肠杆菌aroA基因编码的EPSP合酶蛋白的第96位甘氨酸残基突变为丙氨酸残基，突变后的EPSP合酶基因对草甘膦的结合活性大大降低，在植物中表达后产生了较其野生型更高的草甘膦抗性(Padgette SR，Re DB，Gasser CS，Eichholtz DA，Frazier RB，Hironaka CM，Levine EB，Shah DM，Fraley RT，KishoreGM(1991)Site-directed mutagenesis of a conserved region of the5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site.J Biol Chem 26622364-22369)。
某个基因的过量表达必然在某种程度上影响植物的正常生长，如果外源基因的中低量表达即可使转基因植物产生最佳表现型将是比较理想的，因此，筛选出具有良好草甘膦抗性的突变体基因是实现这一目标的必由之路。
另外，由于细菌及真菌来源的基因不能编码植物蛋白所特有的的转运肽(transitpeptide)序列，而EPSP合酶只有被转运到叶绿体中才能发挥其作用，所以必须为其人为添加一条转运肽序列(Della-cioppa G，Bauer SC，Klein BK，Shah DM，FraleyRT，Kishore GM(1986)Translocation of the precursor of 5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase into chloroplasts of higher plants in vitro.Proc NatlAcad Sci USA 836873-6877)；同时，细菌或真菌的密码子偏好性与植物大不相同，因此，将来源于细菌真菌的基因转化到植物中表达时通常效率很低，甚至无法表达，大多数情况下必须经过密码子的修饰才能顺利在转基因植物中得以表达，但密码子修饰非常耗时且成本较高。
易错PCR(Error-Prone PCR)，是指在进行PCR扩增目的基因的同时通过降低Taq DNA聚合酶的保真度来引入碱基错配，从而导致目的基因随机突变。根据文献(Cadwell RC，Joyce GF(1992)Randomization of genes by PCR mutagenesis.PCRMethods Appl 228-33)报道，只需20pmol(约6.4μg)突变产物即可包含所有1-4个碱基的突变体以及2％五碱基以上的突变体，从而构成可供筛选的随机突变库。
发明内容
本发明的目的是提供一种具草甘磷抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体及其编码基因。
本发明所提供的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，名称为EPSPS-MP，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由444个氨基酸残基组成，将其与野生型水稻EPSP合酶的氨基酸残基序列(序列表中的SEQ ID №1)进行比较，结果如图6所示，其氨基酸残基序列自N端至C端第106位由脯氨酸残基突变为亮氨酸残基。
上述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的编码基因EPSPS-MP，具有序列表中SEQ ID №3的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №3由1485个碱基组成，其编码序列为自5’端第74至第1408位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质；将其与野生型水稻EPSP合酶基因的核苷酸序列进行比较，结果如图6所示，该EPSP合酶基因的核苷酸序列自5’端至3’端第390位碱基由“C”突变为“T”，导致其编码的氨基酸残基序列自氨基端至羧基端第106位由脯氨酸残基突变为亮氨酸残基。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增EPSPS-MP中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种具草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突变体的获得方法。
本发明所提供的获得5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突变体的方法，是构建含有EPSP合酶基因的大肠杆菌组成型表达载体，利用易错PCR技术对大肠杆菌表达载体中的EPSP合酶基因进行随机突变，再将含有EPSP合酶突变基因的大肠杆菌表达载体导入宿主菌获得EPSP合酶基因的突变体库，最后将整合有EPSP合酶突变基因的重组子转移到含有不同浓度草甘膦的培养基上进行筛选得到抗草甘膦的重组子，测序得到5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突变体。
利用上述方法可以从多种植物中得到EPSP合酶基因突变体，例如本发明的序列表中的SEQ ID №3就是利用本发明的方法自水稻中获得的。
构建所述含有EPSP合酶基因的大肠杆菌表达载体的出发载体为可在大肠杆菌中繁殖的低拷贝数载体，如pBR322等。
所述大肠杆菌表达载体还应含有一个组成型的启动子、终止子等调控元件，以及选择抗性基因如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。
所述宿主菌为E.coli AB2829。转移重组子的方法采用平板影印法。培养基采用不含氨基酸成分的限制型培养基，如M9、MOPS培养基。
本发明的又一目的是提供一种培育抗草甘膦植物的方法。
本发明所提供的培育抗草甘膦植物的方法，是构建含有EPSP合酶突变体编码基因EPSPS-MP的植物表达载体，将构建的植物表达载体转化目的植物，经培育得到抗草甘膦植物。
所述植物表达载体中的EPSP合酶突变体的编码基因的5’端还添加有转运肽序列，该基因的上游端沿有义方向与启动子相连，下游端与控制转录终止的调控序列相连。
所述启动子可为组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或由启动子和调控元件组成的复合启动子。
所述复合启动子包含的调控元件为能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的各种来源的DNA序列；所述调控元件可为增强子或可进行组成型表达、组织特异性表达或诱导型表达的调控元件；所述增强外源基因表达的DNA序列位于启动子下游；所述增强外源基因表达的序列可为水稻Actin1内含子1、玉米Ubiquitin内含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1内含子1、玉米乙醇脱氢酶1-S基因内含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外显子或水稻EPSP合成酶基因第一内含子。
所用转化植物的方法可为基因工程领域常用的转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法、原生质体介导法、电击法或整体水平的转化方法等。
获得了用上述方法转化的转基因单株后，可以通过卡那霉素来筛选抗性植株，并结合分子生物学的方法进行检测，鉴定转基因的整合情况，并用除草剂草甘膦鉴定获得的转化植株，最终得到抗草甘膦的转基因植物。
所述植物可为水稻、玉米、小麦、大麦、高粱等单子叶植物或烟草、棉花、杨树、大豆、甘薯、马铃薯、白菜、甘蓝、青椒等双子叶植物。
应用上述方法得到的转基因植株及其子代也属于本发明的保护范围。
本发明基于定向进化原理即突变的最终形成是筛选压力与基因上的随机突变相互作用的结果。综合易错PCR、在缺陷型菌株AB2829中低水平组成型表达EPSP合酶、平板影印法等简单的分子生物学及微生物学技术创造了一个高效筛选草甘膦抗性突变体EPSP合酶的体系。同时，本发明选择植物来源的EPSP合酶基因作为筛选突变体的野生型前体，为突变体基因在转基因植物中的表达奠定了良好的基础。运用本发明的方法，获得了突变体EPSPS-MP，该突变体由一个单一的脯氨酸残基突变导致草甘膦抗性，其后转基因烟草实验证明转化有该EPSP合酶突变体的植物具有较野生型EPSP合酶更高的草甘膦抗性。该水稻EPSP合酶突变体在对草甘膦产生高抗性的同时并未像以往所报道的EPSP合酶突变体(Eschenburg S，Healy ML，Priestman MA，Lushington GH，Schonbrunn E(2002)How the mutation glycine96 to alanineconfers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphatesynthase from Escherichia coli.Planta 216129-135)那样以大幅牺牲酶的催化活性为代价，而是具有更高的活性以及实际应用的可行性，可用于构建高抗草甘膦的田间作物。
图1为重组表达载体pBREP的物理图谱图2为水稻EPSP合酶基因突变区域的分段图示图3为分别用含有5mM、20mM、50mM和100mM草甘膦的固体M9培养基筛选抗草甘膦的转化子图4A-图4D为分别用含有1mM、5mM、10mM和20mM草甘膦的液体M9培养基检测抗草甘膦的转化子图5为分别含有pBREP-MP与pBREP-MG载体的转化子在含草甘膦的液体M9培养基中生长的比较图6为pBREP-MP测序结果及与野生型的序列比较分析图7A-图7B为野生型EPSP合酶与EPSP合酶突变体EPSPS-MP活性中心立体结构的比较图8为植物表达载体pCEP的物理图谱图9为转基因烟草的PCR检测结果图10为转基因植株在含有不同浓度草甘膦的分化培养基上进行分化的结果图11为用草甘膦喷洒转基因植株的实验结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考(Sambrook等人，分子克隆实验室手册，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。
实施例1、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体EPSPS-MP的获得和检测1、水稻EPSP合酶cDNA的克隆及中间克隆载体pGEP的构建根据Genbank中水稻EPSP合酶的cDNA全序列(Genbank AF413081)设计引物，引物序列如下引物15’TTCTCGTCGCGGAAGCAGCT 3’引物25’CAACAGAACCTAGACCTCAC 3’1)提取水稻品种明恢63叶片的总RNA，然后以此为模板合成水稻的cDNA；2)以步骤1)合成的水稻cDNA为模板，在引物1和引物2引导下，PCR扩增EPSP合酶基因，PCR反应体系为步骤1)获得的水稻cDNA 2μL，EX-Taq DNA聚合酶1U(TaKaRa公司)，10×EX-Taq DNA酶缓冲液5μL，dNTPs(2.5umol/L)5μL，引物1和引物2各10pmol，最后加ddH2O水补至总体积为50μL；PCR反应条件为94℃预变性5min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳进行回收，得到电泳纯的PCR扩增产物。
3)将步骤2)回收的PCR扩增产物连接到克隆载体pGSMT-easy载体(Promega公司)上，然后将连接产物采用电激法(BIO-RAD公司电激仪)转化E.coli DH5α，用含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素选择培养基筛选重组菌，挑选长出的白色单菌落摇菌提质粒并进行酶切鉴定，将成功转化有重组载体的重组菌交与上海博亚生物技术公司测序，测序结果表明扩增的EPSP合酶cDNA序列正确并且获得了正确的含有EPSP合酶基因的中间克隆载体，将其命名为pGEP。
2、含有EPSP合酶成熟蛋白编码基因的大肠杆菌表达载体pBREP的构建大肠杆菌表达载体pBREP的构建过程如图1所示，包括以下步骤根据水稻EPSP合酶成熟蛋白的编码基因设计引物，引物序列如下引物35’ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGGCGGAGGAGATC 3’引物45’AAACTGCAGCTCACTCTTTTAAAA 3’(划线部分碱基为PstI识别位点)1)以步骤1获得的质粒载体pGEP为模板，在引物3和引物4的引导下，PCR扩增水稻EPSP合酶成熟蛋白的编码基因；2)将质粒载体pBR322用限制性内切酶SspI和PstI(均购自TaKaRa公司)酶切后，将其用T4DNA连接酶与经PstI酶切的上述PCR产物连接，得到含有EPSP合酶成熟蛋白编码基因的重组表达载体pBREP。
3、大肠杆菌表达载体pBREP的功能验证菌株E.coli AB2829(购自E.coli Genetic Stock Center)，该菌株系EPSP合酶缺陷型菌株，在其aroA基因上存在突变，不能表达有功能的EPSP合酶，因而不能正常合成芳香族氨基酸。在不含氨基酸成分的限制性培养基上(如M9、MOPS)该菌株的生长受到抑制，无法形成正常菌落；如转入该菌的质粒含有可表达的EPSP合酶基因，则可以互补E.coli AB2829中aroA-的缺陷，恢复其在限制性培养基上生长的功能。
将步骤2构建的重组表达载体pBREP转化E.coli AB2829后，将转化子接种于M9培养基上，结果转化子能在该限制性培养基上正常生长，说明该重组表达载体有效地表达了有功能的水稻EPSP合酶从而互补了E.coli AB2829中aroA-的缺陷。
4、水稻EPSP合酶突变体库的构建采用Error-Prone PCR法将重组表达载体pBREP中的水稻EPSP合酶基因分为前后两段分别进行随机突变，如图2所示，水稻EPSP合酶的cDNA全长1332bp，其中第一段位于水稻EPSP合酶基因上的BglII和ScaI酶切位点之间，长约500bp，第二段位于水稻EPSP合酶基因上的ScaI和PstI酶切位点之间，长约900bp。根据水稻EPSP合酶基因全长cDNA序列设计引物，引物序列如下用于第一段突变的引物序列引物5(上游)5’TTTAGATCTCCGGGGCGGTT引物6(下游)5’CAAGTACTGACTGCTGATGG用于第二段突变的引物序列为引物7(上游)5’TTAGTACTTGAGTGCCTTGC引物8(下游)5’AAACTGCAGCTCACTCTTTTAAAA1)以重组表达载体pBREP为模板，分别在引物5和引物6、引物7和引物8的引导下，进行PCR反应，PCR反应体系为上、下游引物各20pmol，除常规成分外还含有5.6mM Mg2+，0.2mM Mn2+，1mM dTTP和1mM dCTP；PCR反应条件为94℃ 1分钟，45℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共进行30个循环(无热启动)。
2)反应结束后，将上述PCR产物经限制性内切酶BglII和ScaI(对应第一段突变区)或ScaI和PstI(对应第二段突变区)分别消化后用低熔点琼脂糖胶回收，将载体pBREP也分别用上述两套酶消化并回收，以T4DNA连接酶与相应突变区PCR产物连接，然后将连接体系转化E.coli AB2829，涂板于M9平板得到的克隆即为水稻EPSP合酶基因的突变体库。
5、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS-MP的获得及检测1)将步骤4的转化子于37℃温箱中培养至菌落长出约1mm大小时，用平板影印法(replica plating)(Lederberg J，Lederberg EM(1952)Replica plating andindirect selection of bacterial mutants.J Bacteriol 63399-406)即以灭菌丝绒布包裹的木质印章将长出的菌落转移到分别含有0-100mM递增浓度草甘膦的固体M9培养基平板上筛选抗性菌落。对于前后两段突变区分别筛选了超过2×105个克隆，使用随机突变产物大于30ug，理论上覆盖了足够大的突变库。
2)将筛到的抗性菌落单独培养并提取质粒，然后将质粒再次转化E.coli AB2829，在37℃下、含不同浓度(0-20mM)草甘膦的MOPS液体培养基中振荡培养，观察其生长状况，并于24小时后测定600nm的紫外吸光值(OD600)。抗性较强生长较好的转化子则相应具有较高的OD600值，通过此法再次验证所得抗性转化子的草甘膦抗性来源于宿主菌内的质粒载体所表达的EPSP合酶。最终筛选得到了一个对草甘膦抗性较高的突变体转化子，将其命名为RM102，将其中所含质粒命名为pBREP-MP，将该突变体转化子RM102接种于含有5mM、20mM、50mM、100mM不同浓度草甘膦的M9固体培养基上，结果如图3所示(A，B，C，和D分别为含有5mM、20mM、50mM、100mM草甘膦的M9固体培养基，1为含有野生型EPSP合酶表达载体pBREP的AB2829转化子，为野生型对照，2为含有突变体EPSP合酶表达载体pBREP-MP的AB2829转化子RM102)，在含10mM草甘膦的M9固体培养基上RM102仍可正常生长，但野生型的生长已完全被抑制，而在含50mM草甘膦M9培养基上，RM102仍可生长，表明RM102较野生型具有较高的草甘磷抗性。
3)将RM102接种于含有1mM、5mM、10mM、20mM草甘膦的M9液体培养基中，在37℃下振荡培养，分别于0、24、48、72h测定540nm的紫外吸光值(OD540)结果如图4A-图4D所示(图4A，图4B，图4C，和图4D分别为含有1mm、5mM、10mM、20mM草甘膦的M9液体培养基)，在含5mM草甘膦的M9液体培养基中野生型已无法生长而突变体生长良好，在20mM浓度的草甘膦M9液体培养基中突变体RM102仍有一定程度的生长。
6、EPSPS-MP突变体对草甘磷抗性的比较如表达载体所表达的EPSP合酶蛋白草甘膦抗性提高，则相应的转化菌也能在含有更高浓度草甘膦的限制培养基上生长。按照已有文献中提到的能提高EPSP合酶草甘膦抗性的保守位点(Eschenburg S，Healy ML，Priestman MA，Lushington GH，Schonbrunn E(2002)How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosateinsensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase fromEscherichia coli.Planta 216129-135)将pBREP上的水稻EPSP合酶基因第101位的甘氨酸残基定点突变为丙氨酸，得到载体pBREP-MG，并表达EPSP合酶突变体EPSPS-MG，转化AB2829所得转化子在含0-50mM浓度草甘膦的M9培养基上能正常生长，而野生型对照的生长却明显受到抑制，由此也证明了上述体系可以对具有草甘膦抗性的突变体进行有效筛选。
将分别转化有pBR322(空载体对照)、pBREP(野生型EPSP合酶对照)、pBREP-MP、pBREP-MG质粒的E.coli AB2829菌株以相同的初始量分别接种于含有0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mM浓度草甘膦的液体MOPS培养基中并测定OD600值(初值)，然后在37℃下振荡培养，观察其生长状况，于12小时后再次测定OD600值(末值)以确定上述五种菌株在不同草甘膦浓度下生长的增量，结果如图5所示(％Increment为对应转化子初、末值之差与0mM下的末值之比)，EPSPS-MG突变体在含0.5-50mM浓度草甘膦的培养基中生长速度均比野生型快，表明其草甘膦抗性比野生型高，而其在0-0.2mM浓度草甘膦的培养基中，生长情况则较野生型差，表明该突变体EPSP合酶的酶活确实降低；而RM102突变体转化子在0-0.5mM草甘膦生长状况比野生型还要良好且生长速率比EPSPS-MG突变体更高；其在含有更高浓度草甘膦的培养基中生长状况也与EPSPS-MG突变体相当。以上结果说明突变体EPSP-MP较EPSP-MG而言在草甘膦抗性提高的同时仍保持较高的酶活性。
7、草甘膦抗性突变体的测序对抗性突变体RM102中的载体pBREP-MP进行测序，测序结果表明该EPSP合酶突变基因具有SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由1485个碱基组成，其编码序列为自5’端第74到第1408位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №2由444个氨基酸残基组成。将SEQ ID №3与野生型水稻EPSP合酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列(序列表中的SEQ ID №1)进行比较，结果如图6所示，该EPSP合酶突变基因自5’端至3’端第390位碱基由“C”突变为“T”，导致其编码的氨基酸残基序列自氨基端至羧基端第106位由脯氨酸残基突变为亮氨酸残基。该突变氨基酸位于EPSP合酶蛋白功能保守区内，接近活性中心，用计算机软件InisightII对其结构进行模拟，如图7A-图7B所示(图7A为野生型EPSP合酶蛋白，图7B为EPSP合酶突变体RM102)，软件计算表明该氨基酸残基变化对活性中心只产生轻微的影响。
实施例2、草甘膦抗性突变体的烟草转化实验及转基因植株的功能分析1、含草甘膦抗性突变体的转基因烟草的获得1)构建双子叶植物转化载体根据水稻EPSP合酶的cDNA序列(Genbank AF413081)合成用于扩增编码转运肽部分的DNA片段的引物，序列如下引物95’TCTAGAATGGCGGCGACCATG引物105’CAAGTACTGACTGCTGATGG以前述水稻eDNA为模板，PCR反应条件依高保真GC-rich专用LA Taq酶(TaKaRa)扩增系统说明书进行，变性温度为94℃，退火温度为60℃，延伸温度为72℃，循环后72℃保温10min。PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶回收，并插入到隆载体pGSMT-easy载体(Promega公司)上，按照Bio-Rad公司电激仪的操作程序，采用电击法转化E.coliDH5α，在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素培养基上挑选白色菌落，筛选得到重组质粒pBREPT。由上海博亚生物技术公司测序证明序列无误。质粒pBREPT经XbaI/BglII双酶切获得转运肽及EPSPs成熟蛋白编码区前段，质粒pBREP及pBREP-MP分别经BglII/PstI双酶切得到包括突变位点在内的EPSPs成熟蛋白编码区后段，后将二者前、后两段分别插入到pBluescripKS(+)的XbaI/PstI双酶切位点，通过蓝白斑筛选获得重组质粒pBREPE(野生型)及pBREPE102(突变型)。然后分别经XbaI/KpnI双酶切获得转运肽和EPSPs成熟蛋白编码区，插入到植物表达载体pC-GENERAL的XbaI/KpnI双酶切位点，经过筛选得到双子叶植物表达载体pCEP和pCEP102(构建过程如图8)。
在pCEP和pCEP102中，包含水稻转运肽编码序列在内野生型及突变型EPSP合酶编码序列被添加调控元件花椰菜花叶病毒35s启动子和nos基因终止子。
2)转化烟草采用根农杆菌介导的叶盘法(高越峰，朱祯，肖桂芳，等.1998大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用.植物学报40405-411)将pCEP和pCEP102分别转化到烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi)中，用卡那霉素筛选后得到转基因植株。
3)转基因的植株的检测根据EPSP合酶基因序列和NPTII基因的内部序列分别设计上下游引物，引物序列如下引物115’ATGAAGGCGGAGGAGATCGTG引物125’TCGGCAGGAGCAAGGTGAGA分别提取步骤1获得的转基因植株的基因组DNA，取0.1μg基因组DNA为模版，分别在引物11和引物12的引导下，用PCR法鉴定外源基因在基因组上的整合情况，电泳PCR产物结果如图9所示(泳道M为Marker，泳道CK-为转化有空载体的阴性对照植株，泳道2-17为转基因植株，泳道CK+为以质粒pCEP(10pg)为模板的PCR产物(阳性对照)，可扩增出2.5kb左右大小特异片段的即为同时含有EPSP合酶基因序列和NPTII基因转基因阳性植株，除泳道7和泳道14为假阳性植株外，其余均为阳性植株。
2、对转基因植株进行草甘膦抗性的检测随机选取转基因植株的叶片剪成小片置于含0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50mM不同浓度草甘膦的分化培养基(配方见高越峰，朱祯，肖桂芳，等.1998大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用.植物学报40405-411)上进行分化，结果如图10所示，表明转化有pCEP102的叶片分化情况明显优于转化有pCEP的叶片及转空载体的阴性对照。然后以2升/公顷剂量的农达(主要成分为草甘膦的市售除草剂)喷洒转基因植株，结果如图11所示该照片摄于农达喷洒后第十四天；1、2、3为没有喷洒草甘膦的对照植株，4、5、6为喷洒了2.0L/ha剂量农达的植株；其中，1和4来自转pC-GENERAL(空载体，只含卡那霉素抗性基因)烟草同一克隆的植株(野生型烟草对照)，2、5来自转pCEP烟草同一克隆的植株(转有野生型水稻EPSP合酶基因)，3、6来自转pCEP102烟草同一克隆的植株(转有突变型水稻EPSP合酶基因)，表明转pCEP102的植株受损情况也明显低于转pCEP的植株，对草甘膦具有较高的抗性。
序列表<160>3<210>1<211>444<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala1 5 10 15Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu20 25 30Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu AsnSer35 40 45Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser50 55 60Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly65 70 75 80Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160
Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu IleSer Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val260 265 270Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys305 310 315 320Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425 430Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn435 440<210>2<211>444<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2Lys Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Arg Glu Ile Ser Gly Ala1 5 10 15Val Gln Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu20 25 30Ser Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn Ser35 40 45Glu Asp Val His Tyr Met Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Gly Leu Ser50 55 60Val Glu Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly65 70 75 80Gly Lys Phe Pro Val Glu Lys Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe85 90 95Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Leu Leu Thr Ala Ala Val Thr100 105 110Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met115 120 125Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly130 135 140Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Glu Cys Pro Pro Val Arg Val145 150 155 160
Lys Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser165 170 175Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala180 185 190Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro195 200 205Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala210 215 220Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys225 230 235 240Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala245 250 255Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val260 265 270Gln Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu275 280 285Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Asp Thr Ser Val290 295 300Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Tyr Gly Lys Lys His Leu Lys305 310 315 320Ala Val Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu325 330 335Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val340 345 350Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr355 360 365Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys370 375 380Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Ile Thr Ala Ile Asp Thr Tyr385 390 395 400Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp
405 410 415Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro420 425 430Asn Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Arg Asn435 440<210>3<211>1485<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sative var.Lansheng)<400>3ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa60aaggaagagt atgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc atcagggaga tctccggggc120ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc ctcctcctct ccgccctctc180cgagggcaca acagtggtgg acaacttgct gaacagtgag gatgttcact acatgcttga240ggccctgaaa gccctcgggc tctctgtgga agcagataaa gttgcaaaaa gagctgtagt300cgttggctgt ggtggcaagt ttcctgttga gaaggatgcg aaagaggaag tgcaactctt360cttggggaac gctggaactg caatgcgact attgacagca gccgtgactg ctgctggtgg420aaatgcaact tatgtgcttg atggagtgcc acgaatgagg gagagaccga ttggtgactt480ggttgtcggg ttgaaacaac ttggtgcgga tgtcgactgt ttccttggca ctgaatgccc540acctgttcgt gtcaagggaa ttggaggact tcctggtggc aaggttaagc tctctggttc600catcagcagt cagtacttga gtgccttgct gatggctgct cctttggccc ttggggatgt660ggagatcgaa atcattgaca aactaatctc cattccttac gttgaaatga cattgagatt720gatggagcgt tttggtgtga aggcagagca ttctgatagt tgggacagat tctatattaa780gggagggcag aagtacaaat ctcctggaaa tgcctatgtt gaaggtgatg cctcaagcgc840gagctatttc ttggctggtg ctgcaatcac tggaggcact gtgacagttc aaggttgtgg900tacgaccagt ttgcagggtg atgtcaaatt tgctgaggta cttgagatga tgggagcaaa960ggttacatgg actgacacca gtgtaaccgt aactggtcca ccacgtgagc cttatgggaa1020gaaacacctg aaagctgttg atgtcaacat gaacaaaatg cctgatgttg ccatgaccct1080tgccgttgtt gcactcttcg ctgatggtcc aactgctatc agagatgtgg cttcctggag1140agtaaaggaa accgaaagga tggttgcaat tcggaccgag ctaacaaagc tgggagcatc1200
ggttgaagaa ggtcctgact actgcatcat caccccaccg gagaagctga acatcacggc1260aatcgacacc tacgatgatc acaggatggc catggccttc tccctcgctg cctgcgccga1320cgtgcccgtg acgatcaggg acctggttgc acccgcaaga ccttccccaa ctacttcgac1380gttctaagca ctttcgtcag gaactgaact gagcttttaa aagagtgagc tgcagcaatg1440gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctcta148权利要求
1.一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID№3的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体编码基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌和扩增权利要求2或3所述基因中任一片段的引物。
5.一种获得5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突变体的方法，特征是构建含有EPSP合酶基因的大肠杆菌组成型表达载体，并利用易错PCR技术对大肠杆菌表达载体中的EPSP合酶基因进行随机突变，再将含有EPSP合酶突变基因的大肠杆菌表达载体导入宿主菌获得EPSP合酶基因的突变体库，最后将其转移到含有不同浓度草甘膦的培养基上进行筛选得到抗草甘膦的重组子，测序得到5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因突变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述EPSP合酶基因突变体来源于水稻，为序列表中SEQ ID №3。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述宿主菌为E.coli AB2829。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述转移重组子的方法为平板影印法；所述培养基为M9或MOPS限制型培养基。
9.一种培育抗草甘膦植物的方法，是构建含有权利要求2或3所述基因的植物表达载体，再将构建的植物表达载体转化目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述目的植物为水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、烟草、棉花、杨树、大豆、甘薯、马铃薯、白菜、甘蓝或青椒。
全文摘要
本发明公开了一种5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶突变体及其编码基因、获得该酶的方法与其在培育抗草甘膦植物中的应用。该5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶，是具有SEQ ID №2氨基酸残基序列。本发明的5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶将在抗草甘膦植物的培育中发挥重要作用。
文档编号C12N15/09GK1810962SQ200510002739
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月26日 优先权日2005年1月26日
发明者朱祯, 周敏 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所