专利名称：一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术、尤其是致病菌的核酸检测技术范畴。本发明涉及一套能够检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的特异性基因及致病性毒性质粒的寡核苷酸探针，该套探针的序列及用途。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139是两种主要的肠道致病菌，能引起以腹泻为主要症状的传染病。可通过食物和饮水导致大规模暴发[Nathalie.Analytical Biochemistry.2001，289281-288]。O157:H7的致病性与多个基因有关，其中包括产志贺样毒素基因stx1、stx2，β-葡糖醛酸糖苷酶基因uidA(gusA)等[Law D.J Appl Microbiol，2000，88729-45.]。除O157:H7，O157家族成员中非H7型及其它一些致病性大肠肝菌也可能含有stx基因，因此只针对stx基因的检测结果进行鉴定并不可靠，还须结合O157:H7特异性基因的检测才能进行鉴定。O157:H7的uidA基因中+93位碱基特异性的由T突变为G[Ken J.Molecular and CellularProbes，2003，17275-2801 5]，从而对O157:H7与非H7型进行鉴别。
霍乱弧菌O139型是由O1型变异而来[Annick Robert-Pilot a.FEMS MicrobiologyEcology，2002，4039-46]。O139和O1型霍乱弧菌都含有两种主要的毒力基因ctxA和tcpA，但它们的糖基转移酶基因(LPSgt)组成却存在差异[R.M.Carter.Journal of ImmunologicalMethods，1995，187121-125]。通过识别ctxA和tcpA来区分霍乱菌株和非霍乱弧菌，然后根据LPSgt基因的不同DNA序列来区分出O1型和O139菌株。
长期以来，这两种病原菌的实验室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法，步骤繁琐且需要数天才能得到结果。免疫学方法也存在特异性和敏感性问题。近年来，PCR和核酸杂交技术的应用促进了细菌检测技术的发展，但存在一定的局限性。目前，对于多基因同时检测才能鉴定的病原体，基因芯片技术以其特有的优势已被应用于病原体的检测。
寡核苷酸基因芯片(Oligochip)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术(HaciaJ.Nature genetics(Supl)，1999，21(1)42-47)。寡核苷酸基因芯片的一个主要用途是多基因平行检测，是一种发展前景好的多基因大规模检测新生物技术。基因芯片技术检测的关键基础是设计、筛选一系列高特异性、高灵敏度、高稳定性的匹配探针，固定于玻璃片等固相载体上，利用探针与样品的杂交反应，一次实验即可确定样品中细菌种类及毒性等相关信息，极大地提高了检测效能。
发明内容
本发明提供了一套用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针，包含以下各组探针的全部或为部分探针的组合，各部分的探针长度在19-60碱基之间。
a.肠出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx1检测探针b.肠出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx2检测探针c.肠出血性大肠杆菌O157:H7的β-葡糖醛酸糖苷酶基因uidA检测探针d.霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位ctxA检测探针e.霍乱弧菌O139的毒力协调菌毛A亚单位基因tcpA检测探针f.霍乱弧菌O139的糖基转移酶LPSgt基因检测探针本发明还提供了各部分探针的核苷酸序列，详见表1-1。其中a探针选自P1～P10中的1条或数条；b探针选自P11～P20中的1条或数条；c探针选自P21～P30中的1条或数条；d探针选自P31～P40中的1条或数条；e探针选自P41～P50中的1条或数条；f探针选自P51～P60中的1条或数条。
本发明还提供了一套可以同时检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针，包含上述a～f六个部分。
本发明通过优选，进一步提供了一套特异性好，灵敏度高的探针，其中a探针为P7，b探针为P20，c探针为P29，d探针为P36，e探针为P49，f探针为P60。
此外，本发明还提供了上述寡核苷酸探针的用途，利用一套探针可通过核酸杂交反应对样品中的肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。利用探针可以进一步检测出肠出血性大肠杆菌O157:H7是否携带产志贺样毒素基因stx1、stx2；霍乱弧菌O139是否携带肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)等致病性毒性质粒。
具体的说，本发明内容是这样实现的根据出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)；霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(LPSgt)基因设计60条寡核苷酸探针，探针长度在19-60碱基之间。寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。
利用上述的一套探针，可以通过杂交反应对样品中的相应细菌及毒性质粒进行检测，尤其适用于基于基因芯片原理的检测，具有较高的灵敏度和特异性。在进行基于基因芯片原理的检测时，需要把探针全部或其中一部分用适当的方法固定于固向载体上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)，成为M×N排布的探针阵列，即为基于芯片。然后利用优化的相应的PCR引物扩增待检样品中的细菌，选择引物的要求是能够扩增出所有细菌的包含探针所在区域的片段。在扩增的同时引入荧光标记、生物素标记或其他合适的标记物。扩增产物作为探针检测的靶分子，在一定条件下与芯片共保温30分钟至数小时，利用荧光扫描仪或其他相应的检测设备即可以检测到杂交信号。根据探针出现信号的位置可以判定出细菌的种类。
除了基于基因芯片原理的检测外，这套探针也可以用于基于反相斑点杂交的检测首先将探针固定于合适的载体上，提取待检细菌核酸，并对细菌的核酸进行标记，然后，将标记好的核酸与载体上的探针进行杂交反应，最后，提供合适的仪器设备进行检测。
本发明提供的探针能够快速、准确、高效地检测出样品中的细菌的种类及其所携带的致病性毒性质粒等。如果制备成相应的试剂盒，可以广泛用于临床细菌感染性疾病的诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与检疫、细菌学分类、流行病学调查等方面。
图1为O157:H7和O139中靶基因单重和三重PCR产物电泳检测结果。1stx1，2stx2，3uidA，4O157:H7三重PCR扩增产物，5DL2000 Marker(可见条带分别为250bp和500bp)，6O139三重PCR扩增产物，7LPSgt，8ctxA，9tcpA图2为备选寡核苷酸探针微阵列示意图。探针P1-P60从左至右、从上至下依次排列为10列×6行的微阵列。第一行至第三行分别为stx1、stx2和uidA基因的备选探针，检测大肠杆菌O157:H7。第四行至第六行分别为ctxA、TcpA、LPSgt基因的备选探针，检测霍乱弧菌O139。
图3为备选寡核苷酸探针筛选杂交扫描及定量结果(PCR模板为104拷贝DNA)。探针P1-P60从左至右、从上至下依次排列为10列×6行的微阵列。第一排至第三排分别为stx1、stx2和uidA基因的探针，检测大肠杆菌O157:H7。第四排至第六排分别为ctxA、tcpA、LPSgt基因的探针，检测霍乱弧菌O139。
图4为肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139检测基因芯片探针排列位置。
图5为基因芯片分别与肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的荧光标记三重PCR产物杂交结果。
图6为肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片灵敏度检测结果。A三重PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，当PCR反应模板均为1000拷贝时，三重PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上可见微弱条带。B三重PCR产物基因芯片检测结果，当PCR反应模板均为80拷贝时，三重PCR产物与基因芯片杂交可见微弱荧光信号。
具体实施例方式为了进一步说明一套用于同时检测出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1.检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸探针的筛选和优化1.检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针的设计根据肠出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)；霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(LPSgt)基因设计60条寡核苷酸探针，寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。探针长度在19-60碱基之间。探针合成时在其3’端氨基修饰，用于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面。
表1-1检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针备选序列探针 探针序列 探针长序号度(BP)P1 CGTATGTAGA TTCGCTGAAT GTCATTCGCT CTGCAATAGG T41P2 CTGAATGTCA TTCGCTCTGC AATAGGTACT CCATTACAGA CTATTTCATC AGG 53P3 TGAATGTCAT TCGCTCTGCA ATAGGTACTC CATTA 35P4 GTCATTCGCT CTGCAATAGG TACTCCATTA CAGACTATTT CATCAGG 47P5 ATCAGGAGGT ACGTCTTTAC TGATGATTGA TAGTGGCACA GGGGATAATT TGTTTG56P6 GGAGGTACGT CTTTACTGAT GATTGATAGT GGCACAGGGG A41P7 GTACGTCTTT ACTGATGATT GATAGTGGCA CAGGG 35P8 TACTGATGAT TGATAGTGGC ACAGGGGATA ATTTGTTTGC AGTTGATG 48P9 GTTTGCAGTT GATGTCAGAG GGATAGATCC AGAGGAAGGG CG 42P10GTCAGAGGGA TAGATCCAGA GGAAGGGCGG TTTAA 35P11CGTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAA CATATATCTC AGG 53P12GTTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAA 40P13TAAATAGTAT ACGGACAGAG ATATCGACCC CTCTT 35P14ATATCTCAGG GGACCACATC GGTGTCTGTT ATTAACCACA 40P15TCTCAGGGGA CCACATCGGT GTCTGTTATT AACCA 35P16ACCACATCGG TGTCTGTTAT TAACCACACC CCACC 35
P17CCACCGGGCA GTTATTTTGC TGTGGATATA CGAGGGCTTG ATGTCTATCA 50P18GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCT 40P19GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCT ATCA 44P20AGTTATTTTG CTGTGGATAT ACGAGGGCTT GATGT 35P21AAAACTCGAC GGCCTGTGGG CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA 50P22CTCGACGGCC TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGA45P23TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGG 50P24TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGG TGGGAAAGCG60P25CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGT45P26CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AGCGC 55P27GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AG 42P28AAAACTGTGG AATTGAGCAG CGTTGGTGGG AAAGCG 36P29TGGAATTGAG CAGCGTTGG 19P30TGGAATTGAT CAGCGTTGG 19P31ATGTTTCCAC CTCAATTAGT TTGAGAAGTG CCCACTTAGT 40P32TATGTTATAG CCACTGCACC CAACATGT 28P33GCATACCGTC CTCATCCAGA TGAACAAGAA GTTTCTGGCT TAGGTGGGAT TCCAT 55P34CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG45P35ATGAACAAGA AGTTTCTGCT TTAGGTGGGA TTCCA 35P36CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG45P37AAGAAGTTTC TGCTTTAGGT GGGATTCCAT ACTCCCAAAT 40P38ATATGGATGG TATCGAGTTC ATTTTGGGGT GCTTG 35P39TGGATGGTAT CGAGTTCATT TTGGGGTGCT TGATGAACAA TTACA45P40AACAAGAAGT TTCTGCTTTA GGTGGGATTC CATACTCCCA AATAT45P41TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGG45P42TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGGTGCTT 50P43TTCGAAACGA GTGTCGCAGA TGCTGCTACT GGCGCTGGCG TAATT45P44CGAAACGAGT GTCGCAGATG CTGCTACTGG CG 32P45AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTA 35P46AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTAACTAA TATCACGCAT GTTGAGAAGC60P47CATTGCACCA GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AGAAG 55
P48GCACCAGGAA GTGCCAACTT AAACCTAACT AATATCACGC ATGTTGAGAA 50P49CAGGAAGTGC CAACTTAAAC CTAACTAATA TCACGCATGT TGAGA 45P50GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AG 42P51AATCATTTCA TTCTTTCACT TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGA 50P52TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGA TTGTGATATG 40P53GAGCGCATTA TTAACAATGT AACAGATTGT GATATGATAA GAGCGCATCT 50P54AGCGCATTAT TAACAATGTA ACAGATTGTG ATATGATAAG AGCGCATCTT TTAAA55P55ATTAACAATG TAACAGATTG TGATATGATA AGAGCGCATC 40P56CAATGTAACA GATTGTGATA TGATAAGAGC GCATC 35P57AGTAGTTCTC AAATTGAAAG TAGCCAATTT GATTCTTCTG CTATAGAAAG 50P58ATTGAAAGTA GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATG 45P59GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATG 35P60TCGATAAGAA GAGATAAAGA TCTGAGTTAT CTAAAGATAT TTG 432.扩增含有靶基因片断的PCR引物的设计和优化根据O157:H7的毒力基因stx1、stx2和含有特异性突变位点基因uidA及0139的ctxA、tcpA、糖基转移酶基因(LPSgt)基因序列设计引物，引物序列见表1-2。利用引物扩增的PCR产物序列中包含各靶基因片段上的探针序列。所有反向引物序列5’端用荧光素Cy3标记，以保证PCR产物经杂交反应后，带有荧光的反向互补链与核苷酸探针结合产生可检测信号。分别对O157:H7和O139进行三重PCR扩增条件的优化(优化的PCR反应电泳检测结果见附图1)。
表1-2用于扩增含有探针序列靶基因片段的引物序列基因引物序列(5’---3’) 产物长度备注名称(bp)Stx1GAATTTACCT TAGACTTCTC GAC 250 正向引物TCCTGTTAAC AAATCCTGTC AC反向引物Stx2TACGATAGAC TTTTCGACTC AAC 207 正向引物TCAATAATCA GACGAAGATG GTC 反向引物UidATAATGAGGAG TCCCTTATGT TAC 179 正向引物ACTGATCGTT AAAACTGCCT GG反向引物ctxAACTCAGACGG GATTTGTTAG GC304 正向引物
ATCTATCTCT GTAGCCCCTA TTAC 反向引物tcpATTGACCCAAG CACAATGTAA GAC 241正向引物CTACTGTGAA TGGAGCAGTT CC 反向引物LPSgt ACATCTGTAG GGATTGTATT GAC 340正向引物ATAACAACTG AGATATCAAG CGTC 反向引物3.寡核苷酸基因芯片的制备和探针的筛选优化探针纯化、定量后，用基因芯片点样仪点到醛基活化的载玻片上，制成O157:H7和O139备选寡核苷酸探针微阵列(基因芯片，探针排列见附图2)。用荧光标记的PCR扩增产物与基因芯片杂交，得到各探针的杂交效果如附图3所示。针对O157:H7和O139两种病原体的六个基因片段，根据芯片杂交结果选择六条特异性好，灵敏度高的探针。筛选得到的探针序列见表1-3。
表1-3检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针优化序列探针探针序列 探针长度序号 (BP)P7 GTACGTCTTT ACTGATGATT GATAGTGGCA CAGGG35P20 AGTTATTTTG CTGTGGATAT ACGAGGGCTT GATGT35P29 TGGAATTGAG CAGCGTTGG 20P36 CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG 45P49 CAGGAAGTGC CAACTTAAAC CTAACTAATA TCACGCATGT TGAGA 45P60 TCGATAAGAA GAGATAAAGA TCTGAGTTAT CTAAAGATAT TTG 43实施例2.寡核苷酸探针的特异性和灵敏度评价1.基因芯片制备将寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片上(探针排列见附图4，芯片分别与肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的荧光标记三重PCR产物杂交结果见附图5)。在该探针微阵列中，以荧光引物的反向互补序列作为阳性对照，以无关随机序列作为阴性探针对照，以不含探针的空白点样液作为阴性对照。探针序列见表2-1。
表2-1肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139检测基因芯片探针序列探针名称探针序列 探针长度(BP)stx1GTACGTCTTT ACTGATGATT GATAGTGGCA CAGGG 35stx2AGTTATTTTG CTGTGGATAT ACGAGGGCTT GATGT 35uidATGGAATTGAG CAGCGTTGG 20ctxACATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG45tcpACAGGAAGTGC CAACTTAAAC CTAACTAATA TCACGCATGT TGAGA45LPSgt TCGATAAGAA GAGATAAAGA TCTGAGTTAT CTAAAGATAT TTG 43阴性探针对照TCTTCGCCAG AGGCCTGCTA GCCTGGTTCA AGATACTACC 40阳性探针对照荧光引物反向互补序列 202.标准质粒构建以大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139标准菌株中提取的DNA作为模板，用未标记荧光的引物进行常规PCR扩增。扩增产物经纯化后分别与pGEM-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α，37℃摇菌过夜。用Promega质粒提取试剂盒提取质粒，测序鉴定与标准序列一致。计算所提取质粒的拷贝数并进行10倍系列稀释，-20℃保存，作为PCR扩增的模板。
3.肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片灵敏度检测将构建的阳性质粒10倍系列稀释，以不同拷贝数的模板进行三重PCR扩增。扩增产物与芯片进行杂交，结果与琼脂糖凝胶电泳检测方法进行比较。当PCR反应模板均为1000拷贝时，三重PCR反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测条带可见，芯片杂交信号为阳性。当模板浓度为500拷贝时，三重PCR扩增产物电泳检测为阴性，芯片杂交反应为阳性。将模板再进行2-10倍稀释，其中6倍稀释后扩增产物杂交仍有弱阳性信号，继续稀释则杂交反应阴性(检测结果见附图6)。结果表明要达到芯片检测的最低样品量，多重PCR扩增的DNA模板量应大于80拷贝。
4.肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片特异性检测在优化好的三重PCR扩增和杂交反应条件下，检测了146株不同血清型的肠道菌。其中包括大肠杆菌O157:H7 W933、882364标准株，97-O157:H7等5株地方株，3株O157非H7型；霍乱弧菌O139 M045、1837标准株和72株地方分离株，O1型霍乱弧菌569B和小川型；常见肠道菌侵袭性大肠杆菌48017、STM408、191、197、247、AT大肠肝菌、金葡菌6538、沙门氏菌、耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、假单胞菌、变性杆菌等共146株。以细菌DNA为模板进行两套三重PCR扩增，产物与芯片杂交。结果除阳性对照外，其中8株大肠杆菌O157:H7在stx1、stx2、uidA探针处都产生阳性信号，两株O157非H7型在stx1和stx2探针处产生阳性信号，另外三株O157非H7型和191、197及一株不明血清型的大肠杆菌在stx1探针处产生信号，但O157非H7型在uidA探针都无信号产生。这说明所检测的O157:H7都含有stx1、stx2毒力基因，而非H7型和一些肠道菌也含有stx1或stx2。uidA探针可用于检测O157:H7的突变位点，与非H7型进行鉴别。74株霍乱弧菌O139在ctxA、tcpA、LPSgt探针处都产生阳性信号。569B、小川型霍乱弧菌在ctxA、tcpA探针处产生阳性信号，表明所检测的O1型霍乱弧菌含有ctxA、tcpA毒力基因。而本实验LPSgt探针则只与O139型霍乱弧菌特异结合。而其它肠道菌与检测探针杂交，均无信号产生。这说明所选取的用于鉴别O157:H7和O139的探针是特异的，也说明本实验建立在两套多重PCR基础上，同时定性检测O157:H7和O139两种肠道致病菌的基因芯片是可靠的。此芯片还可用于辅助鉴别O1型霍乱弧菌。
表2-2应用基因芯片检测146株肠道菌结果菌株 数量stx1stx2uidActxAtcpALPSgtO157:H7 8 + + + - - -O157非H7 2 + + - - - -O157非H7 3 + - - - - -191、197 2 + - - - - -O139 74 - - - + + +O12 - - - + + -其它肠道菌55 - - - - - -实施例3.检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片的应用1.临床样本收集与DNA提取取临床病人发病及治疗不同时期的肛拭子。每份样本分成两份，一份用传统细菌培养方法进行常规细菌学检测，共检出89份样本为0139型霍乱弧菌(结果见表3-1)；另一份于碱性蛋白胨水中增菌2-3h，然后煮沸裂解10min，12000rpm离心2min，取上清中DNA作为多重PCR扩增模板。
2.寡核苷酸芯片检测用大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片共检测了342份临床样本，用荧光引物对临床样本进行多重不对称PCR扩增，产物混合后与芯片杂交。结果有137份在芯片ctxA、tcpA、LPSgt探针处都出现阳性信号，鉴定为O139型霍乱弧菌，其余205份除阳性对照外，未见杂交信号(结果见表3-1)。结果表明本研究建立的检测大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的基因芯片阳性检出率比常规细菌学检测方法敏感性高。
表3-1临床标本检测结果检测方法检测目标 检出阳性样本数阳性检出率(％)细菌培养生理、生化特征8926.0基因芯片ctxA，tcpA，LPSgt 137 40.0以上实施例的技术要点如下1.寡核苷酸合成寡核苷酸(引物或探针)采用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪(ABi 8909)上合成。所有荧光引物在合成中用Cy3亚磷酰化试剂在5’端进行标记。所有寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连。合成完毕用浓氨水55℃作用15小时脱保护/切割，OPC柱纯化。紫外定量，冻存备用。
2.多重PCR扩增20ul常规PCR反应体系中，正、反向引物浓度均为1μmol/L，100μmol/LdNTP，1U TaqDNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液，50-100ng模板DNA；扩增条件为预变性(94℃，5min)；35个循环变性(94℃，30sec)，退火(55℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸(72℃，5min/)。
多重不对称PCR反应中，三对引物之间浓度的改变对目的基因的扩增效率有明显的影响，每个基因的正向与反向荧光引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验优化，使一个反应管中三个产物均能达到相近而且较好的扩增效率和杂交信号。优化的结果为O157:H7多重PCR反应中stx1、stx2和uidA基因的正向引物浓度分别为0.15μmol/L、0.1μmol/L、0.1μmol/L，反向荧光标记引物浓度分别为0.75μmol/L、0.5μmol/L、0.5μmol/L；O139多重PCR反应中ctxA、tcpA、LPSgt基因的正向引物浓度分别为0.15μmol/L、0.15μmol/L、0.2μmol/L，反向荧光标记引物浓度分别为0.75μmol/L、0.75μmol/L、1.0μmol/L。20ul反应体系中，dNTP为200μmol/L，MgCl2为3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液；扩增条件为预变性(94℃，5min)；40个循环变性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸(72℃，5min/)。
3.标准质粒构建从标准O157:H7 W933和霍乱弧菌O139 M045菌株中提取DNA作为模板，用每对引物(未标记荧光)进行常规PCR扩增。扩增产物经纯化后分别与pGEM-T载体连接转化进大肠杆菌DH5α中，37℃摇菌过夜，用Promega质粒提取试剂盒提取质粒。经纯化后测序，鉴定阳性克隆，计算所提取质粒的拷贝数并进行10倍系列稀释，-20℃保存，作为PCR扩增的模板。
4.肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片制备寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片(Telechem)上，点样仪内保持温度为23℃，相对湿度大于85％。寡核苷酸芯片制备完毕后，置于载玻片盒内室温放置备用。点样后的芯片在使用前至少在室温放置24h。
5.肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139寡核苷酸芯片杂交与检测5.1寡核苷酸基因芯片预处理寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，晾干后用于杂交。
5.2杂交和杂交后处理荧光标记的PCR产物变性(98℃、5min，立即冰浴)后与杂交液(5×SSC，5×Denhardt，10μg/ml鲑精DNA，0.3％SDS)混匀，取10μl转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60分钟，杂交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室温各洗涤1min。置室温晾干。
5.3扫描和结果判定芯片用芯片扫描仪GenePix 4000B进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所<120>一套检测肠出血性大肠杆菌和霍乱弧菌的寡核苷酸探针<160>60<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>1CGTATGTAGA TTCGCTGAAT GTCATTCGCT CTGCAATAGG T 41<210>2<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>2CTGAATGTCA TTCGCTCTGC AATAGGTACT CCATTACAGA CTATTTCATC AGG 53<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>3TGAATGTCAT TCGCTCTGCA ATAGGTACTC CATTA 35<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列
<400>4GTCATTCGCT CTGCAATAGG TACTCCATTA CAGACTATTT CATCAGG 47<210>5<211>56<212>DNA<213>人工序列<400>5ATCAGGAGGT ACGTCTTTAC TGATGATTGA TAGTGGCACA GGGGATAATT TGTTTG 56<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>6GGAGGTACGT CTTTACTGAT GATTGATAGT GGCACAGGGG A 41<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>7GTACGTCTTT ACTGATGATT GATAGTGGCA CAGGG 35<210>8<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>8TACTGATGAT TGATAGTGGC ACAGGGGATA ATTTGTTTGC AGTTGATG 48
<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>9GTTTGCAGTT GATGTCAGAG GGATAGATCC AGAGGAAGGG CG 42<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>10GTCAGAGGGA TAGATCCAGA GGAAGGGCGG TTTAA 35<210>11<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>11CGTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAA CATATATCTC AGG 53<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>12GTTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAA 40<210>13<211>35
<212>DNA<213>人工序列<400>13TAAATAGTAT ACGGACAGAG ATATCGACCC CTCTT 35<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>14ATATCTCAGG GGACCACATC GGTGTCTGTT ATTAACCACA 40<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>15TCTCAGGGGA CCACATCGGT GTCTGTTATT AACCA 35<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>16ACCACATCGG TGTCTGTTAT TAACCACACC CCACC 35<210>17<211>50<212>DNA<213>人工序列
<400>17CCACCGGGCA GTTATTTTGC TGTGGATATA CGAGGGCTTG ATGTCTATCA 50<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>18GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCT 40<210>19<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>19GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCT ATCA 44<210>20<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>20AGTTATTTTG CTGTGGATAT ACGAGGGCTT GATGT 35<210>21<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>21AAAACTCGAC GGCCTGTGGG CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA 50
<210>22<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>22CTCGACGGCC TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGA 45<210>23<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>23TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGG 50<210>24<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>24TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGG TGGGAAAGCG 60<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>25CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGT 45<210>26<211>55
<212>DNA<213>人工序列<400>26CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AGCGC 55<210>27<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>27GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AG 42<210>28<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>28AAAACTGTGG AATTGAGCAG CGTTGGTGGG AAAGCG 36<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>29TGGAATTGAG CAGCGTTGG 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>30TGGAATTGAT CAGCGTTGG 19<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>31ATGTTTCCAC CTCAATTAGT TTGAGAAGTG CCCACTTAGT 40<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>32TATGTTATAG CCACTGCACC CAACATGT 28<210>33<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>33GCATACCGTC CTCATCCAGA TGAACAAGAA GTTTCTGGCT TAGGTGGGAT TCCAT 55<210>34<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>34CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG 45
<210>35<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>35ATGAACAAGA AGTTTCTGCT TTAGGTGGGA TTCCA 35<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>36CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTG 45<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>37AAGAAGTTTC TGCTTTAGGT GGGATTCCAT ACTCCCAAAT 40<210>38<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>38ATATGGATGG TATCGAGTTC ATTTTGGGGT GCTTG 35<210>39<211>45
<212>DNA<213>人工序列<400>39TGGATGGTAT CGAGTTCATT TTGGGGTGCT TGATGAACAA TTACA 45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>40AACAAGAAGT TTCTGCTTTA GGTGGGATTC CATACTCCCA AATAT 45<210>41<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>41TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGG 45<210>42<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>42TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGGTGCTT 50<210>43<211>45<212>DNA<213>人工序列
<400>43TTCGAAACGA GTGTCGCAGA TGCTGCTACT GGCGCTGGCG TAATT 45<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>44CGAAACGAGT GTCGCAGATG CTGCTACTGG CG 32<210>45<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>45AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTA 35<210>46<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>46AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTAACTAA TATCACGCAT GTTGAGAAGC 60<210>47<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>47CATTGCACCA GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AGAAG 55
<210>48<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>48GCACCAGGAA GTGCCAACTT AAACCTAACT AATATCACGC ATGTTGAGAA 50<210>49<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>49CAGGAAGTGC CAACTTAAAC CTAACTAATA TCACGCATGT TGAGA 45<210>50<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>50GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AG 42<210>51<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>51AATCATTTCA TTCTTTCACT TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGA 50<210>52<211>40
<212>DNA<213>人工序列<400>52TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGA TTGTGATATG 40<210>53<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>53GAGCGCATTA TTAACAATGT AACAGATTGT GATATGATAA GAGCGCATCT 50<210>54<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>54AGCGCATTAT TAACAATGTA ACAGATTGTG ATATGATAAG AGCGCATCTT TTAAA 55<210>55<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>55ATTAACAATG TAACAGATTG TGATATGATA AGAGCGCATC 40<210>56<211>35<212>DNA<213>人工序列
<400>56CAATGTAACA GATTGTGATA TGATAAGAGC GCATC 35<210>57<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>57AGTAGTTCTC AAATTGAAAG TAGCCAATTT GATTCTTCTG CTATAGAAAG 50<210>58<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>58ATTGAAAGTA GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATG 45<210>59<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>59GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATG 35<210>60<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>60TCGATAAGAA GAGATAAAGA TCTGAGTTAT CTAAAGATAT TTG 4权利要求
1.一套用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针，其特征在于包含以下各组探针的全部或部分探针的组合，各部分的探针长度在19-60碱基之间。a.肠出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx1检测探针b.肠出血性大肠杆菌O157:H7的产志贺样毒素基因stx2检测探针c.肠出血性大肠杆菌O157:H7的β-葡糖醛酸糖苷酶基因uidA检测探针d.霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位ctxA检测探针e.霍乱弧菌O139的毒力协调菌毛A亚单位基因tcpA检测探针f.霍乱弧菌O139的糖基转移酶LPSgt基因检测探针
2.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其中a探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P1 CGTATGTAGA TTCGCTGAAT GTCATTCGCT CTGCAATAGG TP2 CTGAATGTCA TTCGCTCTGC AATAGGTACT CCATTACAGA CTATTTCATC AGGP3 TGAATGTCAT TCGCTCTGCA ATAGGTACTC CATTAP4 GTCATTCGCT CTGCAATAGG TACTCCATTA CAGACTATTT CATCAGGP5 ATCAGGAGGT ACGTCTTTAC TGATGATTGA TAGTGGCACA GGGGATAATT TGTTTGP6 GGAGGTACGT CTTTACTGAT GATTGATAGT GGCACAGGGG AP7 GTACGTCTTT ACTGATGATT GATAGTGGCA CAGGGP8 TACTGATGAT TGATAGTGGC ACAGGGGATA ATTTGTTTGC AGTTGATGP9 GTTTGCAGTT GATGTCAGAG GGATAGATCC AGAGGAAGGG CGP10 GTCAGAGGGA TAGATCCAGA GGAAGGGCGG TTTAAb探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P11 CGTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAA CATATATCTC AGGP12 GTTAAATAGT ATACGGACAG AGATATCGAC CCCTCTTGAAP13 TAAATAGTAT ACGGACAGAG ATATCGACCC CTCTTP14 ATATCTCAGG GGACCACATC GGTGTCTGTT ATTAACCACAP15 TCTCAGGGGA CCACATCGGT GTCTGTTATT AACCAP16 ACCACATCGG TGTCTGTTAT TAACCACACC CCACCP17 CCACCGGGCA GTTATTTTGC TGTGGATATA CGAGGGCTTG ATGTCTATCAP18 GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCTP19 GGCAGTTATT TTGCTGTGGA TATACGAGGG CTTGATGTCT ATCAP20 AGTTATTTTG CTGTGGATAT ACGAGGGCTT GATGTc探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P21 AAAACTCGAC GGCCTGTGGG CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAAP22 CTCGACGGCC TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAP23 TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGGP24 TGTGGGCATT CAGTCTGGAT CGCGAAAACT GTGGAATTGA GCAGCGTTGG TGGGAAAGCGP25 CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTP26 CATTCAGTCT GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AGCGCP27 GGATCGCGAA AACTGTGGAA TTGAGCAGCG TTGGTGGGAA AGP28 AAAACTGTGG AATTGAGCAG CGTTGGTGGG AAAGCGP29 TGGAATTGAG CAGCGTTGGP30 TGGAATTGAT CAGCGTTGGd探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P31 ATGTTTCCAC CTCAATTAGT TTGAGAAGTG CCCACTTAGTP32 TATGTTATAG CCACTGCACC CAACATGTP33 GCATACCGTC CTCATCCAGA TGAACAAGAA GTTTCTGGCT TAGGTGGGAT TCCATP34 CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTGP35 ATGAACAAGA AGTTTCTGCT TTAGGTGGGA TTCCAP36 CATACAGTCC TCATCCAGAT GAACAAGAAG TTTCTGCTTT AGGTGP37 AAGAAGTTTC TGCTTTAGGT GGGATTCCAT ACTCCCAAATP38 ATATGGATGG TATCGAGTTC ATTTTGGGGT GCTTGP39 TGGATGGTAT CGAGTTCATT TTGGGGTGCT TGATGAACAA TTACAP40 AACAAGAAGT TTCTGCTTTA GGTGGGATTC CATACTCCCA AATATe探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P41 TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGGP42 TACAAGCGTA GGGGATATGT TTCCATTTAT CAACGTGAAA GAAGGTGCTTP43 TTCGAAACGA GTGTCGCAGA TGCTGCTACT GGCGCTGGCG TAATTP44 CGAAACGAGT GTCGCAGATG CTGCTACTGG CGP45 AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTAP46 AGTCCATTGC ACCAGGAAGT GCCAACTTAA ACCTAACTAA TATCACGCAT GTTGAGAAGCP47 CATTGCACCA GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AGAAGP48 GCACCAGGAA GTGCCAACTT AAACCTAACT AATATCACGC ATGTTGAGAAP49 CAGGAAGTGC CAACTTAAAC CTAACTAATA TCACGCATGT TGAGAP50 GGAAGTGCCA ACTTAAACCT AACTAATATC ACGCATGTTG AGf探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条P51 AATCATTTCA TTCTTTCACT TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGAP52 TAATGAGCGC ATTATTAACA ATGTAACAGA TTGTGATATGP53 GAGCGCATTA TTAACAATGT AACAGATTGT GATATGATAA GAGCGCATCTP54 AGCGCATTAT TAACAATGTA ACAGATTGTG ATATGATAAG AGCGCATCTT TTAAAP55 ATTAACAATG TAACAGATTG TGATATGATA AGAGCGCATCP56 CAATGTAACA GATTGTGATA TGATAAGAGC GCATCP57 AGTAGTTCTC AAATTGAAAG TAGCCAATTT GATTCTTCTG CTATAGAAAGP58 ATTGAAAGTA GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATGP59 GCCAATTTGA TTCTTCTGCT ATAGAAAGGC TTATGP60 TCGATAAGAA GAGATAAAGA TCTGAGTTAT CTAAAGATAT TTG
3.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其特征在于同时包含a～f六组探针。
4.如权利要求3所述的一套寡核苷酸探针，其中a探针选自P7，b探针选自P20，c探针选自P29，d探针选自P36，e探针选自P49，f探针选自P60。
5.权利要求1～4所述的任一寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可对样品中的肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139的相应基因进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。
6.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可以检测出肠出血性大肠杆菌O157:H7是否携带产志贺样毒素基因stx1、stx2；霍乱弧菌O139是否携带肠毒素A亚单位ctxA、毒力协调菌毛A亚单位tcpA等致病性毒素基因。
7.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于该检测可用于临床疾病诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与检疫、细菌学分类与流行病学调查等。
全文摘要
一套用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139的寡核苷酸探针及其用途，属于微生物检测领域(生物工程类检测产品)。探针设计在肠出血性大肠杆菌0157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β－葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)；霍乱弧菌0139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(LPSgt)基因等基因序列上，探针长度在19－60碱基之间，具有较高的灵敏度和特异性。适用于基于核酸杂交原理的检测技术，尤其适用于基因芯片原理的检测。在一定的使用条件下，能够检测出实验样品中的肠出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139及其致病性毒素基因。可用于疾病诊断、环境检测、食物中毒检测、食品检疫、细菌学分类、流行病学调查、生物战剂检测等。
文档编号C12Q1/68GK1661113SQ20051000251
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月21日 优先权日2005年1月21日
发明者王升启, 文思远, 徐晓静, 陈苏红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所