专利名称：编码大肠杆菌热敏毒素基因及其表达载体和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新基因，尤其涉及一种编码人源性大肠杆菌热敏毒素基因、该基因植物表达载体的构建、转化和表达以及所获得的转基因植物作为免疫佐剂的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
抗原对免疫系统有效的刺激是产生免疫应答的必要条件，对免疫系统的有效刺激需要两个条件，一是疫苗抗原能够有效的传递到淋巴组织；二是需要合适的佐剂。绝大多数非复合抗原如纯蛋白质抗原经粘膜供给时免疫原性弱，特别是经口服途径，只有大量和反复接种后才可能引起免疫应答，但应答持续时间短，有时易引起免疫耐受，必须辅以适当的佐剂才能产生满意的免疫效果。寻找合适的免疫原性的佐剂成为疫苗开发中的关键问题。比较理想的佐剂应该高效、安全，能激活免疫系统，在其存在的情况下抗原可引发抗原特异性体液免疫、细胞免疫及全身粘膜免疫应答，同时能避免诱导免疫耐受。
目前人们已开发出多种佐剂，其中有相当一部分通过动物实验证明其在引发免疫上非常有效。目前所用的大肠杆菌热敏毒素LT和霍乱毒素CT具有良好的佐剂性，具有广阔的应用前景。
大肠杆菌热敏毒素LT和霍乱毒素CT两种毒素目前被认为是最有效的佐剂，也是最主要的基因工程疫苗佐剂和粘膜免疫佐剂，可消除共抗原的免疫耐受。两者一级结构有80％同源，三维空间结构基本相似，均为多亚单位的大分子，由结构和生物学功能不同的A(11.6KD)和B(29KD)两种亚单位组成AB5型结构的六聚体蛋白。每种毒素的B亚基均由五个相同B亚单位组成，负责与细胞表面神经节苷脂结合，A亚基则具有ADP-核糖基化酶的活性。CT、LT引发粘膜免疫非常有效，CT与非关联蛋白抗原经口、鼻共用，可促进分泌IL-4、IL-5的抗原特异性CD4+Th细胞的出现，引发极强的粘膜sIgA和血清IgG应答。CT发挥佐剂效应主要通过诱导抗原特异性CD4+Th2型细胞，活化的CD4+Th2型细胞不仅相应产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，而且支持全身IgG1和IgG2b亚类、IgE和粘膜sIgA应答的出现。LT与抗原口服用，可诱导CD4+Th1细胞产生血清IgM、IgG1、IgG2a和粘膜sIgA〔Fujihashi K，KogaT，VanGinkel FW，etal.[J].Vaccine，2002，20(1920)2431-2438〕。LT作为佐剂可与多种抗原经不同途径共免疫均能明显增强机体对共服抗原的粘膜sIgA和IgG应答，与CT主要诱导Th2型免疫应答不同，LT诱导的应答要均衡些，产生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和粘膜IgA，显然是Th1和Th2型应答的混合。McNeal等分别用缺乏αβ型和γδCD4+T细胞的小鼠模型进行研究，显示αβ型CD4+T细胞可能是LT佐剂激活免疫应答最关键的细胞，LT佐剂能诱导长期记忆应答〔McNeal MM，VanCott J1，Choi AH，etal.Virol，2002，76(2)560〕。与CT引起的致死性腹泻相比，LT引起的腹泻要温和的多，而且与CT相比，LT同样具有很好的佐剂作用，基本上不诱生IgE，却能有效地启动机体局部和全身的体液和细胞免疫；而CT对Th1细胞无诱导作用，血清中也不产生IgG2a，因此，LT作为佐剂可能比CT更胜一筹〔Millar，D.G.，Hirst，T.R.，Snider，D.P.，InfectImmun，2001，69，3476〕。
LT作为粘膜免疫佐剂引起的免疫应答主要有以下特点1、使机体产生高效价特异的粘膜sIgA；2、LT诱导肠集合淋巴结(peryer′spatch，PP)抗原特异的Th细胞和B细胞应答，包括Th1(γ-INF)和Th2(IL-4、IL-5)细胞、血清IgG1、IgG2a、IgG2b及肠道粘膜sIgA应答，产生体液免疫；3、LTs还诱导MHC-II限制的细胞介导免疫，使抗原特异的T细胞、IL-2、MHC-I限制的细胞毒T细胞(CTL)显著增多，产生细胞免疫〔Ermak TH，Giannasca PJ，Nichol SR，etal.[J].JExpMed，1998，188(12)2277-2288〕。
LT免疫佐剂的应用1、防止免疫耐受。小分子抗原或半抗原免疫，特别粘膜免疫的最大缺陷是所需抗原剂量大和易对抗原产生免疫耐受。而LTs与抗原一起初次免疫动物后，将长期不会对该抗原产生免疫耐受。2、简化免疫途径。粘膜免疫的最大特点之一是免疫途径可采用口服、灌胃、鼻饲、直肠灌注、阴道滴注等，可以大大减低经血传播病原如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)等在受试者之间的传播率。口服免疫可以预防消化道传染性疾病，鼻饲免疫可使阴道粘膜抗原特异性sIgA水平显著升高，甚至优于阴道内免疫，这使通过鼻饲免疫可预防性传播疾病。3、增强免疫防御。抗病毒口服LT+感冒病毒疫苗能显著增强小鼠血清抗-病毒IgG和粘膜sIgA应答，LT使血清凝集抑制抗体和中和抗体均有增加，使病毒特异的T细胞、IL-2、MHC-I限制的细胞毒T细胞显著增多。用LTB混合微量野生型LT(0.5％)作为佐剂(LTB)、三价灭活感冒病毒作混合抗原鼻饲免疫自愿者，能明显增加呼吸道抗感冒病毒sIgA水平和增强机体抗感冒病毒感染的能力。LT及LTR192G作为粘膜免疫佐剂能使轮状病毒2/6病毒样颗粒(2/6-VLPs)疫苗刺激肠道粘膜产生高效价的病毒抗原特异性sIgA，对轮状病毒感染的免疫保护率达100％，优于CT佐剂(91％)。抗细菌目前主要为预防螺杆菌感染的实验研究。研究人员选用重组尿素酶(rUrease)作抗原，LT作佐剂，采用口服、鼻饲等途径进行免疫，结果均显示了对螺杆菌感染的粘膜免疫保护活性。Welzin研究证实，尽管采用rUre每天鼻饲小鼠可以使唾液和粪便中产生高水平的sIgA，但仅rUre+LT产生的免疫对实验性猫螺杆菌(helicobacterfelis)感染具有免疫保护作用。而Ermak则研究认为，尿素酶+LT免疫小鼠预防幽门螺杆菌(helicobacterpylori，Hp)感染主要依赖MHC-II限制的细胞介导免疫机制，可不需要对于尿素酶的抗体应答。另外，Douce等研究也表明，破伤风毒素C片段与LTK7共鼻饲免疫后的小鼠对有毒的破伤风毒素具有明显的粘膜免疫保护作用。抗真菌Cardenas用10mgLTR192G作佐剂、与灭活的白色念珠菌(heat-killedcandidaalbicans，HK-CA)鼻免疫CBA/J小鼠，同时以不加佐剂疫苗作对照。结果表明，加佐剂疫苗能引起更明显的迟发性变态反应，能根除机体104白色念珠菌活菌，并显著提高小鼠感染后的存活率；而对照组仅使菌量减少〔Cardenasfreytag L，ChengE，Mayeu P，etal.[J].Infect Immun，1999，67(2)826-833.〕。
LT根据来源不同分为人源(LT-h)和猪源(LT-p)两大类，它们具有很高的基因和氨基酸顺序同源性，理化性质和免疫性均极为相似。LT(87KD)由1个A亚单位(LtA 29KD)和5个B亚单位(LtB 11.6KD)组成。5个完全相同的B亚单位在空间上形成环状五聚体；LtA位于中央，其C-端以非共价键与LtB结合。A亚单位能被蛋白酶裂解为两个片段A1和A2，二者以二硫键相连。A1具有ADP-核糖基转移酶的作用，它由B亚单位介导能透过细胞膜，激活细胞内的腺苷环化酶，引起细胞内cAMP升高，刺激肠粘膜过度分泌水和电解质，导致腹泻，是CT的毒力活性部分；A2的主要功能是连接A1和B亚单位；B亚单位由五条多肽链以非共价键方式连结成一个五聚体环，可与靶细胞膜上神经节苷脂1(GM1)特异性结合，打开通道，介导A亚单位进入靶细胞，以发挥毒素活性。LtA和LtB分别由toxA和toxB编码，它们有4个核苷酸的的重叠。胞浆中的A、B亚单位均以携带信号肽的前体形式存在，当穿越细胞膜后才组装成完整的LT。A亚单位具有GTP依赖的ADP-核糖基化转移酶活性，通过G蛋白介导的ADP-核糖基化反应破坏胞内cAMP的降解与平衡，刺激cAMP水平增高，从而引发毒素效应。B亚单位的作用是与真核细胞表面的GM1-神经节苷脂受体特异性结合，以利于A亚单位进入靶细胞。LT具有很强的免疫原性，机体接触LT后可产生强烈的体液免疫反应和粘膜免疫反应。LT-h和LT-p作用于不同的G蛋白，前者是Gs蛋白，后者是Gi蛋白，而最终都是使蛋白激酶A失活，引起一系列生化反应，导致腹泻。
80年代后期，Clements等首次报道了LT具有免疫佐剂活性，并可消除共免疫抗原的免疫耐受。当LT与卵白蛋白(ovalbumin，OVA)同时初次口服免疫小鼠时，不但可以消除机体对OVA的免疫耐受性，还使血清抗-OVAIgG和粘膜抗-OVAsIgA含量比仅用OVA抗原初次免疫时高约30倍；但当动物在服用OVA后重复上述实验时，血清抗-OVAIgG和粘膜抗-OVAsIgA水平均明显降低，不能消除机体对OVA的免疫耐受，表明LT对共免疫抗原(co-administeredantigen)的佐剂作用需以机体对该抗原是初次接触或以接种为基础。1992年，Rollwagen等进一步研究表明，LT可以加强弯曲菌的粘膜免疫应答，并加速肠道对该菌的清除〔Rollwagen，FM，Pacheco，ND，Clements，JD，etal.[J].Vaccine，1993，11(13)1316-1320〕。De Haan等对LT的佐剂作用机制和A、B亚单位在佐剂功能中所起的作用进行了广泛的研究，他们分别用LTB、LT、LT-E112K(LTAGlu112-lys)、LTB-G33D、LT-G33D、LT-E112K/G33D作粘膜免疫佐剂、流感HA分别作共免疫抗原采用鼻饲、阴道滴注途径免疫小鼠，结果表明虽然LTA的ADP-核糖基转移酶活性在LT的免疫原性中不起主要的作用，也不是LT佐剂性所必须的，但它的存在却增强了LT的免疫原性，它的缺失降低了LTB特异性血清IgG的水平，使特异性血清IgA几乎为0；但对经鼻、阴道免疫的佐剂性却影响不大，这与其他人的研究结果一致〔DiTommaso A.，Saletti G.，Pizza M.etal.Infec Immun，1996，64，974；De HaanL，Verweij WR，Feil IK，etal.[J]Infect Immun，1996，645413〕。另外一些实验室发现了其他缺乏ADP-核糖基化活性的突变体如LT R 7K、LT R 192G、LT S 63K与多种抗原经多种途径都产生与野生型LT相同的佐剂性。另一方面，LTB的GM1结合性对于LTB、LT的免疫原性，是必不可少的，GM1结合特性的缺失也会极大的降低LT、LTB的免疫原性，抗毒素特异性血清IgG、IgA，sIgA都大幅降低；但是，GM1的结合特性对LTB、LT的佐剂性却不是必须的〔Dehaan L，Verweij W.R.，Feill K.et al.[J].Immunology，1998，94(3)424 430〕、〔Guidry J.J.，Cardenas L.，Cheng E.&J.D.Infect Immun，1997，65，4943〕。
目前，LT作为免疫佐剂的观点已获公认，但本身强烈的肠毒性限制了它在临床上的推广应用。目前一些研究正尝试将这两种分子的致腹泻活性(毒性)与佐剂活性分开，单独使用LTB做为免疫佐剂，会出现佐剂活性比较低，并基本不产生sIgA，佐剂效果还受如抗原类型、免疫途径、动物种属、免疫剂量以及偶联方法许多因素影响，所以LTB不适宜成为一种通用佐剂。另外一种受欢迎的做法是采用定点诱变的方法替换A亚基活性部位上某一氨基酸，在保持其粘膜佐剂活性的前提下降低或消除细菌毒素的毒性。目前已构建了多种缺乏ADP-核糖基化活性的LT突变体，用以观察ADP-核糖基化活性在LT粘膜免疫佐剂活性中的作用。Lycke等用无ADP-核糖基化活性的LTE112K(第112谷氨酸→赖氨酸)与KLH共口服免疫小鼠几乎不能(远不及LT)增强刺激机体或肠粘膜产生针对KLH的免疫应答，因而认为，LT的佐剂效应机制与ADP-核糖基化活性和激发cAMP产生的能力直接相关。而Verwei等用LTE112K作佐剂，与HA抗原共鼻免疫小鼠，却比仅用HA显著增加了血液中IgG水平和鼻腔粘膜sIgA应答，与用野生型LT作佐剂无明显差异。同样，其他研究者们还分别证实了LTK7(A亚单位第7位的精氨酸→赖氨酸)、LTR192G(第192位的精氨酸→甘氨酸)、LTK63(第63位的丝氨酸→赖氨酸)、LTR72(A亚单位丙氨酸-精氨酸)等无或减弱ADP-核糖基化活性的LT突变体及rLTB具有显著的粘膜免疫佐剂活性；不过，这些结论均基于鼻免疫。Giuliani认为，经突变得到得低毒AB复合物，具有和野生型同样的广谱免疫佐剂性，佐剂活性不受免疫途径、免疫动物、共免疫抗原等因素限制，但毒性却比野生型低得多，在安全范围内。LTR72就是A亚单位72位丙氨酸突变为精氨酸，体外Y1细胞上检测毒性比野生型低1000倍，但免疫活性却等同于野生型〔Neidleman JA，VajdyMM，Ugozzoli G，etal.[J].Immunology，2000，101154-160〕、〔Gill Douce.[J].InfectImmun，1999，(9)4400-4406〕。本发明基因编码的蛋白即为LTA72(A-R)和LTB组成，安全无毒，佐剂活性等同于同样剂量的野生型LT。
目前，LT、LTB作为毒素免疫原或佐剂融合蛋白已在多种系统中表达。1983年Clements等从大肠杆菌中首先产生LTB〔Clements，J.D.，Flint，D.C.，Engert，R.F.，Klipstein，F.A.Infect Immun.1983，40，653〕；Ichikawa等在短芽孢杆菌中表达重组LTB〔Ichikawa，Y.，Yamagata，H.，Tochikubo，K.and Udaka，S.FEMS Microbial.Left，1993，111，219-224〕；Schonberger等在酵母中表达LTB〔Schonberger，O.，Hirst，T.R.and Pines，0.Mol.Microbial.1991，5，2663-2671〕；Lauterslager、Chikwamba、Lamphear在烟草、马铃薯、玉米中表达了LTB〔Lauterslager，T.G.，Florack，D.E.，Van der wal，T.J.，etal.Vaccine，2001，19，2749〕、〔Chikwamba R，Cunnick J，Hathaway D，McMurrayJ，Mason H，Wang K.Transgenic Res，2002，11(5)479-493〕、〔Lamphera BJ etal.Delivery of subunit vaccines in maize seed.J Control Release.2002，85(1-3)169-180〕。Hugn等在马铃薯中表达人工合成的LTB，表达量为每克块茎中含4-10微克LTB，每毫升可溶性蛋白提取液中含0.7-1.5微克LTB，以含20或50ug LTB的5g无叶马铃薯块茎饲喂小鼠，产生的血清IgG和sIgA水平与强饲5ug大肠杆菌源的重组LTB相当，以25ug的LT攻毒后，可产生一定的免疫保护〔Hugh S.Mason 11，Tariq A.Haq John D.Clementss and Charles J.gene.1998.Vccine 16(13)1336-1343〕。Birgit等用TMV做载体在烟草中表达LTB五聚体，每1克新鲜植物材料中含量为75微克，有GM1结合性，以15ug/鼠经鼻免疫，可产生LTB特异性IgG1，与三叶橡胶乳胶过敏原Hevb3鼻腔共免疫小鼠，产生Hevb3特异性IgG1、IgG2，具有佐剂效果〔Birgit Wagner，KarinHufnagl，Christian Radauer，etal.Journal of Immunological Methods 2004 287203-215〕。Kang等在烟草叶绿体中表达了LTK63，表达量为可溶性蛋白的3.7％〔Tae-Jin Kang，So-Chon Han，Mi-Young Kim，etal.Protein Expression andPuriWcation 2004，38123-128〕。Rogano等将LTB与结核抗原融合后在拟南芥中成功得以表达〔Riggno MM.etal.Plant cell Rep，2004，22(7)502-508〕。
综合以上所述文献可以看出将大肠杆菌热敏毒素基因在植物中表达均不同程度的存在着表达量较低、佐剂效果较差、表达产物有毒性等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的编码大肠杆菌热敏毒素基因，该基因能够在植物中高表达，所表达的重组大肠杆菌热敏毒素或转基因植物可用做免疫佐剂，该免疫佐剂具有效果好、安全、无毒等优点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种编码大肠杆菌热敏毒素基因，由NLTA和NLTB两个亚单位组成，其中NLTA具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NLTB具有序列表SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明根据对植物基因表达使用的密码子的统计分析，选出同一编码氨基酸时植物偏爱使用的密码子，然后在保持大肠杆菌热敏毒素(Heat-libileEnterotoxin of Escherichia colli)的A亚单位和B亚单位的氨基酸序列不变的情况下，采用植物偏爱的密码子进行反翻译，同时屏蔽基因序列中的提前加尾信号及促mRNA降解的序列，提高基因G+C的百分含量，兼顾不形成复杂的二级结构，设计人工合成适合于在植物中高表达的新的大肠杆菌热敏毒素A亚单位、B亚单位的基因NLTA和NLTB。与天然LTA、LTB基因序列相比，新的NLTA和NLTB基因打破了原核基因结构与植物基因结构不同的物种界限，采用植物密码子优化的思路设计，使之更适合在植物中表达。
NLTA有如下特点1、777个碱基对中改换了206个，改换率为26.5％。
2、在259个氨基酸密码子中，被改变碱基的密码子有179个，改变率为69％。
3、在259个氨基酸密码子中，包含154个植物优化密码子，占密码子总数的59％，比天然LTA提高82个，提高了31％。
4、777个碱基对中G+C数目由297个改换到381个，G+C含量由38.2％提高到49％。
5、在天然基因中的1个PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改换，改换率为100％。
6、为使基因操作方便，在除去了基因序列中间的一些主要的显著性内切酶识别位点，增强了合成基因的适用性。
NLTB有如下特点1、375个碱基对中改换了107个，改换率为28.5％。
2、在125个氨基酸密码子中，被改变碱基的密码子有97个，改变率为78％。
3、在125个氨基酸密码子中，包含91个植物优化密码子，占密码子总数的73％，比天然LTB提高45个，提高了36％。
4、375个碱基对中G+C数目由137个改换到186个，G+C含量由36.5％提高到49.6％。
5、在天然基因中的3个PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改换，改换率为100％。
6、在天然LTB基因中存在的2个干扰基因表达和使mRNA不稳定的序列(ATTTA)，全部被改换，改换率为100％。
7、为使基因操作方便，在除去了基因序列中间的一些主要的显著性内切酶识别位点，增强了合成基因的适用性。
本发明所要解决的另一技术问题是构建一种能够在植物中高效表达NLTA和NLTB核苷酸序列的表达载体。
一种高效表达NLTA和NLTB核苷酸序列的植物表达载体，其构建方法的步骤为将所述的NLTA和NLTB核苷酸序列插入植物表达载体的转录起始密码子之后，即得。
一种优选的构建方法，步骤如下1)将NLTA和NLTB序列分别插入到植物超表达元件pTΩ4A中，构建中间载体pTΩ4ANLTA和pTΩ4ANLTB；
2)酶切回收Ω4A+NLTA和Ω4A+NLTB片段，将上述片段同时插入到植物表达载体pCAMBIA2301中，从而构建高效植物表达载体pC234ANLTAB。
植物超表达元件pTΩ4A是在Puc19的多克隆位点HindIII和EcoRI之间含有两个35S增强子、1个CaMV35S启动子、1个Ω序列、1个Kozak序列、4个(poly)A和Nos终止子，Ω序列、Kozak序列、4个(poly)A的作用是增强翻译。
本发明所要解决的另外一个技术问题是利用上述含有人工合成编码大肠杆菌热敏毒素的高效表达载体转化植物，制备免疫佐剂。
一种免疫佐剂，主要由下述方法制备而成1)用构建的包含NLTA和NLTB序列的植物表达载体转化受体植物；2)获得转基因植物。
其中所述构建的植物表达载体为pC234ANLTAB；转化方法选用农杆菌浸染法、基因枪法、花粉管通道法、胚囊、子房注射法、浸泡转化法、显微注射法、电激法、超声波法、脂质体介导法、PEG介导法等方法。本发明优选农杆菌浸染法、基因枪法、花粉管通道法、脂质体介导法或浸泡转化法转化植物，更优选使用农杆菌浸染法，并从中筛选出能够稳定、高效表达抗原蛋白的转基因工程植株；所述受体植物为红三叶草、白三叶草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、烟草、马铃薯、百脉根或番茄，优选为百脉根。
将上述获得的转基因植物直接与目的抗原混合后直接饲喂动物，或将所表达的重组大肠杆菌热敏毒素分离、纯化后，将其通过混合、融合、化学偶连、双价载体等方式与目的抗原相连，经直接饲喂、饮水、点眼、滴鼻、腹腔注射、肌注、十二指肠、皮下注射等途径免疫动物，结果表明，上述方式均能达到增强目的抗原免疫应答的效果。
本发明整体技术方案概述本发明根据人源性大肠杆菌热敏毒素A亚单位(LTA)、B亚单位(LTB)的氨基酸序列，人工优化合成适合在植物中高表达的编码大肠杆菌热敏毒素A、B亚单位的新的DNA序列NLTA和NLTB；构建用于植物的超表达元件；将已插入该序列的超表达元件连到植物表达载体的相应酶切位点构建植物表达载体；用该载体转化植物，获得高水平表达大肠杆菌热敏毒素的转基因植株；用抗生素筛选、PCR、Southern blot、Northern blot鉴定转基因阳性植株；测定转基因植株中大肠杆菌热敏毒素含量，用ELISA鉴定表达蛋白的性质；繁殖和培养转基因植株；用不同剂量表达大肠杆菌热敏毒素的植株、其蛋白提取液或其他纯化物，以不同的方式加牛血清白蛋白(BSA)，以不同的途径免疫动物，证明其有加强免疫的佐剂性。
本发明具有以下优点1)本发明编码大肠杆菌热敏毒素基因能够在植物中高表达重组大肠杆菌热敏毒素；并且采用植物作为表达系统，克服了微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确翻译后加工和蛋白的糖基化等缺陷，能够对表达产物进行糖基化、酰氨化、磷酸化、亚单位的正确装配等转译后加工，使表达产物三维空间结构更趋于自然状态，所表达的大肠杆菌热敏毒素具有更好的生物活性，能够有效加强抗原免疫应答反应。
2)所表达的重组大肠杆菌热敏毒素安全、无毒性。
图1为pCAMBIA2301的质粒图谱。
图2为植物表达载体pC234ANLTAB的构建流程示意图。
图3为对照野生型基因植物载体pC234ACKLTAB的构建流程示意图。
图4为转本发明基因百脉根Southern blot杂交结果。
图4A用LTA做探针检测结果；其中，1为阳性对照；2～5为转本发明基因植株；6为阴性对照。
图4B用LTB做探针检测结果；其中，1为阴性对照；2为阳性对照；3～5为转本发明基因植株。
图5为转本发明基因百脉根Northern blot杂交结果。
图5A用LTA做探针检测结果；图5B用LTB做探针检测结果。
图6为转本发明基因百脉根Western blot杂交结果。
1、阳性对照；2、阴性对照；3、转野生型基因植株；4、转本发明基因植株。
图7为本发明基因表达产物的GM1-ELISA检测结果。
图8为ELISA检测抗BSA血清IgG结果。
横坐标为血清稀释度，纵坐标为450nm的OD值。
以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
具体实施例方式
试验材料1、菌株与载体大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自华美生物公司。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)根癌农杆菌EHA105购自华美生物公司。
PUC18(Ampr)购自promega公司。
pTΩ4A(Ampr)购自Invitrogene公司。
pCAMBIA2301(Kanr)购自CAMBIA公司。
2、酶和试剂及人工寡聚核苷酸引物限制性内切酶、Taq酶、T4DNA连接酶等常用酶类购自NewLand和Takara等公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit和DIG DNA Labeling and Detection Kit购自Roche公司；pfu DNA Polymerase购自天为时代公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司；寡聚核苷酸引物由Sangon公司合成；测序由上海基康公司、申能博彩公司和Bioasia公司完成。
3、生化试剂IPTG、X-Gal、Agar为Sigma公司产品；TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品；琼脂、SDS、NaOH、NH4NO3KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、肌酸、烟酸、VB6、VB1、甘氨酸、胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、NaCl均购自北京市生化试剂公司。
4、培养基
LB细菌培养基每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用NaOH调pH至7.0，灭菌待用。加1.5％琼脂配成固体培养基。
蓝白斑筛选培养基每升LB固体培养基中加20mg/mL的X-Gal 40ul和200mg/mL的IPTG 40ul。
YEB培养基每升含胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO40.5g。用NaOH调至pH至7.5，灭菌后待用。加1.5％琼脂配成固体培养基。
MS培养基购自sigma公司。
MS共培养培养基MS基本培养基中加入6-BA(2mg/l)及IAA(0.5mg/l)。
MS选择培养基MS共培养培养基中加入羧苄青霉素(500mg/l)及卡那霉素(100mg/l)。
MS生根培养基MS基本培养基中加入羧苄青霉素(500mg/l)或头孢拉定(500mg/l)+卡那霉素(50mg/l)+IBA(0.1mg/ml)。
5、植物豆科牧草百脉根“里奥”6、仪器常温离心机、冷冻离心机来自sigma公司；凝胶成像仪、电泳仪购自Bio-Rad公司。
本发明大肠杆菌热敏毒素基因NLTA和NLTB的制备根据Internet上公布的coden usage数据库，统计出植物偏爱使用密码子，然后再利用生物软件DNASTAR，在保持大肠杆菌热敏毒素A、B亚单位的氨基酸序列不变的情况下，采用植物偏爱的密码子进行反翻译、同时屏蔽基因序列中的植物多聚腺核苷酸信号序列(PPSS)(AATAAA、AATAAT)及促mRNA降解的序列(ATTTA)，提高基因的G+C％，避免15～30个碱基对中A+T％＞80％，避免在10个碱基对中出现4个或4个以上连续A或T，避免连续A+T或G+C多于5个，避免一些酶切位点，同时兼顾不形成复杂的二级结构，设计适合于在植物中高表达的新的编码大肠杆菌热敏毒素A、B亚单位的NLTA序列(SEQ ID NO.1)、NLTB序列(SEQ ID NO.2)。
NLTA、NLTB序列再由大连宝生物公司合成后连在载体PUC18的PstI和XhoI之间构成PUC18NLTA、PUC18NLTB。
构建高效植物表达载体pC234ANLTAB及对照野生型表达载体pC234ACKLTAB2.1大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备1)取在LB固体培养基上生长的受体菌DH5α单菌落，接种于5ml B液体培养基中，37℃摇床培养过夜(200r/min)；2)1％接种量转接到100ml LB液体培养基中，于37℃，300r/min摇约3hr，可通过测量OD600值(0.4～0.6)来检测培养物生长状况；3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；4)4℃，4000rpm，离心10min，回收菌体细胞，除尽培养液；5)用10ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份细胞沉淀，放置于冰上30min；6)4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞，除尽培养液，5、6步骤可重复一次；7)50ml初始培养物，用1ml冰预冷的0.2M CaCl2和1ml 30％甘油，重悬每份细胞沉淀；8)每管200ul分装，置于液氮中，-70℃保存备用。
2.2大肠杆菌的转化在200ul的DH5a感受态菌中分别加入2ul质粒，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热激90秒，快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5min；每管加800ul LB培养基，于37℃摇床(200r/min)温育45min，使细菌复苏；在超净台中将约600ul菌液转移到含有相应抗生素的LB平板上，均匀涂板，待液体吸收后，倒置平皿，37℃培养12-16hr。
2.3碱裂解法小量提取PUC18NLTA、PUC18NLTB、PUC18CKLTA、PUC18CKLTB质粒DNA[参见《分子克隆》]。
2.4酶切和回收在50ul酶切体系中加入5ul质粒PUC18NLTA、PUC18NLTB、5ul10×buffer、PstI和XhoI(购自大连宝生物公司)各2ul，其余用双蒸水补齐，混匀后37℃放置4小时，然后在1％琼脂糖凝胶中150V电泳，紫外灯下切下回收大小NLTA(800bp)、NLTB(400bp)左右的片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)回收，离心管中的液体即是纯化的产物，取1ul电泳，检测并目测定量。
在50ul酶切体系中加入5ul质粒PUC18CKLTA、PUC18CKLTB(购自中国农科院哈尔滨兽医研究所)、5ul10×buffer、PstI和XhoI(购自大连宝生物公司)各2ul，其余用双蒸水补齐，混匀后37℃放置4小时，然后在1％琼脂糖凝胶中150V电泳，紫外灯下切下回收大小CKLTA(800bp)、CKLTB(400bp)左右的片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)回收，离心管中的液体即是纯化的产物，取1ul电泳，检测并目测定量。
2.5连接、转化、鉴定同时，用PstI和XhoI双酶切pTΩ4A，回收约2.9Kb片段，分别在10ul连接体系中加入1ul回收的NLTA、NLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×连接buffer，1ulT4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)，其余用ddH2O补齐，置于16℃低温水浴锅中12小时后，在转化DH5a感受态细胞，挑取菌落，摇菌，提质粒，酶切鉴定，正确的即为中间载体pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB。同样的方法，用HindIII和EcoRI(购自大连宝生物公司)双酶切pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB，回收Ω4ANLTA(2.1Kb)、Ω4ANLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA连接酶将Ω4ANLTA片段插入到植物表达载体pCAMBIA2301(购自CAMBIA公司，见图1)的HindIII和EcoRI之间中间载体pC234ANLTA，在用EcoRI酶切pC234ANLTA，乙醇沉淀，KlnowI(购自TAKARA公司)补平。同样的方法，补平Ω4ANLTB两端，10ul体系中T4连接酶补平的两个片段，构建从而构建高效植物表达载体pC234ANLTAB(见图2)，做酶切、PCR、测序鉴定。
同样的方法，用PstI和XhoI双酶切pTΩ4A回收约2.9Kb片段，分别在10ul连接体系中加入1ul回收的CKLTA、CKLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×连接buffer，1ulT4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)，其余用ddH2O补齐，置于16℃低温水浴锅中12小时后，在转化DH5a感受态细胞，挑取菌落，摇菌，提质粒，酶切鉴定，正确的即为中间载体pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，同样的方法，用HindIII和EcoRI(购自大连宝生物公司)双酶切pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，回收Ω4ACKLTA(2.1Kb)、Ω4ACKLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA连接酶将Ω4ACKLTA片段插入到植物表达载体pCAMBIA2301(购自CAMBIA公司，见图3)的HindIII和EcoRI之间中间载体pC234ACKLTA，在用EcoRI酶切pC234ACKLTA，乙醇沉淀，KlnowI(TAKARA公司)补平，同样的方法，补平Ω4ACKLTB两端，10ul体系中T4连接酶补平的两个片段，构建野生型对照表达载体pC234ACKLTAB(见图3)，做酶切、PCR、测序鉴定。
2.6农杆菌浸染法转化百脉根及鉴定2.6.1农杆菌EHA105感受态细胞的制备与转化1)挑取单菌落EHA105接种于5ml YEB(加利福平100mg/l)液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜；2)取2ml菌液转入50ml YEB液体培养基中继续培养至OD600≈0.5；3)转入无菌离心管，冰浴30min，5000r/min离心5min，去上清液；4)加入2ml 20mM CaCl2重悬菌体；5)每管200ul分装于无菌Eppendorf管中，于4℃保存；6)取20ug提取纯化的重组pC234ANLTAB、pC234ACKLTAB质粒DNA，分别加入200ul感受态细胞中，混匀；7)冰浴5min，转入液氮冷冻8min，迅速置37℃水浴5min；8)加入800ul YEB液体培养基，28℃，200r/min预表达4-5hr；9)将菌液移至YEB固体选择培养基(含卡那霉素100mg/l，利福平100mg/l)表面，均匀涂布于整个平板，28℃培养1-2天。
10)挑取转化后单菌落，接种于5ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃培养2天，碱裂解法小量提取质粒，用酶切或PCR方法鉴定。
2.6.2百脉根的遗传转化1)取百脉根种子75％酒精消毒后种在MS0培养基上发芽；2)剪取10日龄的百脉根子叶放在农杆菌菌液(OD600≈0.5)中浸泡5min或用基因枪轰击；3)用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺一层滤纸的MS固体基本培养基，28℃暗培养；4)三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS基本培养基+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中进行培养(25℃，钨灯3000mol.m-2.s-1，光照周期为16hr光照/8hr黑暗)；5)待抗性芽生长至2～3cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS基本培养基+NAA 0.2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根。由于幼苗生根时对卡那霉素非常敏感，此时适当提高Kan的浓度至100-125g/ml，以降低转化体假阳性出现的频率，从而减少后续筛选工作量。
2.6.3转基因百脉根的分子生物学鉴定2.6.3.1转基因植株的DNA提取1)取2g百脉根叶片，加入液氮充分研磨后，将粉末倒入50ml离心管中；2)待离心管中液氮挥发完全后，加入适量DNA提取Buffer(4ml/g)，充分混匀后(可适当加热)，室温下充分抽提10～15min；3)加入0.5倍体积苯酚，抽提5～10min；再加入0.5倍体积氯仿，继续抽提10～15min；4)3,750rpm，室温离心20min；5)吸取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，可见白色絮状DNA；6)将DNA沉淀挑入新的1.5ml离心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗涤沉淀；7)沉淀干燥后加入0.5ml TE(含终浓度50mg/ml的RNaseA)溶解，37℃消化RNA 0.5～1hr；8)等体积苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；9)上清加入1/10倍体积3M NaAc(pH5.2)和2-2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，于-20℃放置30min，12,500rpm，4℃离心15min，弃上清；10)70％乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后溶于适量TE或水中；11)取少许DNA，琼脂糖凝胶上检查其质量并进行DNA量的标定，其余DNA样品保存在-20℃备用。
2.6.3.2Southern杂交鉴定转基因植株按照《分子克隆》所提供的方法进行Southern杂交，Southern blot结果如图4。杂交结果说明，本发明大肠杆菌热敏毒素基因NLTAB已成功的整合到受体植物百脉根中。
2.6.3.3Nouthern杂交按照《分子克隆》所提供的方法进行Northern杂交，转基因百脉根Northernblot结果如图5。Northern杂交说明，本发明大肠杆菌热敏毒素基因NLTAB已在受体植物百脉根中得到表达。
检测转基因植株中蛋白的表达量测定及活性检测3.1提取转基因植物中的可溶性蛋白取100mg转本发明基因和非转基因植物材料，用液氮研成粉末，加100ul可溶性总蛋白提取液TBSP(10mM Tris-Cl，0.02％NaCl，0.001％PMSF，pH 8.0)，再研磨5min，4℃放置20分钟后把匀浆倒入离心管中，12000rpm，离心5min，上清即为提取物。
3.2Bradford测定总蛋白含量按照《精编分子生物学实验指南》所提供的方法进行Bradford法测蛋白含量，结果为转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根蛋白提取液，其可溶性总蛋白含量为13ug/ul，转野生型大肠杆菌热敏毒素基因pC234ACKLTAB载体的百脉根蛋白提取液，其可溶性总蛋白含量为10ug/ul。
3.3Western blot鉴定转基因植物中表达的大肠杆菌热敏毒素3.3.1试剂标准重组LTB蛋白和兔抗CT血清购自sigma，碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG和其他试剂购自promega等公司3.3.2转基因植株中大肠杆菌热敏毒素蛋白的检测按照《分子克隆实验指南》方法进行，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)积层胶为5％，分离胶为15％，电压为130V，上样量为20ul蛋白提取液，设20ul(0.1ug/ul)标准重组LTB设为阳性对照，20ul非转基因百脉根可溶性总蛋白提取液为阴性对照，20ul转野生型大肠杆菌热敏毒素基因pC234ACKLTAB载体的百脉根可溶性总蛋白提取液，20ul转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根可溶性蛋白提取液为样品电泳，蛋白质低分子质量标准蛋白，电泳结束后立即进行电转移，条件为30V，90mA，4℃过夜电转，结束后用丽春红染色，标出分子质量标准的位置，用5％脱脂奶粉封闭，一抗为sigma提供抗CT的兔血清，800倍稀释，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔的IgG，2000倍稀释，BCIP/NBT显色，照像，结果如图6。
阳性对照在11.6KD有特异性条带，转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根蛋白提取液、转野生型对照表达载体pC234ACKLTAB的百脉根蛋白提取液都在29KD、11.6KD有特异性带，而阴性对照则无特异条带，说明本发明血凝素蛋白基因已在植株中表达。
3.4ELISA测定转基因植物中大肠杆菌热敏毒素的蛋白量设标准LTB为阳性对照，野生型非转基因百脉根可溶性蛋白提取液为阴性对照，转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根可溶性蛋白提取液为测定样本1，转野生型表达载体pC234ACKLTAB的百脉根可溶性蛋白提取液为测定样本2。
3.4.1试剂标准重组LTB蛋白和兔抗CT血清购自sigma，碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG和其他试剂购自promega等公司1)包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)NaCO31.59克、NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml。
2)洗涤缓冲液(pH7.4 PBST)KH2PO40.6克、Na2HPO4·2H2O2.9克、NaCl8.0克、KCl0.2克、Tween-200.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml。
3)稀释液牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml。
4)终止液(2M H2SO4)蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
5)底物缓冲液(pH5.0磷酸/柠檬酸)2M Na2HPO4(28.4克/L)25.7ml、0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml、加蒸馏水50ml。
6)TMB(四甲基联苯胺)使用液TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml、底物缓冲液(pH5.5)10ml、0.75％H2O232ul。
3.4.2器材1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50ul及100ul加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
3.4.3操作步骤1)包被用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10ug/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。
2)加样加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔(非转基因植物的蛋白)及阳性对照孔。
3)加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4)加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5)终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6)结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
7)用标准阳性LTB蛋白不同量(mg)稀释梯度为横坐标，以450nm OD值为纵坐标，绘制标准曲线，测转基因阳性百脉根可溶性蛋白提取液进行同样条件下OD值，计算出大肠杆菌热敏毒素的含量。
结果见表1表1 转基因百脉根细织中大肠杆菌热敏毒素的表达量
注样本0为阴性对照结果发现，转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根蛋白提取液中大肠杆菌热敏毒素蛋白含量占植物可溶性总蛋白的0.6％，转对照表达载体pC234ACKLTAB的百脉根蛋白提取液中大肠杆菌热敏毒素蛋白含量占植物可溶性总蛋白的仅为0.01％，本发明基因可在植物中高表达，与野生型基因相比，其表达量提高了近60倍。
3.5GM1-ELISA检测GM1结合性GM1-神经节苷脂(购自sigma公司)，用GM1、BSA包被，方法参照上。结果如图7。
结果表明，转本发明植物表达载体pC234ANLTAB的百脉根蛋白提取液中大肠杆菌热敏毒素蛋白有GM1结合活性。
转基因植物的繁殖和培育筛选出稳定表达大肠杆菌热敏毒素的转基因百脉根后，通过常规组织培养方法扩繁，然后将这些幼苗转入田间繁殖，获得转基因百脉根。
转本发明基因百脉根的免疫佐剂效果试验5.1实验动物24只7周龄BALB/c雌性小鼠，体重16～22g，分为4组，每组6只(购自北京维通利华实验动物有限公司)。
5.2试验材料1)PBS溶液(pH7.2)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，蒸馏水定容1L，调pH值7.2。
2)50ug/30ul牛血清白蛋白(BSA≥99.9％)(购自sigma公司)BSA溶于pH7.2的磷酸缓冲盐液(PBS)中，4℃，8000g，离心20min，取上清，滤膜过滤，配成50ug/30ul的浓度，-20℃保存备用。
3)含BSA50ug的各种百脉根可溶性总蛋白提取液30ul蛋白提取液中加入BSA50ug，溶解混匀。
5.3试验方法小鼠24只，随机分为4组，每组6只，以非免疫鼠血清作为0组，30ulPBS经鼻免疫的小鼠组为第1组、30ul含BSA50ug的PBS经鼻免疫的小鼠组为第2组、30ul含BSA50ug加非转基因百脉根可溶性蛋白提取液经鼻免疫的小鼠组为第3组、30ul含BSA50ug加转野生型表达载体pC234ACKLTAB百脉根可溶性蛋白提取液经鼻免疫的小鼠组为第4组，30ul含BSA50ug加转本发明植物表达载体pC234ANLTAB百脉根可溶性蛋白提取液经鼻免疫的小鼠组为第5组，在0、7、14天各经鼻腔免疫小鼠，21天后颈动脉采血，ELISA检测抗体水平。
ELISA检测抗体方法用含50ul BSA(30ug/ml)、碳酸盐50mM，pH9.6的包被缓冲液包被96孔玻板过夜，再用PBS-Tween20清洗缓冲液洗3次，用1％明胶封闭板，清洗后每孔中加入稀释样品50ul，室温温育过夜，再用清洗缓冲液清洗，加入50ul800倍稀释的辣根过氧化酶标羊抗鼠IgG抗体(购自sigma公司)，室温放置2小时，清洗后，50ulTMB-H2O2(购自Bio-rid公司)显色30min，1MH2SO410ul终止，405nm检测，试验结果见图8。
试验结果表明，采用本发明转基因百脉根的可溶性蛋白提取液作为佐剂免疫小鼠，其血清中抗BSA血清IGg显著升高，证明本发明转基因植物有增强免疫应答的作用，具有良好的免疫佐剂效果。
序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所，深圳市农科集团公司<120>编码大肠杆菌热敏毒素基因及其表达载体和用途<130>fm003<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>777<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>artificial<400>1atgaagaaca tcactttcat cttcttcatc ctcctcgctt ctccactcta cgctaacggt 60gacaagctct acagggctga ttctaggcca ccagatgaga tcaagaggtc tggtggtctc120atgccaaggg gtcataacga gtacttcgat aggggtactc agatgaacat caacctctac180gatcatgcta ggggtactca aactggtttc gtgaggtacg atgatggtta cgtgtctact240tctctctctc tcaggtctgc tcatctcagg ggtcaatcta tcctctctgg ttactctact300tactacatct acgtgatcgc tactgctcca aacatgttca acgtgaacga tgtgctcggt360gtgtactctc cacatccata cgagcaagag gtgtctgctc tcggtggtat cccatactct420cagatctacg gttggtacag ggtgaacttc ggtgtgatcg atgagaggct ccataggaac480agggagtaca gggataggta ctacaggaac ctcaacatcg ctccagctga ggatggttac540aggctcgctg gtttcccacc agatcatcag gcttggaggg aggagccatg gatccatcat600gctccacaag gttgcggtaa ctcttctagg actatcactg gtgatacttg caacgaggag660actcagaacc tctctactat ctacctcagg aagtaccaat ctaaggtgaa gaggcagatc720ttctctgatt accaatctga ggtggacatc tacaacagga tcaggaacga gctctaa 777<210>2<211>375<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>artifical<400>2atgaacaagg tgaagttcta cgtgctcttc accgctctcc tctcttctct ctgcgctcat60ggtgctccac agtctatcac cgagctctgc tctgagtacc ataacaccca gatctacacc 120atcaacgata agatcctctc ttacaccgag tctatggctg gtaagaggga gatggtgatc 180atcaccttca agtctggtgc taccttccag gtggaggtgc caggttctca gcatatcgat 240tctcagaaga aggctatcga gaggatgaag gataccctca ggatcaccta cctcaccgag 300accaagatcg ataagctctg cgtgtggaac aacaagaccc caaactctat cgctgctatc 360tctatggaga aactaa 37权利要求
1.一种编码大肠杆菌热敏毒素基因NLTA，其特征是具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种编码大肠杆菌热敏毒素基因NLTB，其特征是具有序列表中SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
3.包含权利要求1和2所述基因的植物表达载体。
4.按照权利要求3所述的植物表达载体，其特征是所述的植物表达载体是pC234ANLTAB。
5.权利要求3所述植物表达载体的应用方法，包括如下步骤将权利要求3所述的植物表达载体转化到受体植物中，获表达目的基因的转基因植物。
6.按照权利要求5所述的应用方法，其特征是所述的植物表达载体是pC234ANLTAB；所述的转化方法选自农杆菌浸染法、基因枪法、花粉管通道法、脂质体介导法或浸泡转化法；所述的受体植物选自红三叶草、白三叶草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、烟草、马铃薯、百脉根或番茄。
7.按照权利要求6所述的应用方法，其特征是所述的转化方法为农杆菌浸染法；所述的受体植物为百脉根。
8.一种免疫佐剂，其特征是由权利要求5～7任一所述应用方法制备得到的产品。
9.权利要求1所述的基因在制备免疫佐剂中的用途。
10.权利要求2所述的基因在制备免疫佐剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种新的编码大肠杆菌热敏毒素的基因NLTAB以及该基因的植物表达载体的构建、转化及表达。根据人源性大肠杆菌热敏毒素的氨基酸序列，采用密码子优化原则设计，人工合成新的编码大肠杆菌热敏毒素(A亚单位、B亚单位)的基因－NLTA、NLTB；构建高表达上述基因的重组植物表达载体pC234ANLTAB；获得高表达大肠杆菌热敏毒素的转基因植株；动物试验证实，转本发明基因植株能有效加强共免疫抗原的免疫应答反应，具有良好的免疫佐剂效果。
文档编号C12N15/87GK1861792SQ200510068058
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月9日 优先权日2005年5月9日
发明者吴燕民, 唐益雄, 刘建利, 卢运明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 深圳市农科集团公司