专利名称：：测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法测定癌症对表皮生长因子受体靶向性治疗反应性的方法对相关申请的交叉参考本申请在35U.S.C.119(e)之下要求递交于2004年3月31日的美国临时申请系列号60/558,218，递交于2004年4月9日的美国临时申请系列号60/561,095，递交于2004年4月27日的美国临时申请系列号60/565,753，递交于2004年4月27日的美国临时申请系列号'60/565,985，递交于2004年5月25日的美国临时申请系列号60/574，035，递交于2004年6月7日的美国临时申请系列号60/577,916和递交于2004年7月29日的美国临时申请系列号60/592，287的权益，在此将其内容全部并入作为参考.政府支持本发明由国立卫生研究院(N1H)奖助金号ROICA092824，P50CA090578，POl95281,和1K12CA87723-01支持，美国政府具有其某些权益.背景上皮细胞癌症，例如，前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌等，是特征为上皮细胞异常、加速生长的疾病。这种加速的生长最初引发肿瘤形成.最后，还能够发生向不同器官位点的转移.尽管已经在各种癌症的诊断和治疗上取得了一些进展，但这些疾病仍然导致显著的死亡率.肺癌是工业化国家中主要的癌症死亡原因.根据细胞在显微镜下如何显现，将在肺中开始的癌症分成两种主要类型，非小细胞肺癌和小细胞肺癌.非小细胞肺癌(鳞状细胞癌，腺癌，和大细胞癌)一般比小细胞肺癌更慢地传播到其它器官.大约75%的肺癌病例被分类为非小细胞肺癌(例如，腺癌)，而其它25%为小细胞肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)是在美国、日本和西欧癌症死亡的主要原因.对于患有进行性疾病的患者来说，化疗在存活上提供了最适度的益处，但代价是显著的毒性，这强调了对治疗刑的需要，所述治疗剂特异性靶向ii脂导肿瘤生长的关鍵遣传损伤(SchillerJH等，NEnglJMed，346:92-98，2002),表皮生长因子受体(EGFR)是170千道尔頓(kDa)的膜结合蛋白，其表达于上皮细胞的表面上.EGFR是蛋白质酪氨酸激醉的生长因子受体家族的成员，所述激酶是一类细胞周期调控分子(W.J.Gullick等，1986，CancerRes.,46:285-292),EGFR当它的配体(EGF或TGF-a)结合细胞外结构域时被激活，导致受体细胞内酪氨酸激酶结构域的自体磷酸化(S.Cohen等，1980，J.Biol.Chem.,255:4834-4842;A,B.Schreiber等，1983，J.Biol.Chem.,258:846-853).EGFR是促进生长的癌基因，erbB或ErbBl的蛋白产物，但是该基因是一种家族的成员，即原癌基因的ERBB家族，其据信在许多人类癌症的发生和发展中发挥重要作用.特别地，已经在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及胶质母细胞瘤中观察到EGFR表达的提高.癌基因的ERBB家族编码四种，结构相关的跨膜受体，即，EGFR，HER-2/neu(erbB2)，HER陽3(erbB3)和HER-4(erbB4),临床上，已经报道肿瘤中的ERBB癌基因扩增和/或受体过表达与疾病复发和患者不良预后，以及与治疗中的反应性有关(L.Harris等，1999,Int.J.Biol.Markers,14:8嗎15;和J.Mendelsohn和J.Baselga,2000，Oncogene,19:6550-6565),EGFR由三个主要结构域组成，即，细胞外结构域(ECD)，其被糖基化并且包含配体结合性穴和两个半胱氦酸富集区；一个短的跨膜结构域，和一个具有固有酪氨酸激醃活性的细胞内结构域.所述跨膜区将配体结合结构域连接到细胞内结构域上.氨基酸和DNA序列分析，以及EGFR的非糖基化形式的研究表明EGFR的蛋白质主链具有132kDa的质量，具有1186个氨基酸残基氨基酸残基(A.L.Ullrich等，1984，Nature,307:418-425;J.Downward等，1984，Nature,307:521-527;C.R.CarHn等，1986,Mol.Cell.Biol"6:257-264;和F.L.V.Mayes和M,D.Waterfield，1984，TheEMBOJ"3:531-537),EGF或TGF-a与EGFR结合激活信号转导途径并导致细胞增殖.EGFR的二聚体化，构象变化以及内化作用作用来传递细胞同信号，导致细胞生长调控(G.Carpenter和S.Cohen,1979，Ann.Rev.Biochem.，48:193-216),影响生长因子受体功能，或导致受体和/或12配体过表达的遗传变化导致细胞增殖.此外，已经确定EGFR在细胞分化、细胞运动性增强，蛋白质分泌，新血管形成，入侵，转移和癌细胞对化疗刑和放射的耐受性中发挥作用.(M.-J.Oh等，2000，Clin.CancerRes"6:4760-4763).已经鉴定了多种EGFR的抑制剂，包括多种已经进行临床试验用于治疗各种癌症.近期的概述，见deBono,J,S.和Rowinsky，E.K,(2002)，"TheErbBreceptorFamily:ATherapeuticTargetForCancer",TrendsinMolecularMedicine,8，S19-26,在癌症的治疗中对于治疗性干预有希望的一组靶标包括HER-激酶axis的成员.它们在实体上皮肿瘤，例如，前列腺、肺和乳腺肿瘤中经常上调，并且在胶质母细胞瘤中也上调.表皮生长因子受体(EGFR)是HER-激酶axis的成员，并且已经是开发几种不同癌症疗法的靶标选择.EGFR酪氨酸激醉抑制刑(EGFR-TKIs)是这些疗法之一，因为酪氨酸残基的可逆性磷酸化是EGFR途径激活所必需的，换句话说，EGFR-TKIs阻抑对促进和/或维持细胞信号途径负责的细胞表面受体，所述信号途径诱导肿瘤细胸生长和分裂.具体地，据信这些抑制剂干扰EGFR激酶结构域，称为HER-l.更有希望的EGFR-TKIs为三个系列的化合物喹唑淋类、吡啶并嘧啶类和吡咯并嘧啶类.在临床开发中两种更先进的化合物包括Gefitinib(由AstraZenecaUKLtd.开发的化合物ZD1839;商品名IRESSA;下文为"IRESSA")和Erlotinib(由Genentech，Inc.andOSIPharmaceuticals,Inc.开发的化合物OSI-774;商品名TARCEVA;下文为"TARCEVA");二考都产生了令人鼓舞的临床结果.用IRESSA和TARCEVA进行常规的癌症治疗都包括每天口服不超过500mg的各自化合物.在2003年5月，当IRESSA被批准用于治疗晚期非小细胞肺癌患者时，它在这些产品中成为笫一个进入美国市场的.IRESSA是一种口服活性喹唑啉，其通过直接抑制EGFR分子上的輅氨酸激酶辨酸化而起作用.它竟夺三磷酸腺苷(ATP)结合位点，导致HER-激酶axis的抑制，IRESSA反应的确切机制并不完全清楚，不过，研究提示EGFR的存在是其作用的必要条件.在使用这些化合物中的显著限制是其受体在他们开始对治疗反应后可能会发展出对它们的治疗效果的耐受性，或者他们可能在任何可测量的程度上完全不对EGFR-TKIs反应.事实上，只有10-15%的晚期非小细胞肺癌患者对EGFR激酶抑制刑反应.因而，在靶向性治疗中对于那些最可能受益于这种治疗的个体来说更好地理解在对IRESSA和TARCEVA的敏感性之下的分子机制将是极其有益的.本领域明显需要癌症的令人满意的治疗，特别是上皮细胞癌症如肺、卵巢、乳腺、脑、结肠和前列腺癌症，其并入了TKI治疗的益处并克服了由患者展现的无反应性.这种治疗能够对个体的健康具有戏剧性的影响，特别是癌症特别常见的老人.发明概述酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法如gefitinib(IRESSA)在大多数爱上述癌症影响的个体中并不有效.本发明人令人吃惊地发现EGFR激酶结构域躯体变异的存在基本上提高了EGFR对TKI如IRESSA，TARCEVA的敏感性.例如小于30%的患有这种癌症的患者易受由目前TKIs进行的治疗的影响，而大于50%,更优选60，70,80，90%的具有EGFR激酶结构域突变的患者是易受影响的.此外，这些突变赋予EGFR提高的激酶活性.因而，具有这些突变的患者将可能对目前的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法，例如，gefitinib有反应.因此，本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体(EGFR)靶向性治疗有效性的可能性的新方法.该方法包括相对于野生型erbBl基因检测所述患者的erbBl基因的激酶结构域中的至少一种核酸变异的存在或缺失.至少一种变异的存在表示EGFR靶向性治疗可能有效.优选地，所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性.随后可以用EGFR靶向性治疗来治疗所述患者.在本发明的一个实施方案中，所述EGFR靶向性治疗是路氨酸激酶抑制刑.在优选的实施方案中，所述路氨酸激酶抑制刑是苯氨基喹唑啉.所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉，优选地，所述合成的苯氨基全唑啉为gefitmib或erlotmib。在另一个实施方案中，所述EGFR把向性治疗是不可逆的EGFR抑制剂，包括4-二甲基氡基-1)11"2-烯酸4-(3-氯-4-象-苯氨基)-3-氛基-7-乙氣基-喹啉-6-基-酰胺("EKB-569"，有时称作"EKI-569"，见例如WO/2005/018677和Torrance等，NatureMedicine,vol.6，No.9，S印t.2000，p.1024)和/或HKI-272或HKI-357(Wyeth;见Greenberger等，Proc.llthNCIEORTC-AACRSymposiumonNewDrugsinCancerTherapy,ClinicalCancerRes.Vol.6Supplement,Nov.2000,ISSN1078-0432;inRabindran等，CancerRes.64:3958-3965(2004);HolbroandHynes，Ann.Rev.Pharm,Tox.44:195-217(2004);Tsou等，j.Med.Chem.2005,48,1107-1131;andTejpar等，J.Clin,Oncol.ASCOAnnualMeetingProc.Vol.22，No.l4S:3579(2004)),在本发明的一个实施方案中，所迷EGFR获自有或处于发生癌症危险中的患者的生物样品.EGFR(或erbBl基因)激酶结构域中的变异影响ATP结合口袋的构象结构.优选地，EGFR激酶结构域中的变异是框内删除或外显子18、19、20或21中的取代.在一个实施方案中，所述框内删除在EGFR(erbBl)的外显子19中.优选地所述外显子19中的框内删除在删除处至少由密码子747，748，749，和750上的氨基酸亮氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸组成.在一个实施方案中，所述框内删除包含核苷酸2235-2249并删除氨基酸746-750(序列谷氨酸，亮氨酸，精氨酸，谷氨酸和丙氨酸)，见表2,表S2，困2B，图4A，图5，SEQIDNO:511,困6C,和困8C.在另一个实施方案中，所述框内删除包含核苷酸2236-2250并删除氛基酸氨基酸746-750,见表S2，困5，SEQIDNO:51，和困6C.或者，所述框内删除包含核苷酸2240-2251，见表2,困2C,图4A，图5,SEQIDNO:511，或核苷酸2240-2257，见表2,表S3A，困2A，闺4A，困5，SEQIDNO:511，困6C,和图8E.或者，所述框内删除包含核苷酸2239-2247与在核苷酸2248上的半胱氨酸对鸟嚷呤的取代，见表S3A和困8D，或核苷酸2238-2255的删除和核苷酸2237上的胸腺嘧啶对腺嘌呤的取代，见表S3A和图8F，或核苷酸2254-2277的删除，见表S2,或者，所述删除包含核苷酸2239-2250delTTAAGAGAAGCA;2251A>C，或2240-2254ddTAAGAGAAGCA，或2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG，如表S3B中所示，在另一个实施方案中，所述取代在EGFR的外显子2中.所述外显子2中的取代包含至少一个氨基酸，在一个实施方案中，所述外显子2中的取代在核苷酸2573上包含一个鸟嚷呤对胸腺嘧啶的取代，见图4A和图5，SEQIDNO:511.这种取代导致氨基酸取代，其中野生15型亮氨酸在氨基酸858上被精氨酸所替换，见困5,表2，表S2,表S3A,困2D，图6A，困8B，和SEQIDNO:512.或者，所述外显子2中的取代在核苷酸2582上包含一个腺嚷呤对胸腺嘧啶的取代，见困4A和困5，SEQIDNO:511.这种取代导致了氡基酸取代，其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷氨酰胺所替换，见困5,表2，图2E，表S3B，和SEQIDNO:512,所述取代还可以在EGFR的外显子18中.在一个实施方案中，所述外显子18中的取代是在核苷酸2155上胸腺嘧啶对鸟嚷呤的取代，见图4A和困5，SEQIDNO:511.这种取代导致了氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被半胱氨酸所取代，见困5，SEQIDNO:512.在另一个实施方案中，所述外显子18中的取代是在核苷酸2155上腺噪呤对乌嘌呤的取代，导致氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被丝氨酸所取代，见表S2，困6B，困8A，图5,SEQIDNO:511和512.在另一个实施方案中，所述取代是在SEQIDNO:511的核苷酸2316之后和核苷酸2317之前乌嚷呤，鸟嚷呤和胸腺嘧啶(GGT)的插入(23162317insGGT),这也可以描述为纈氨酸(V)在氨基酸772上的插入(P772一H733insV).其它的突变显示于表S3B中并包括，例如，在SEQIDNO:511的核苷酸2309之后和核苷酸2310之前CAACCCGG的插入和在SEQIDNO:511的核苷酸2311之后和核苷酸2312之前GCGTGGACA的插入.所述取代还可以在外显子20中并且在一个实施方案中为在核苷酸2334和2335上的AA对于GG的取代，见表S3B.总之，在优选的实施方案中，erbBl基因的核酸变异是在SEQIDNO511的核苷酸2155上胸腺嘧啶对乌嚷呤或腺嚷呤对鸟嚷呤的取代，在SEQIDNO511的核苷酸2235-2249,2240-2251,2240-2257，2236-2250，2254-2277，或2236-2244的删除，在SEQIDNO511的核苷酸2316之后和在核苷酸2317之前核苷酸鸟嚷呤，鸟嚷呤，和胸腺嘧咬(GGT)的插入，以及在SEQIDNO511的核苷酸2573上乌嚷呤对胸腺嘧啶或在2582上腺嚷呤对胸腺嘧啶的取代.通过扩增编码受体的核酸片段可以测定至少一个核酸变异的存在或缺失的检测.待扩增的片段为1000核苷酸长，优逸地，500核苷酸长，最优选ioo核苷酸长或更小.待扩增的片段可以包括多种变异.在另一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测提供了将包含变异位点的EGFR核酸与至少一种核酸探针接触.所述探针优选地与包括变异位点并且在变异位点包含互补核苷酸的核酸序列在选择性杂交条件下杂交.杂交可以用可检测的标记进行检测.在又一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括对至少一个核酸序列进行测序并将获得的序列与已知的erbBl核酸序列比较.或者，至少一个核酸变异的存在或缺失包含至少一个核酸序列的质谦测定.在优选的实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括进行聚合酶链式反应(PCR).扩增包含假定变异的erbBl核酸序列并测定扩增的核酸的核苷酸序列.测定扩增的核酸的核苷酸序列包括对至少一个核酸片段进行測序.或者，通过利用任何能够根据其大小分离扩增产物的方法，包括自动的和手动的凝胶电泳等等可以分析扩增产物。或者，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括测定基因中多种变异的单倍型.在另一个实施方案中，通过分析erbBl基因产物(蛋白质)t可以检测EGFR变异的存在或缺失.在这种实施方案中，使用特异性结合变异EGFR的探针.在优选的实施方案中，所述探针是优选结合到变异EGFR上的抗体.变异EGFR的存在预示着EGFR靶向性治疗有效的可能性.或者，所述探针可以是抗体片段，嵌合性抗体，人源化抗体或适体.本发明进一步提供一种探针，其在选择性结合条件下特异性结合到在EGFR基因(erbBl)中包含至少一个核酸变异的核苷酸序列上.在一个实施方案中，所迷变异是在erbBl的激酶结构域中的突变，其赋予ATP结合性口袋的结构变化，本发明的探针可以包含大约500个核苷酸碱基的核苷酸序列，优选大约100个核苷酸碱基，最优选大约50个核苷酸碱基或大约25个核苷酸碱基或更小的长度.所述探针可以由DNA，RNA,或肽核酸(PNA)组成。另外，所述探针可以包含可检测的标记，如例如，荧光或酶学标记，17本发明另外提供一种在受癌症影响的患者中测定表皮生长因子受体(EGFR)靶向性治疗有效的可能性的新方法.所述方法包括测定来自患者的生物样品中的EGFR的激酶活性.与正常对照相比，在用EGFR配体剌激之后激醃活性的提高表明EGFR靶向性治疗很可能是有效的.本发明进一步提供一种治疗具有或处于形成癌症的危险之中的患者的新方法.所述方法包括确定患者的EGFR的激酶结构域是否包含至少一种核酸变异。优选地，EGFR位于肺瘤或癌症的位点上并且所述核酸变异是躯体性的.这种变异的存在表示EGFR靶向性治疗将是有效的.如果所述变异存在，向患者施用酪氨酸激醃抑制剂.如上，向经鉴定的患者施用的輅氨酸激醉抑制刑可以是苯氨基喹唑啉或不可逆的酪氨酸激蘇抑制剂，如例如，EKB-S69,HKI-272和/或HKI-357(Wyeth),优选地，所述苯氨基全唑啉是合成的的苯氡基喹唑啉并且最优选地所述合成的的苯氨基喹唑啉是gefitinib和erlotinib,要通过本发明的方法治疗的癌症包括，例如，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、視网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌，在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌.还包括实施本发明的PCR方法的试刑盒.所述试剂盒包括至少一对设计来退火到基因边界核酸区上的简并引物对，所述基因编码EGFR激酶结构域的ATP结合口袋.此外，所述试剂盒包含实施PCR扩增所必需的产品和试刑，以及说明书.在优选的实施方案中，包含在试剂盒中的引物对逸自SEQIDNO:505，SEQIDNO:506，SEQIDNO:507，和SEQIDNO:508.在实施例中的表6和7中列出的引物也是优选的.在又一个实施方案中，本发明公开了一种选择化合物的方法，所述化合物抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性.作为第一步，将变异EGFR与可能的化合物接触.随后检测所述变异EGFR得到的激酶活性并选择抑制变异EGFR的激酶活性的化合物.在一个实施方案中，所述变异EGFR包含在细胞中.还可以使用所述方法选择变异EGFR的激蘇活性的化合物，所述变异EGFR在激酶结构域中具有次发突变，其赋予对TKI,例如gefitinib或erlotinib的耐受性，在一个实施方案中，对所述变异EGFR进行标记.在另一个实施方案中，将EGFR结合到固体支持物上.在优选的实施方案中，所述固体支持物是蛋白质芯片.在本发明的又一个实施方案中，公开了一种抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性的药物组合物.抑制变异EGFR的催化剂激酶活性的化合物选自抗体、抗体片段、小分子、肽、蛋白质、反义核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核苷酸适体，和肽适体.还公开了一种治疗患有EGFR介导性疾病的患者的方法，按照该方法，对患者施用抑制变异表皮生长因子受体(EGFR)的催化性激酶活性的药物组合物.在一个实施方案中，所述EGFR介导性疾病是癌症，在优选的实施方案中，所述癌症是上皮起源的.例如，所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌，在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌.在另一个实施方案中，公开了一种预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突变(或选摔突变)的方法.将表达erbBl的变异形式的细胞与有效的，然而是亚致死剂量的酪氨酸激酶抑制剂接触.选择抗路氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸分析erbBl激酶结构域中其它突变的存在.在一个实施方案中，所述细胞是体外的，在另一个实施方案中，所述细胞获自转基因动物，在一个实施方案中，所述转基因动物是小鼠.在此小鼠模型中，待研究的细胞获自肿瘤活检组织.通过本发明选择的在erbBl激酶结构域中包含次发突变的细胞可以用在以上方法中以选择化合物，所述化合物抑制在激酶结构域中具有次发突变的变异EGFR的激酶活性.在预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突变的另一个实施方案中，首先将表达erbBl基因变异形式的细胞与效量的诱变剂接触.所述诱变剂是，例如，甲磺酸乙醋(EMS),N-乙基-N-亚确基脲(ENU),N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)，phocarbaxinehydrochloride(Pre),甲璜酸甲酴(MeMS)，苯丁醵氮芥(Chi),美法仑，porcarbazine19hydrochloride,环罅酰胺(Cp),碟酸二乙醋(Et2S04),丙烯酰胺单体(AA),三亚乙基密胺(TEM),氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺，N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)，7,12二甲基苯并(a)蒽(DMBA)，环氣乙烷，六甲基辨酰胺，bisulfan，或ethylmethanesulforate(EtMs).随后将细胞与有效的，但亚致死剂量的路氨酸激酶抑制刑接触.选择抗酪氨酸激酶抑制刑生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸分析erbBl激醃结构域中其它突变的存在.附图简述图1A-1B显示在顽固性非小细胞肺癌(NSCLC)中Gefitinib反应的代表性困示，病例6的胸腔CT扫描(表1),显示(困1A)用gefitinib治疗前在右肺中的大的质量，(图IB)在开始Gefitinib治疗后的六周出现显著的改善.图2显示Gefitinib反应性肿瘤中的EGFR突变.图2A-2C显示肿瘤样本中EGFR基因的核苷酸序列，在激酶结构域内具有杂合的框内删除(双峰)(出现顺序分别为SEQIDNOS643-654).在有义和反义方向的追踪显示证明了删除的两人断裂点；野生型核苷酸序列以大写字母显示，而突变序列以小写字母显示，delL747-T751insS突变的5'断裂点的前面为T-C取代，其并不改变编码的氨基酸.图2D和图2E显示杂合的错义突变(箭头)，导致在fi^氨酸激酶结构域内的氨基酸取代(SEQIDNOS656&658).双峰代表杂合突变位点上的两个核苷酸，为了进行比较，还显示了相应的野生型序列(SEQIDNOS655&657),图2F是二聚EGFR分子被EGF配体结合的流程图.突出了细胞外结构域(包含两种受体配体L卜结构域和fiirin-Hke结构域)，跨膜区，和细胞质结构域(包含催化性激酶结构域).指出了用途受体激活标记的自体礴酸化位点的酪氨酸"^(Y-1068)的位置，以及由EGFR自体磷酸化激活的下游效应剂(STAT3,MAP激酶(MAPK)，和AKT).显示了肿瘤相关突变的定位，都在酪氨酸激酶结构域中.图3表明突变EGFR的增强的EGF依赖型激活和突变EGFR对Gefitinib提高的敏感性.困3A显示野生型EGFR相比，在添加EGF到血清饥俄细胞中后delL747-P753insS和L858R突变体的配体诱导的激活时间过程.EGFR自体磷酸化被用作受体激活的标记，与Cos-7细胞中表达的EGFR总体水平(对照；右板)相比，使用用特异性识别EGFR的磷酸化輅氡酸11)68残基的抗体的蛋白质印迹(左板).在加入EGF(10ng/ml)的时间间隔上測重EGFR的自体砩酸化.图3B是野生型和突变型受体磷酸化作用的EGF诱导的图示(见版A).利用NIH图像软件对来自三个独立实验的放射自显影进行量化；将EGFR磷酸化作用的强度规格化为总体蛋白质表达，并显示为受体的百分比激活，带有标准偏差.图3C显示由Gefitinib产生的EGFR激活的剂量依赖型抑制.通过表达野生型或突变型受体的Cos-7细胞的蛋白质印迹分析证明EGFR的酪氨酸1068的自体鳞酸化，并用100ng/ml的EGF刺激30min.如所示对细胞不处理(U)或用提高浓度的Gefitiiiib预处理3hrs(左板)，表达的EGFR蛋白总量显示为对照(右板).图3D显示来自对图版3C所述的两种实验的结果的量化(NIH困像软件).将磷酸化的EGFR浓度规格化为蛋白质表达水平并表示为受体的百分比激活.图4显示了在EGFR的ATP-结合性口袋内关键位点上的突变的聚类.图4A显示在多种NSCLC情况下(SEQIDNOS495-504(DNA))，EGFR基因的外显子19中重叠的框内删除和外显子21的错义突变的位置，对每种外显子显示部分核苷酸序列，通过虚线标记删除并突出和对错义突变下划线；显示野生型EGFR核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNOS493&494(DNA)&509-510(氨基酸)).图4B显示EGFRATP裂口的立体结构，两翼是激酶结构域的氨基(N)和羧基(C)凸起部(源自PDB1M14的等同物，并利用Cn3D软件展示).抑制剂Gefitinib，闺示占据ATP裂口.显示了两种错义突变的定位，在激酶的激活性环内；三个框内删除都存在于另一个环内，在ATP裂口側翼。图4C显示EGFR激酶结构域的特写，显示与结合ATP或抑制剂相关的氨基酸残基。具体地，4-苯氨基喹唑淋化合物如gefitinib通过占21据ATP结合位点抑制催化，其中它们与甲碟氨酸793(M793)和半胱氨酸775(C775)残基形成氢鍵，而它们的苯胺环接近甲疏氨酸766(M766)，赖氨酸(K745)，和亮氨酸788(L788)残基.预测突变所靶向的环内的框内删除相对于抑制刑改变这些氨基酸的位置.显示突变的残基在酪氨酸激酶的激活环内.困5显示erbBl基因的核苷酸和氨基酸序列.所迷氨基酸被描述为本领域技术人员已知的单个字母.通过患者数目来突出激酶结构域中的核苷酸变异，见表2.SEQIDNO:511包括核苷酸1到3633,SEQIDNO:512包括氨基酸1到1210。图6A-6C:在EGFR和B-Raf激蘇结构域内的选定区的序列比对.人NSCLC中EGFR突变的描绘.iEGFR(gb:X00588;)NSCLC肿瘤中的突变以灰色突出显示.在多种肿瘤类型(5)中的B-Raf(gb:M95712)突变以黑色突出显示.星号表示残基EGFR和B-Raf之间保守的残基.困6A描绘了激活环中的L858R突变(SEQIDNOS477-479)。困6B描绘了P环中的G719S突变(SEQIDNOS480-482),图6C描绘了EGFR外显子19中的删除突变(SEQIDNOS483-489).图7:EGFR激酶结构域的三维结构中的错义突变G719S和L858R和Del-l删除的位置.激活环以黄色显示，P环以蓝色显示并指出C端凸起和N端凸起.由突变或删除靶向的残基以红色突出显示。Del-l突变靶向密码子746-750的残基ELREA.突变定位在激酶内高度保守的区域中并发现于p环和激活环中，其包围着ATP并且也是gefitinib和erlotinib预测结合的区域，图8A-SF.来自正常组织和来自肺瘤组织的EGFRDNA的代表性色谱.鉴定的突变的定位如下.图8A描绘了外显子18激酶结构域P环(SEQIDNOS659-660),图8B描绘了外显子21激酶结构域A-环(SEQIDNOS661-662),图8C描绘了外显子19激酶结构域Del-1(SEQIDNOS663-665)。图8D描绘了外显子19激酶结构域Del-3(SEQIDNOS666-668).困8E描绘了外显子19激酶结构域Del-4(SEQIDNOS669-671)。困8F描绘了外显子19激酶结构域Dd-5(SEQIDNOS672-674)。图9:EGFR和BCR-ABL多肽的序列比对和赋予药物耐受性表型的残基的定位，将由GenBank编号NM005228中公开的核苷酸编码的EGFR多肽(SEQIDNO:492)和由GenBank编号M14752中公开的核苷酸序列编码的BCR-ABL多肽(SEQIDNO:491)进行比对并用阴影标注保守性残基，通过星号表示赋予对酪氨酸激酶抑制剂imatinib(STI571，Glivec/Gleevec)耐受性的BCR-ABL突变.图10显示对于患有转移性NSCLC患者来说决定进行EGFR测试的过程.图11EGFR外显子18-24的困(未给出比例尺).箭头描述了鉴定突变的定位.星号表明在每个位置上具有突变的患者的数目.单相交图描绘了外显子19删除的重叠，以及具有每个删除的患者的数目，注意这些结果并没有包括目前所有的EGFR突变.详细描述本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体(EGFR)把向性治疗有效的可能性的新方法，该方法包括检测所述患者的erbBl基因的激酶结构域中的至少一种核酸变异的存在或缺失.至少一种变异的存在表示EGFR靶向性治疗可能有效.优选地，所述核苷酸变异提高EGFR的激酶活性.随后可以用EGFR把向性治疗来治疗所述患者.在本发明的一个实施方案中，所述EGFR靶向性治疗是酪氨酸激酶抑制刑.在优选的实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基喹唑啉.所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氦基喹唑啉，优选地，所述合成的苯氨基喹唑啉为gefitinib或erlotinib.定义术语"ErbBl","表皮生长因子受体"，和"EGFR"在本文中相互交换使用并指如，例如，在Carpenter等Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中公开的天然序列EGFR，包括其变体(例如如在Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变EGFR),ErbBl指编码EGFR蛋白产物的基因.本文所用的术语"提高激酶活性的核苷酸变异"指基因的核苷酸序列中的变异(即突变)，其导致提高的激酶活性.提髙的激酶活性是在所述核酸中的变异的直接结果并且所述基因编码的蛋白质相关联。本文所用的术语"药物"或"化合物"指施用给个体以治疗或预防或23控制疾病或状况的化学实体或生物学产品，或化学实体或生物学产品的组合.优选地，但并非必需地，所述化学实体或生物学产品是低分子量化合物，但是也可以是较大的化合物，例如，核酸的寡聚体，氨基酸，或糖类，包括但不限于蛋白质，寡核苷酸，核酶，DNA酶，糖蛋白，siRNAs，脂蛋白，适体，及其改进和组合.在本发明的背景中术语"基因型"指基因的特定等位形式，其可以用在特定位点存在于核酸序列中的特定核苷酸来定义.术语"基因的变异形式"，"基因的形式"，或"等位基因"指基因在群体中的一种特定形式，所述特定形式与相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一个，经常是大于一个变异位点的序列上有所不同.在基因的不同等位基因之间差异的这些变异位点上的序列称作"基因序列变异"或"变异"或"变体"。本领域已知的其它等同术语包括突变和多态性，尽管突变经常用来指与有害表型相关联的等位基因.在本发明的优选方面，所述变异选自由本文变异表中所列出的变异.在本发明的背景下，术语"探针"指能够可检测地区分结构不同的靶分子的分子.根据所用探针的类型和靶分子的类型，检测可以以多种不同方式实现.因而，例如，检测可以基因靶分子的活性水平的区别，但优选基于特异性结合的检测.这种特异性结合的例子包括抗体结合和核酸探针杂交.因而，例如，探针可以包括酶底物，抗体和抗体片段，优选核酸杂交探针.如本文所用的，术语"有效"和"有效性"包括药学有效性和生理安全性.药学有效性指治疗在患者中导致所需的生物学作用的能力.生理安全性指在细胞，组织和/或生物水平上的毒性，或其它有害生理作用的水平(通常称为副作用)，其是由治疗的施用而产生的."有效性较小的"指治疗导致药学有效性的治疗上明显较低的水平和/或有害生理作用的治疗上较高的水平.术语"引物"正如本文所用的，是指这样一种寡核普酸即，当这种寡核苷酸被置于催化合成与多核苷酸互补的引物延伸产物的条件下时，它能够用作沿互补链进行多核苷酸合成的起始点.这些条件包括在适当的緩冲液("緩冲液"包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的成份)中，和在适当的温度下存在四种不同的三磷酸核苷酸或核苷类似物以及一种或多种用于聚合的试剂例如DNA聚合酶和/或反转录24酶.引物必须长得足以在用于聚合蘇的试刑存在时引发延伸产物的合成.典型的引物含有长至少大约s个核苷酸的基本上与靶序列互补的序列，但是在某种程度上较长的引物是优选的.引物通常含有大约15-26个核苷酸，但也可以采用更长的引物.引物总是含有基本上与靶序列，即引物可以与之退火的待扩增的特异性序列，互补的序列.除了与靶序列互补的序列之外，引物还可任选地包含其它序列，术语"启动子序列"定义了由RNA聚合酶特异性识别的核酸序列单链，所述RNA聚合酶结合到所识别的序列上并引发产生RNA转录本的转录过程.原則上，可以采用任何启动子序列，只要对于该启动子具有已知的可获得的能够识别起始序列的聚合酶即可.已知的有用启动子是那些被某些噬菌体聚合酶，如噬菌体T3、T7或SP6识别的启动子."微阵列"是在固体支持物表面上形成的具有优选不连续区域，每一区域具有限定的面积，的线性或二维阵列.由单个固体支持物的表面上待检测的靶多核苷酸的总数来确定微阵列上不连续区域的密度，优选的是至少大约50/cm2，更优选的是至少大约100/cm2，甚优选的是至少大约500/cm2，并且更甚优选的是至少大约1，000/cm2,正如本文所用的，DNA微阵列是置于芯片或其它表面上的用来扩增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物阵列.由于每个特定引物组在阵列中的位置是已知的，因此基于靶多核苷酸与微阵列中特定位置的结合，可以确定它们的特性.术语"标记物"是指能够产生指示测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物.适宜的标记物包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分以及类似物质。于是，标记物是可以由分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电子的、光学的或化学的工具检测的任何组合物.术语"支持物"是指常规的支持物，如珠、颗粒、棒、纤维、过滤器、膜以及硅烷或硅酸盐支持物，如玻片.术语"扩增"广义上是指产生扩增产物，所述扩增产物可包括例如其它靶分子，或者靶样分子或者与靶分子互补的分子，所述分子是由样品中靶分子的存在而产生的.在靶物是核酸的情形中，利用DNA或RNA聚合酶或转录酶可以酶促产生扩增产物.25如本文所用的，"生物学样品"指从个体中分离的组织或液体的样品，它包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、肿瘤活检组织、尿液、粪便、痰、脊拔液、胸水、乳头吸取物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪液、唾液、乳液、细胞(包括但不限于血细胞)、肺瘤、器官，也包括体外细胞培养组分的样品.在优选的实施方案中，样品来自切除术、支气管活检组织，或原发性或转移性肿瘤的核心针活检组织，或来自胸水的细胞团.此后，使用细针吸取样品.样品可以是石蜡包埋或冷冻的组织.术语"抗体"意为一种免疫球蛋白，其能够结合抗原，如本文所用的抗体意为包括能够结合目标抗原或抗原片段的抗体片段，例如F(ab')2，Fab'，Fab.优选地，所述抗体结合抗原抑制EGFR的变异形式的活性.术语"人源化抗体"在本文用于描迷完全的抗体分子，即由两条完全的轻链和两种完全的重链组成，以及只由抗体片段，例如Fab，Fab',F(ab)2,和Fv组成，其中CDRs源自非人来源而剩余的lg分子的部分或其部分源自人抗体，优选地产生自编码人抗体的核酸序列.术语"人抗体"和"人源化抗体"在本文用来描述一种抗体，该抗体分子的所有部分都源自编码人抗体的核酸序列.这些人抗体是适于用在抗体疗法中，因为这些抗体将在人患者中引发小的或不引发免疫反应.术语"嵌合性抗体"在本文中用于描述抗体分子以及抗体片段，如上面在术语"人源化抗体"的定义中所述.术语"嵌合性抗体"表达人源化抗体.嵌合性抗体具有源自第一种哺乳类物种的重链或轻链氨基酸序列的至少一部分以及源自第二种不同的哺乳类物种的重链或轻链氨基酸序列的另一部分.优选地，所述可变区源自非人哺乳类物种并且恒定区源自人类物种，具体地，嵌合性抗体优选产自非人哺乳动物的编码可变区的9个核苷酸序列以及来自人的编码抗体恒定区的核香酸序列.表2是与本发明中所述方法相关的erbBl的激酶结构域中的DNA序列变异的部分列表.这些变化由本发明人在来自对gefitinib起反应的患有NSCLC的患者以及不接触gefitinib的患者的生物学样品的研究中鉴定.26利用任一种本领域公知的技术可以将核酸分子从特定的生物学样品中分离出来，所选的特定分离方法适于特定的生物学样品.例如冻融和碱裂解方法可以用于从固体物质中获得核酸分子；热和碱裂解方法可以用于从尿中获得核酸分子；而蛋白醉K提取可以用于从血液中获核酸(Rolff，A等PCR:ClinicalDiagnosticsandResearch,Springer(1994).检测方法可以用多种方式来测定在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中的erbBl基因的激酶结构域中特定变异或多种变异的存在或缺失.这些测试通常利用收集自生物学样品的DNA或RNA样品来进行，所述生物学样品例如，活检组织、尿、粪便、唾液、血液、细胞、组织刮屑、乳腺抽吸物或其它细胞物质，并且能够通过多种方法进行，包括，但不限于，PCR，与等位基因特异性探针杂交，酴学突变检测，化学剪切错配，质谱分析或DNA测序，包括小型测序.在特定的实施方案中，与等位基因特异性探针杂交能够以两种形式进行(l)等位基因特异性寡核苷酸结合到固相(玻璃、硅、尼龙膜)和溶液中标记的样品上，正如在许多DNA芯片应用中一样，或(2)在溶液中结合样品(经常是克隆的DNA或PCR扩增DNA)和标记的寡核苷酸(可以是等位基因特异性的或短的以便允许通过杂交进行测序).诊断测试可以包括一组变异，经常在固体支持物上，其能够进行一个以上变异的同时测定.在另一方面，测定erbBl基因中至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在必需单倍型测试.测定单倍型的方法是本领域技术人员已知的，例如，在WO00/04194中.优选地，测定至少一种提高激醃活性的核酸变异的存在或缺失包括通过聚合醉链式反应(PCR)測定变异位点的序列.或者，测定提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失可以包括链末端DNA测序或小型测序，寡核苷酸杂交或质谱分析.本发明的方法可以用来预測在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶向性治疗有效(或无效)的可能性.优选地，癌症包括上皮组织起源的癌症，包括，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网27膜癌、皮肤癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌.在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌.本发明一般性地涉及erbBl基因的激醉结构域中的变异的鉴定，其是在具有或处于形成癌症的危险之中的患者中EGFR靶向性治疗有效的指征.此外，在EGFR的激酶结构域中特异性变异的鉴定，在效果上，能够用作诊断或预防测试.例如，在erbBl基因的激酶结构域中至少一个变异的存在表明患者将可能受益于用EGFR靶向化合物进行的治疗，如，例如，輅氨酸激酶抑制剂.用于诊断性测试的方法是本领域公知的并公开于专利申请WO00/04194中，在此并入作为参考，在一种例示性的方法中，所述诊断性测试包括扩增跨越erbBl基因序列的激酶结构域中的一个或多个变异的DNA或RNA(—般在将RNA转变成cDNA后)片段。随后对这种扩增的片段进行測序和/或进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以便鉴定扩增片段中的核酸变异，PCR在一个实施方案中，本发明提供一种通过PCR，或，备选地，在连接链式反应(LCR)中筛选erbBl基因的激酵结构域中变异的方法(见，例如，Landegran，等，1988.Science241:1077-1080;和Nakazawa,等，1994.Proe.Natl,Acad.Sci.USA91:360-364),后者可以特别用于检测EGFR基因中的点突变(见，Abravaya，等，1995.Nucl.AcidsRes.23:675_682).该方法包括以下步骤设计筒并引物用于扩增靶序列，所述引物对应于基因的一种或多种保守性区域，利用获自测试生物学样品的DNA或cDNA作为模板用引物进行扩增反应，和分析PCR产物.测试生物学样品与对照样品的PCR产物的比较表明测试生物学样品中的变异.所述变化可以是核酸变异在测试生物学样品中的缺失或存在，备选的扩增方法包括自持序列复制(见，Guatelli,等，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878)，转录扩增系统(见，Kwoh，等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177);Qb复制酶(见，Lizardi，等，1988.BioTechnology6:1197),或任何其它核酸扩增方法，然后利用本领域技术人员公知的技术对扩增的分子进行检测。这存在的话.利用蛋白质的氨基酸序列或erbBl基因的激酶结构域的核酸序列作为指导设计根据本发明的有用引物，所述序列例如SEQIDNO:493，SEQIDNO:494,SEQIDNO:509，和SEQIDNO:510.在基因的同源性区域设计引物，其中至少两个同源区域被可变序列的差异区分隔开，所述序列在长度或核酸序列上是可变的.例如，相同的或高度同源的，优选具有至少大约6个，优选至少8-10个连接氨基酸的至少80%-85%，更加优选至少90-99%的同源性氨基酸序列，最优选地，所述氨基酸序列是100%相同的.基于密码子简并性和在已知基因家族成员之间给定位置上各种氨基酸的保持设计正向和反向引物.本文提到的同源性程度是基于利用标准序列比较软件进行的氨基酸序列分析，如使用默认设置的蛋白质-BLAST(http:〃www,iicbi.nlni,iiih,gov/BLAST/),下表3给出了简并密码子的用法和它们的标准符号<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>优选地避免任何6倍的简并密码子如L，R和S，因为它们将引入高于6倍的简并性.对于L来说，TTR和CTN折衷成YTN(8倍简并性)，对于R来说，CGN和AGR折衷成MGN(8倍简并性)，最后S，TCN和AGY能够折衷成WSN(16倍简并性).Inallthreecaseson6ofthese将会匹配靶序列.为了避免这种特异性的丧失，优选避免这些区域，或制成两群，每群都有备选的简并密码子，例如S在一个集合中包括TCN，而AGY在另一个臬合中.利用多种现有的计算机程序，包括，但不限于OligoAnalyzer3.0;OligoCalculator;NetPrimer;Metbprimer;Primer3;WebPrimer;PrimerFinder;Primer9;01igo2002;Pride或GenomePHde;Oligos;和Codebop可以设计引物，关于这些程序的详细信息可以获知，例如，www.咖lbiol.Net.利用本领域技术人员已知的标记可以对引物进行标记.这些标记包括，但不限于放射性、荧光、染料和酶学标记.利用能够根据其大小分离扩增产物的任何方法都可以进行扩增产物的分析，包括自动和手动的凝胶电泳，质谱分析等等.或者，利用序列差异，使用SSCP，DGGE,TGGE,化学剪切或限制性片段多态性以及杂交到例如核酸阵列上可以分离扩增产物.核酸分离、扩增和分析的方法对于本领域技术人员来说是常规的并且方案的例子可以见于，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual(3-VolumeSet)Ed.JosephSambrook,DavidW.Russel,andJoeSambrook，ColdSpringHarborLaboratory;3rdedition(January15，2001)，ISBN:08"69S773.用于PCR扩增的特别有用的方案来源是PCR(Basics:FromBackgroundtoBench)byM.J.McPherson，S.G.Mller，R.Beynon，C,Howe，SpringerVeiiag;1stedition(October15，2000)，ISBN:0387916008,优选地，使用下列引物通过聚合酶链式反应(PCR)对人EGFR的外显子19和21进行扩增外显子19有义引物，5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'(SEQIDNO:505);外显子19反义引物，5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG3，(SEQIDNO:506);外显子21有义引物，5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'(SEQIDNO:507);和外显子21反义引物，5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'(SEQIDNO:508),在备选的实施方案中，通过限制性酶切模式的变化可以鉴定来自样品细胞的EGFR基因中的突变.例如用一种或多种限制性内切酶对样品和对照DNA进行分离、扩增(任选地)、消化，并通过凝胶电泳测定片段长度大小并进行比较.在样品和对照DNA之间的片段长度大小差异表明样品DNA中的突变.另外，使用序列特异性核酶(见，例30如，美国专利号5,493,531)可以用来通过核酶剪切位点的形成或缺失来评估特异性突变的存在.检测EGFR基因中突变的其它方法包括利用防护剪切刑来检测RNA/RNA或RNA/DNA杂合双螺旋中的错配碱基的方法，见，例如，Myers，等，1985.Science230:1242,通常，本领域的"错配剪切"技术通过提供由包含野生型EGFR序列的RNA或DNA与获自组织样品的潜在突变RNA或DNA杂交(标记)形成的杂合双螺旋开始.用剪切双螺旋的单链区的试剂处理双链双螺旋，所述单链区如由于对照和样品链之间的碱基错配存在的区域.例如，RNA/DNA双螺旋可以用RNA酶进行处理而DNA/DNA杂合体用Sl核酶处理以酶学消化错配区.在其它的实施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA双螺旋都可以用羟胺或四氣化锇或用哌啶处理以便消化错配区.在消化错配我后，随后在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小分离得到的物质以测定突变的位点。见，例如，Cotton,等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4397;Saleeba，等，1992.MethodsEnzymol.217:286-295.在一个实施方案中，可以将对照DNA或RNA进行标记用于检测.在又一个实施方案中，错配剪切反应采用一种或多种蛋白质，其在检测和绘制获自细胞样品的EGFRcDNAs中的点突变终谦的限定系统中识别双链DNA中的错配碱基对(所谓的"DNA错配修复"酶)。例如大肠杆菌(E.coli)的mutY酶在G/A错配上剪切A而来自Hela细胞的胸腺嘧啶DNA糖基酶在G/T错配上剪切T,见，例如，Hsu，等，l"4.Carcinogenesis15:1657-1662,根据一种例示性的实施方案，将基于EGFR序列，例如，DEL-l到DEL-5，G719S,G857V,L883S或L858REGFR序列，杂交到来自测试细胞的cDNA或其它DNA产物上.用DNA错配修复酶处理双螺旋，剪切产物，如果有的话，可以由电泳方法等进行检测.见，例如，美国专利号5,459,039.在其它实施方案中，电泳迁移率的改变将被用于鉴定EGFR基因中的突变.例如，单链构象多态(SSCP)可以用来检測突变和野生型核酸之间电泳迁移率的差异.见，例如，Orita，等，1989.Proc.Natl,Acad.Sci.USA:86:2766;Cotton,1993.Mutat.Res.285:125-144;Hayashi，1992.Genet.Anal.Tech.Appl,9:73-79.将对样品的单链DNA片段和对照EGFR核酸进行变性并让它复性.单链核酸的二级结构随着序列31的不同而变化，得到的电泳迁移率的变化使得即使是单一碱基变化的检测成为可能.可以用标记探针对DNA片段进行标记或检测.通过使用RNA(而不是DNA)可以提高測定的灵敏性，其中二级结构对于序列的变化更加敏感.在一个实施方案中，主趙方法基于电泳迁移率的变化，利用杂合双螺旋分析分离双链的杂合双螺旋分子.见，例如，Keen,等，1991,TrendsGenet.7:5,在又一个实施方案中，利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定包含梯度变性刑的聚丙烯酰胺凝胶中的突变或野生型片段的迁移.见，例如，Myers,等，1985.Nature313:495.当DGGE用作分析方法时，将对DNA进行修饰以确保它不会完全变性，例如通过PCR加入大约40bp的高度熔解性富含GC的DNA的GC夹.在另一个实施方案中，使用温度梯度代替变性梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率的差异，见，例如,RosenbaumandReissner，1987.Biophys,Chem.265:12753,用来检测点突变的其它技术的例子包括，但不限于，选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增，或选择性引物延伸.例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知的突变置于中央并且只有如果发现了完全的配对随后才在允许杂交的条件下杂交到靶DNA上.见，例如，Saiki，等，1986.Nature324:163;Saiki，等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6230.当寡核苷酸附于杂交膜上并与标记的靶DNA杂交时，这些等位基因特异性寡核苷酸被杂交到PCR扩增的靶DNA或多种不同的突变上.或者，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以用在与本发明的关联中.用作特异性扩增引物的寡核苷酸可以在分子的中央(从而扩增依赖于差别杂交；见，例如，Gibbs，等，1989.Nucl.AcidsRes.17:24374448)或在一个引物的最外3'端携带目标突变，所述3'端在合适的条件下，可以防止错配，或减少聚合酶延伸(见，例如，P画ner，1993.Tibtech.11:238)此外希望在突变区导入新的限制性位点以创造基于剪切的检测.见，例如，Gasparmi,等，1992.Mol.CellProbes6:1.预期在某些实施方案中还可以利用扩增用的Taq连接酶进行扩增.见，例如，Barany，1991.Proc.Natl,Acad.Sci.USA88:189.在这些情况下，只有在5'序列的3'端上有完全配对才会发生连接，使得通过观察扩增的存在或缺失而在特异性位点上检测已知突变的存在成为成能.固体支持物和探针在备选的实施方案中，检测至少一种核酸变异的存在或缺失包括将上面鉴定的对应于erbBl基因的所需区域的核酸序列与探针接触.所述探针能够辨别基因的特定形式或特定变异或多种变异的存在，例如，通过差异结合或杂交.因而，例示性的探针包括核酸杂交探针，肽核酸探针，包含核苷酸的探针，其还包含至少一种核苷酸类似物，和抗体，例如单克隆抗体，和本文讨论的其它探针.本领域技术人员熟悉具有特异性的探针的制备.本领域技术人员将会认识到可以调节多种变量以优化基因的两种变异形式之间的区别，包括盐浓度、温度、pH的变化以及添加影响GC对AT碱基对差异亲和性的各种化合物，如四甲基氯化按.(见CurrentProtocolsinMolecularBiologybyF.M.Ausubel，R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,K.StruhlarxdV.B.Chanda(Editors)，JohnWiley&Sons,),因而，在优选的实施方案中，检测至少一种变异的存在或缺失包括将包括至少一个变异位故作多情的核酸序列与探针接触，优选核酸探针，其中与和在变异位点上具有非互补碱基的核酸序列形式的杂交相比所述探针优选与在变异位点上包含互补碱基的核酸序列形式杂交，其中所述杂交在逸择性杂交条件下进行.这种核酸杂交探针可以跨越两个或多个变异位点.除非另外指定，核酸探针可以包括一种或多种核酸类似物，探针或其它取代物或部分，只要碱基配对功能得以保留，可以设计探针来结合到，例如，SEQIDNO:495，SEQIDNO:497，或SEQIDNO:499的删除区两側上的至少三个连续的核苷酸上.当在适当条件下杂交时，这种探针将结合到EGFR的变异形式上，但不会结合到野生型EGFR上，这些杂交探针是本领域公知的，(见，例如，Sambrook等，Eds.，(mostrecentedition)，MolecularCloning:ALaboratoryManual,(thirdedition,2001)，Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.).严格的杂交条件一般将包括小于大约1M的盐浓度，更通常地小于大约500mM和优选地小于大约200mM.杂交温度可以低至51C，但一般大于22TC，更一般地大于大约1C,优选地大于大约37TC.较长的片段可能需要较高的杂交温度进行特异性杂交.其它因素可能影响杂交的严谨度，包括碱基组成和互补链的长度，有机溶剂的存在和碱基错配的程度；所用参数的组合比任何一个单独参数的绝对测量更重要.其它可以控制的杂交条件包括緩冲液类型和浓度，溶液pH，封闭刑(例如，重复序列，CotlDNA,封闭性蛋白质溶液)的存在和浓度以减少背景结合，去污刑类型和浓度，提高多核苷酸的相对浓度的分子如聚合物，金属离子及其浓度，螯合剂及其浓度，和其它本领域已知或可发现的条件.可以使用公式预测完全互补序列对给定探针的优化熔解温度，但是在一组杂交条件下的探针的真实熔解浓度必须进行经验性确定.另外，必须相对于其精确互补体对探针进行测试以确定给定组条件下的精确熔解温度，如在Sambrook等，"MolecularCloning,"3ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001中所述.利用与核苷酸相关联的支持物可以对给定的杂交溶液系统性改变杂交温度直到鉴定一个温度范闺，其允许检测在所需严谨度水平上的结合，可以在只有靶多核苷酸与高度互补体杂交的高度严谨度水平上，也可以在与探针具有互补区的其它靶多核苷酸可检测地杂交的较低水平上，所述可检测地杂交是在由非特异性结合到非互补性靶多核苷酸或支持物上而提供的背景水平之上进行的。当杂交在给定的条件组之下由潜在的靶多核苷酸在支持物上进行时，随后在提高的严谨条件下洗涤支持物(一般为更低的盐浓度和/或提高的温度，但其它条件可以变化)直到背景结合降低到可以见到明显的阳性信号的点上.这可以利用Geiger计数器作进行性监测，其中探针进行放射性标记，使用荧光成像仪，或通过其它检测探针结合的手段.在这些操作过程中不让支持物干燥，或者探针可以进行可逆性结合甚至是结合到背景位置上.当探针产生有利的背景或假阳性时，采用封闭剂，或者使用探针的不同区域或不同探针直到可以将阳性信号与背景区分开.一旦发现条件在背景之上提供令人满意的信号，就将提供阳性信号的靶多核苷酸分离出来并进一步作特征鉴定.可以对分离的多核苷酸进行测序；必要时，通过本领域已知的技术获得全长克隆；并且可以利用合适的栽体和宿主表达所述多核苷酸以确定鉴定的多核苷酸是否编码这样一种蛋白，其具有与衍生探针多核苷酸的蛋白具有相似活性.探针可以为10-50个核普酸.不过，还可以采用更大的探针，例如，50-500个核苷酸或更大.固相支持物本发明的固相支持物可以是任何适于支持核苷酸杂合和合成的固体材料和结构.优选的，固相支持物至少含一个相当坚硬的表面，在此表面上可以固定寡核苷酸引物.该固相支持物可由以下材料构成，例如，玻璃，合成聚合物，塑料，硬无孔尼龙或陶资制品.其他适宜的固体支持物材料是本领域技术人员已知并且可以轻易获得的.固相支持物的尺寸可以是任意标准微阵列尺寸，对DNA微阵列技术是有用的，该尺寸可以适应用来进行本发明的反应的特定仪器.用来固定寡核苷酸的固相支持物的衍生方法和材料是本领域技术人员已知的，并在，例如，美国专利号5,919,523中描述，此发明的公开内容此处作为参考被引用.固相支持物可以存在于包含液体容器中或是包含液体容器的一部分.例如，固相支持物可放置于一带边的小室中，其沿固相支持物的边生成一个封口，以便容纳在支持物上发生的聚合酶链反应(PCR).在一特定实施例中，小室在矩形支持物的每一側有壁，以确保PCR混合物保存于支持物上，也使得整个表面对于提供引物是用的.可以使用任何可利用的方式将本发明的寡核苷酸或寡核苷酸引物粘附、固定、提供和/或应用在固相支持物的表面上以便在固相支持物的特定位置上定位、固定、提供和/或应用寡核苷酸。例如，可使用影印法(Affymetrix，SantaClara，Calif)将寡核苷酸引物应用于芯片或固相支持物上的特定位置上，如在美国专利号US5,919,523，5,837,832，5，831，070和5，770，722，以上专利在此处作为参考被引用.可以将寡核苷酸引物应用到Brown和Shalon，美国专利号5,807,522(1998)中描述的固体支持物上.此夕卜，可以用机器人系统，如由GeneticMicroSystems(Woburn，Mass.),GeneMachines(SanCarlos,Calif)或CartesianTechnologies(Irvine,Calif)制造的系统将引物应用到固相支持物上.在本发明的一个方面，进行来自于一种生物样品的靶多核苷酸的固相扩增，其中多组寡核苷酸引物固定于一固体支持物上.在一优选的实施方案中，一组中的引物至少包括序列相同的笫一组引物，它与35靶多核苷酸的指定序列是互补的，能在适宜条件下与靶多核苷酸杂合，并适宜作为核酸合成(即，链延长或扩展)的起始引物.被选择的覆盖于参照序列的特定区域上的引物作为一个组固定于一固相支持物的非连续位置上.优选地，组与组之间的距离比用来检测扩增产物的方法的分辨率大.在一优选的实施方案中，固定引物形成微阵列或芯片，其可通过自动的方式来处理和检测.被固定的引物用于在适于核酸扩増方法的条件下进行靶多核苷酸的固相扩增.以此方式，在一种测定中可以测定erbBl基因的激酶结构域中的多种潜在变异的存在或缺失.在测量生物学来源在erbBl基因的激酶结构域里是否具有至少一种提高激酶活性的变异中，一群分离自健康个体的靶多核苷酸可以用作对照.或者，可以将分离自相同个体的健康组织的靶多核苷酸用作上面的对照.在微阵列上的原位型PCR反应可以基本上如在例如Embretson等，Nature362:359-362(1993);Gosden等，BioTechniques15(1):78-80(1993);He函rd等,Nuc.AcidRes.21(14):3159-3166(1993);Long等，Histochemistry99:151-162(1993);Nuovo等，PCRMethodsandApplications2(4):305-312(1993);Patterson等，Science260:976-979(1993)中所述的那样进行.或者，可以通过固相技术测定erbBl基因的激酶结构域中的变异，而不会在支持物上进行PCR。多种寡核苷酸探针，每种都在erbBl的激酶结构域中含有不同的变异，以一式两份，一式三份或一式四份的形式，可以结合到固相支持物上.通过本领域已知的和上述的选择性杂交技术可以检测测试生物学样品中变异的存在或缺失.质谱分析在另一个实施方案中，利用质谱分析测定在erbBl基因的激酶结构域中提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失.为了得到合适量的核酸分子用于进行质谱，扩增可能是必须的.可用于本发明的合适的扩增方法的实例包括克隆(Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)、聚合酶链反应(PCR)(C.R.Newton和A.Graham，《PCR》，BIOSPublishers,(1994))，连接酵链反应36(LCR)(Wiedma肌M等，(1994)《PCR方法应用》》(PCRMethodsAppl.)，巻3,5744页；F.Barany，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sd.USA)，1991年88巻189-93页)、链置换扩增(SDA)(G.TerranceWalker等，《核酸研究)>》(NucleicAcidsRes.)，l"4年22巻2670-77页)和变更方法如RT-PCR(Higuchi等，《生物/技术》(Bio/Technology)1993年11巻1026-1030页)、等位基因特异扩增(ASA)和基于转录的方法.为了方便质谱分析，含有待测序列的核酸分子可固定到固相支持物上.合适的固相支持物的实例包括球珠(如硅胶、可控多孔玻璃、磁珠、S印hadex/S印harose,纤维素)、平台表面或嵌片(如玻璃纤维滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、铜和硅)、毛细管、塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚二氣乙二烯膜或微量滴定板))；或者用包括球珠或平台表面相似材料做成的钉或梳子、或将球珠置入平台表面的凹点中如垫片(例如硅垫片).固定化可利用杂交法来完成，例如，基于已固定到固相支持物上的捕获核酸序列与也包含在含有待测核酸序列的核酸分子中的互补核酸序列之间的杂交，从而互补的核酸分子间的杂交不会被支持物妨碍，捕获核酸分子在固相支持物和捕获核酸序列间可含一至少5核苷酸长的间隔区，在激光脉冲影响下形成的二聚体可被断裂且解吸附可被激发.固相支持物结合的碱基序列可通过天然的寡聚核糖核酸或寡聚脱氧核糖核酸及其类似物(例如疏基修饰的裤酸二醋或磷酸三癍骨架)或使用寡核苷酸模拟物如PNA类似物(参见例如Nielsen等，Science,254，1497(1991))提供，它们可降低碱基序列对酶促降解的敏感性，因而提高固相支持物结合的捕获碱基序列的总体稳定性，在质谱分析前，"修饰"核酸分子可能是有用的，例如可降低汽化所需的激光能量和/或将片段化作用降至最低程度.修饰优选适用于固定化的靶检测位点.修饰的一个实例是核酸分子中磷酸二酯骨架的修饰(例如阳离子交换)，这可用于消除由于每核苷酸单位上结合的阳离子的不均一性导致的峰加宽现象.将核酸分子与烷基化试剂如烷基硤、硤乙醜胺、J3-碘乙醇或2，3-环氧乙烷-l-丙醇接触，核酸分子的单硫磷酸二醋键可转换为磷酸三醋键.同样地，利用氯化三烷基硅可将磷酸二酯鍵转换为无电荷的衍生物，进一步的修饰包括掺入降低脱噪呤37(MS中的片段化作用)敏感性的核苷酸如N7-或N9-脱氮嚷呤核苷酸或RNA元件，或使用寡聚核苷酸三酴或掺入烷基化的硫代磷酸酯官能团或掺入寡聚核苷酸模拟物如PNA.对于某些应用，同时检測位于一特异被捕获核酸片段(在阵列上的一个点上)上超过一个(突变的)位点或用不同固相支持物上寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模拟物阵列排列来实行并行检测可能是有用的."多路检测"可由几种不同的方法来获得.例如，通过使用相应的检测(探针)分子(如寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模拟物)，在一粑序列上的几个突变可被同时检测.然而，检测核苷酸D1、D2和D3的分子量差异必须足够大，同时检测(多路检测)才有可能.这种差异可通过序列本身(组成或长度)或在检测寡聚核苷酸中引入质量修饰官能团Ml-M3来获得.本发明中用到的优选的质诿检测方式是基质辅助激光解吸附离子化(MALDI),电喷雾(ES),离子回旋共振(ICR)和傅立叶变换.进行质详分析的方法是本领域技术人员已知的并且在MethodsofEnzymology，Vol.193:"MassSpectrometry"(J.A.McCloskey，editor)，1990，AcademicPress,NewYork中进行了描述.测序在其它的优选实施方案中，测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括对至少一和核酸序列进行测序.所述测序包括对包括至少一个变异位点，并且可能包括多个这种位点的erbBl的激酶结构域的一部分或多部分进行测序.优选地，所述部分为500个核苷酸或更少的长度，更加优选地为100个核苷酸或更少，最优选地为45个核苷酸或更少的长度.这种测序可以通过本领域技术人员所认知的各种方法进行，包括双脱氧终止法(例如，使用染色标记的双脱氧核苷酸)，和使用质详分析法.免疫检测在一个实施方案中，测定至少一种提高激酶活性的核酸变异的存在或缺失包括测定EGFR下游靶标的激活状态.本发明的发明人比较了EGFR的主要下游靶标的磷酸化状态.例如，已经检查了EGF-诱导的通过Ras的Erkl和Erk2的激活，通过PLCy/PI3K的Akt，以及通过JAK2的STAT3和STAT5的激活.通过Ras的Erkl和Erk2，通过PLCyPI3K的Akt,以及通过JAK2的STAT3和STAT5是介导EGFR的致癌作用的基本下游途径(R.N.Jorissen等，Exp.CellRes.284，31(2003)),本发明的发明人显示EGF诱导的Erk激活在表达野生型EGFR和两种活化性EGFR突变体的任一种之间无法区别.相反地，Akt和STAT5的裤酸化作用在表达两种突变EGFR的任一种的细胞中基本上得以提高..在表达突变EGFRs的细胞中类似地观察到STAT3的磷酸化作用.因而，在EGFR突变体内C末端酪氨酸残基的选择性EGF诱导的自体礴酸化与下游信号途径的选择性激活密切相关.在本发明的一个实施方案中，EGFR突变的存在可以利用本领域公知的免疫学技术进行测定，例如，抗体技术如免疫组织化学，免疫细胞化学，FACS扫描，免疫印迹，放射性免疫测定，蛋白质印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(ELISA)，利用针对EGFR激活的下游耙标的抗体的衍生技术.这些靶标的例子包括，例如，磷酸化STAT3，磷酸化STAT5，和磷酸化Akt.利用轔特异性抗体，可以测定STAT3，STATS，和Akt的激活状态，STAT3，STAT5,和Akt的激活可以用作活化性EGFR突变的诊断指标.在本发明的一个实施方案中，激活的(磷酸化的)STAT5，STAT3,或Akt的存在显示EGFR靶向性治疗可能有效.本发明提供了一种通过免疫组织化学或免疫细胞化学方法筛选测试样品中erbBl基因的激酶结构域中变异的方法.例如，可以利用免疫组织化学("IHC")和免疫细胞化学("ICC")技术.IHC是免疫化学对组织切片的应用，而ICC是免疫化学是在细胞或组织标记进行过特定的细胞学制备如，例如基于液体的制备后对它们的应用，免疫化学是一族基于特异性抗体使用的利用，其中使用抗体特异性靶向细胞内部或细胞表面上的分子.抗体一般包含一种标记物，其在遇到耙分子后将进行生化反应，由此经历变化颜色.在一些情况下，可以将信号扩增并入特定的方案中，其中在应用特异性一抗后使用包括标记染色的二抗.免疫组织化学测定是本领域技术人员已知的(例如，见Jalkanen，等，J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen，等，J.Cell,Biol.105:393087-3096(1987).多克隆或单克隆的抗体，可以购自多家商业供应商，或可以利用公知的方法进行生产，例如，如在Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,2ndEd;CoMSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1988)中所述的那样.一般，可用于本发明的抗体的例子包括抗-裤-STAT3，抗-磷-STAT5，和抗-砩-Akt抗体.这些抗体可以购自，例如,UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY)，NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)，NeoMarkers(Fremont,CA).一般，对于免疫组织化学来说，組织切片获自患者并且通过合适的固定刑如乙醇、丙酮和多聚甲醛进行固定，抗体与所述固定刑反应。进行免疫组织化学的常规方法在Harlow和Lane(eds)(l988)，在"AntibodiesALaboratoryManual",ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Ausbeletal(eds)(1987)，在CurrentProtocolsInMolecularBiology,JohnWileyandSons(NewYork,NY)中进行描述.适于这些检测测定的生物学样品包括，但不限于，细胞、活检组织、全血、血浆、血清、痰、脑脊液、乳腺抽吸物、胸水、尿等等.对于直接的标记技术，使用标记的抗体.对于间接的标记技术，将样品进一步与标记的物质反应.或者，可以利用免疫细胞化学.一般，细胞获自患者并且通过合适的固定剂如乙醇、丙嗣和多聚甲搭进行固定，抗体与所述固定剂反应.人样品的免疫细胞学染色的方法是本领域技术人员已知的并且，例如，在Brauer等，2001(FASEBJ，15，2689-2701)，Smith-Swintosky等，1997中进行描述.本发明的免疫学方法是有利的，因为它们只鶯要小量的生物学材料.这些方法可以在细胞水平上进行并且因而需要最少一个细胞.优选地，从具有或处于发生癌症危险中的患者中获得几个细胞并根据本发明的方法进行测定.其它的诊断方法用于检测突变型EGFR蛋白质的试剂是能够结合到突变型EGFR蛋白质上的抗体，优选地为具有可检测标记的抗体.抗体可以是多克隆的，或更优选地，是单克隆的.可以使用完整的抗体，或其片段(例如，Fab或F(ab)2).关于探针或抗体，术语"标记的"意在包括通过将可检测的物质偶联(即，物理性连接)到探针或抗体上的探针或抗体的直接标记，以及通过与另一种直接标记的试刑的反应进行的探针或抗体的间接标记.间接标记的例子包括利用荧光标记的二抗检测一抗和用生物素标记DNA探针从而可以用荧光标记的链審抗生物素对它进行检测.术语"生物学样品"意在包括分离自受试者的组织、细胞和生物液，以及存在于受试者体内的组织、细胞和液体.即，本发明的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物学样品中的突变型EGFRmRNA，蛋白质，或基因组DNA,例如，检测突变型EGFRmRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交.检测突变型EGFR蛋白的体外技术包括醉联免疫吸附测定(ELISAs),蛋白质印迹，免疫沉淀，和免疫荧光.用于检测突变型EGFR基因组DNA的体外技术包括向受试者体内导入标记的抗突变型EGFR蛋白抗体，例如，所述抗体可以用放射性标记进行标记，其在受试者中的存在和定位可以通过标记的成像技术进行检测.在一个实施方案中，所述生物学样品包含来自试验受试者的蛋白质分子.或者，所述生物学样品可以包含来自试验受试者的mRNA分子或来自试验受试者的基因组DNA分子.在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从对照受试者获得对照生物学样品，将对照样品一能够检测突变型EGFRmRNA，蛋白质，或基因组DNA的化合物或试剂接触，从而在生物学样品中检测突变型EGFRmRNA，蛋白质，或基因组DNA的存在，并将对照样品中的突变型EGFRmRNA,蛋白质，或基因组DNA的存在与测试样品中的突变型EGFRmRNA,蛋白质，或基因组DNA的存在相比较.在不同的实施方案中，诊断测定是针对突变型EGFR活性.在具体的实施方案中，所述突变型EGFR活性是酪氡酸激酶活性，一种这样的诊断测定是检测至少一种EGFR底物的EGFR介导的磷酸化作用。可以对于，例如，各种突变型EGFR多肽，各种包含突变型EGFR的组织，来自怀疑具有至少一种突变型EGFR的癌组织的活检组织等等测定EGFR活性的水平。任选地可以进行在这些各种细胞、组织或其提取物中的EGFR活性水平的比较.在一个实施方案中，在癌组织中高水平的EGFR活性水平可以诊断可能易受用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的影响的癌症.在相关的实施方案中，可以在治疗和未治疗的活检组织样品，细胞系，转基因动物，或任何这些的提取物之间测定EGFR活性水平抑制剂，以便与未治疗的对照相比来确定给定治疗对于突变型EGFR活性的影响.治疗患者的方法在一个实施方案中，本发明提供了一种通过測定erbBl基因的激醉结构域中至少一种提髙激酶活性的核酸变异的存在或缺失来选择对于患有癌症或处于形成癌症的危险之中的患者的治疗的方法.在另一个实施方案中，所述变异是多种变异，其中多种可以包括来自一个、两个、三个或多个基因位点的变异.在某些实施方案中，至少一个变异的存在是所述治疗将在患者中有效或有益(或更可能是有益)的指征.声明所述治疗将是有效的方法，即有益治疗效果的可能性比在erbBl基因的激酶结构域中不具有特定的提高激酶活性的核酸变异的适当存在的个人中更大.所述治疗将包括施用輅氨酸激酶抑制剂.所述治疗可以包括治疗组织，包括，但不限于輅氨酸激酵抑制刑组合以其它酪氨酸激酶抑制刑，化疗，放疗等.因而，与施用酪氨酸激酶抑制剂相关，"有效对抗"癌症的药物表明以临床上适当的方式给药导致对于患者的至少统计学上显著的部分的有益效果，如症况的改善，治愈，疾病负担的减轻，肿瘤质量或细胞数目的减小，生命的延长，生命质量的改善，或其它被熟悉治疗特定类型的疾病或状况的医生一般性认为是积极的效果.在优选的实施方案中，所述化合物是苯氨基喹唑啉或合成的苯氨基喹唑啉.欧洲专利发明者B·E·约翰逊,D·A·哈伯,D·W·贝尔,J·E·塞特尔曼,J·G·佩茨,M·迈耶森,P·A·贾恩,R·索德拉,T·J·林奇,W·R·塞勒斯申请人:综合医院公司;达纳-法伯癌症协会有限公司