专利名称：重组蛋白Rv3425及其在制备结核病试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和诊断试剂的领域，具体地说，本发明涉及一种新型的结核病诊断试剂，其制备方法及应用。
背景技术：
目前，结核病诊断广泛使用皮肤检测试剂—结核分支杆菌纯蛋白衍生物。然而，结核分支杆菌纯蛋白衍生物存在与环境分支杆菌以及M.novis BCG疫苗株的交叉反应，所以其诊断价值受到减弱。而且，由于BCG是一株活疫苗，可能使患者免疫系统受到损伤，因此，用结核分支杆菌纯蛋白衍生物检测，可能使免疫力低下的受检测者，例如接种了BCG或者患有AIDS的个体，感染疾病。而AIDS病人恰好是发生结核的高危人群。因此，研制出安全的特异性诊断结核试剂是十分紧迫的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于结核分枝杆菌的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供一种新型的结核诊断试剂。
本发明的再一个目的是提供上述试剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述试剂的应用。
本发明的一个方面，提供了一种新的重组质粒，即将Rv3425基因序列插入一般的商用表达质粒序列中。Rv3425基因NCBI登陆号BX842583.1；蛋白登陆号CAE55596.1。
本发明的“Rv3425基因序列”也包括对BX842583.1中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与BX842583.1核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出相同的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与BX842583.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与BX842583.1的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
本发明的重组质粒，通常将Rv3425基因插入表达质粒的多克隆位点处即得。
本发明的重组质粒制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
本发明中，可采用的载体有pET32a，pET28a，pET30a等。在本发明的一个实施例中，所用的质粒是pET32a。
本发明的另一方面，提供了一种结核杆菌相关重组蛋白，即重组蛋白是将插入Rv3425基因的重组表达质粒转化入宿主细胞而得到的。
用作检测试剂的Rv3425重组蛋白与NCBI上的CAE55596.1蛋白序列相比，加入了表达标签和表达载体相关序列。例如，使用pET32a质粒时，蛋白序列前面多了一段His Tag表达标签以及pET32a质粒上的一小段序列。
所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌(Escherichia coli)。可用于转化的宿主细胞可以是BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株或者BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株等。本发明的一个实施例中用的是BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株。
本发明的另一方面，提供了上述结核杆菌相关重组蛋白的制备方法，包括以下步骤(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；(2)Rv3425基因的扩增；(3)Rv3425基因插入表达质粒；
(4)将(3)所得的重组子转化入宿主细胞中；(5)诱导表达蛋白Rv3425；(6)纯化(5)的产物，得到Rv3425表达蛋白。
上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体的实验条件而定。
本发明的Rv3425基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人上合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
本发明中，表达重组Rv3425蛋白所用的表达质粒可以是pET32a、pET30a或者pET28a等。
在本发明的一个实施例中，重组Rv3425蛋白是按如下方法分离得到设计引物Rv3425(P上5’ACGGGATCCATGCATCCAATGATACCA；P下5’ATAAGCTTCTACCCGCCCCTGTAGATCTG)。以H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv3425基因。Rv3425基因的PCR反应产物经纯化后双酶切，克隆构建质粒。测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列(Rv3425基因登陆号BX842583.1；蛋白登陆号CAE55596.1)完全一致。
一旦获得了有关的序列，就可将验证好的重组质粒转化到宿主细胞中进行蛋白表达。
本发明中，表达重组Rv3425蛋白所用的宿主细胞可以为大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP或者BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。
本发明中，诱导表达重组Rv3425蛋白可采用多种方法，例如使用IPTG。
本发明中，分离纯化重组Rv3425蛋白亦可采用多种方法，例如使用亲和层析、离子交换层析，等等。
在本发明的一个实施例中，重组Rv3425蛋白是按如下方法获得大肠杆菌量接种于LB培养液中，200rpm，37℃过夜；移入50ml离心管内，0℃，10min，4℃离心，弃上清；收集菌体，轻轻振松菌块；缓慢加入预冷的CaCl2悬浮菌体，冰浴，同上离心弃上清。缓慢加入预冷CaCl2轻轻混匀后装在，冰浴2h。4℃保存。将鉴定好的重组质粒加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴。37℃水浴后，迅速冰浴，然后分别加入有和无相应抗生素的LB培养液，混匀后，37℃摇床30-90min。取一定量在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。从转化的平板上挑取单菌落，接种于含卡那霉素的LB培养液中，200rpm，37℃过夜。转接，离心，37℃2h孵育，加入IPTG，37℃3h；收集IPTG诱导后菌体，重悬后超声破碎。若目的蛋白存在于上清中，16,000rpm离心1h，收集上清；若目的蛋白以不溶性的包涵体形式表达，超声破菌离心后弃上清收集包涵体(此步骤可重复以得到尽可能纯的包涵体)，将包涵体溶于含尿素的Buffer中，在0℃条件下搅拌，完全溶解蛋白质，16,000rpm离心1h，收集上清。将用EDTA保存的His-Bind离子亲和柱用10倍介质体积(10V)的无菌水冲洗；5V 1×Charge Buffer结合Ni2+；10V 1×Binding Buffer冲洗；2V含目标蛋白的上清上样；10V 1×Binding Buffer冲洗；5V含30-100mMimidazole Wash Buffer冲洗；3V含200-500mM imidazole Elute Buffer洗脱；收集过柱纯化的目标蛋白，若目标蛋白存在于上清中，用5mM Tris，pH7.4溶液透析；若目标蛋白以包涵体形式存在，在变性条件下纯化得到，需将以上收集的目标蛋白分别对pH为7.4、含5mM Tris的蛋白复性缓冲液进行透析各8h，离心除去不溶性沉淀物。PEG20000对透析后的目标蛋白上清液进行浓缩。用Bradford检测法测定纯化后蛋白浓度以及高效液相色谱(HPLC)分析和质谱分析测定蛋白纯度。
本发明的另一方面，提供了重组蛋白Rv3245的应用，即将该重组蛋白用于制备检测结核病的试剂盒。
Rv3245是PPE家族第三亚族的一个成员，属于RD11。PPE家族第三亚族蛋白共有PPE domain，目前在结核分枝杆菌中的作用还不是很清楚，推测可能是抗原变异的来源。
本发明的重组蛋白用于制备检测结核病的试剂盒，可以用重组蛋白Rv3245进行免疫反应，也可以用Rv3425基因的引物对患者血液抽提物进行PCR，从而达到检测目的。
本发明提供了一种检测结核病的试剂盒，它含有重组蛋白Rv3245。
本发明的重组蛋白Rv3425不论用于检测肺结核还是肺外结核，敏感性都还比较高，也进一步证明了它是一个免疫显性的B-细胞目标抗原，有明显的诊断潜力。
本发明的试剂盒主要基于抗原抗体反应原理，例如，采用凝集反应，沉淀反应，免疫荧光技术，小吞噬试验，E花环反应，ELASA反应等。如反应结果呈阳性，则认为该待检测者患有结核。
本发明还提供了一种检测结核病的试剂盒，它含有上述重组蛋白Rv3425的特异性抗体。将待检测者体液中的蛋白进行分离，如有与重组蛋白Rv3425的特异性抗体完全相同的蛋白，即认为该待检测者患有结核。
本发明的试剂盒中，除了有重组蛋白Rv3245或者其特异性抗体，还有用于检测的各种常用试剂和器具，包括各种缓冲液、稀释液、反应终止液和反应板。在本发明的一个实施例中，结核检测试剂盒还包括如下试剂和物品(1).包被稀释液。(0.05M碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液，PH9.6)1.5gNa2CO3，2.9g NaHCO3，加双蒸水至1,000ml，调至pH9.6.
(2).封闭液。(0.1％牛血清白蛋白/PBS溶液)牛血清白蛋白(BSA)0.1克，加洗涤缓冲液至100ml(3).洗涤缓冲液。(PBST，PH7.4)NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml，调至pH7.4。
(4).样本稀释液。(PBS，PH7.4)NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，加蒸馏水至1000ml，调至pH7.4。
(5).底物缓冲液。(OPD-H2O2溶液)A液(0.1M柠檬酸溶液)柠檬酸19.2g，加蒸馏水至1,000ml。
B液(0.2M Na2HPO4溶液)；Na2HPO4·12H2O 71.7g，加蒸馏水至1,000ml。临用前取A液4.86ml与B液5.14ml混合，加入OPD 4mg，充分溶解后加入30％(v/v)的H2O250μL，即为底物应用液。
(6).终止液。(2M H2SO4溶液)蒸馏水600ml，逐滴加入浓硫酸(98％)100ml并不断搅拌。
(7).过氧化物酶标记山羊抗人IgG及IgM。(临用前1∶1000稀释)
(8).96孔酶标反应板。(Nalge Nunc International)(9).血清稀释板。
其使用方法可参见实施实例3。
图1是基因Rv3425PCR以及RT-PCR产物图。其中，1是以H37Rv基因组为模板的Rv3425PCR产物，2和3是反转录Rv3425的PCR产物，4是阴性对照。2和3是结核分枝杆菌培养时间的不同，2为培养了2周后做的，3为培养了3周后做的。
图2是蛋白Rv3425的表达纯化图。其中，5是未诱导的BL21菌株，6是诱导的BL21菌株，7是未诱导的BL21-Rv3425菌株，8是诱导的BL21-Rv3425菌株，9是未诱导的BL21-pET32aRv3425菌株，10是诱导的BL21-pET32aRv3425菌株，11是纯化的Rv3425蛋白，M是分子量标准)。
图3是蛋白Rv3425的高效液相色谱(HPLC)分析图。
图4是蛋白Rv3425的质谱分析结果图。
图5是蛋白Rv3425对健康对照，肺结核以及肺外结核病人的血清IgG反应图。其中，HC-健康对照，PTB-肺结核，Extra-PTB-肺外结核。
具体实施例方式
实施例1重组质粒pET32a-Rv3425的构建设计引物Rv3425(P上5’ACGGGATCCATGCATCCAATGATACCA；P下5’ATAAGCTTCTACCCGCCCCTGTAGATCTG)。以H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv3425基因(图1)。PCR反应条件如下98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，60℃复性60秒，72℃延伸1分，30个循环；72℃延伸10分钟。Rv3425基因的PCR反应产物经纯化后用BamH I和Hind IH酶切，克隆构建入pET32a质粒BamH I和Hind III酶切位点中。测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列(Rv3425基因登陆号BX842583.1；蛋白登陆号CAE55596.1)完全一致。
实施例2Rv3425蛋白的表达纯化大肠杆菌BL21感受态细胞制备与转化。方法如下大肠杆菌1％量接种于50ml LB培养液中，200rpm，37℃过夜；移入50ml离心管内，0℃，10min，以6000rpm，4℃离心10min，弃上清；收集菌体，轻轻振松菌块；缓慢加入10mL预冷的CaCl2(100mmol/L)悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。缓慢加入100mmol/L预冷CaCl2300μL轻轻混匀后装在1.5ml Eppendorf管中，冰浴2h。4℃保存。将1μl鉴定好的重组质粒加入到20μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴45min。中间摇动3次，以防受体菌沉底。37℃水浴5min。迅速冰浴2min，然后分别加入无相应抗生素的LB培养液800μl，混匀后，37℃摇床45min。取50μl在含卡那霉素50μg/ml的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。从转化的平板上挑取单菌落，接种于含卡那霉素50μg/ml的LB培养液中，200rpm，37℃过夜。5％转接，200rpm，37℃2h，加入IPTG，终浓度为1mM，37℃3h；收集IPTG诱导后菌体，以1×Binding Buffer重悬后超声破碎。若目的蛋白存在于上清中，16,000rpm离心1h，收集上清；若目的蛋白以不溶性的包涵体形式表达，超声破菌离心后弃上清收集包涵体(此步骤可重复以得到尽可能纯的包涵体)，将包涵体溶于含8M尿素的1×Binding Buffer中，在0℃条件下搅拌1h，完全溶解蛋白质，16,000rpm离心1h，收集上清。将用EDTA保存的His-Bind离子亲和柱用10倍介质体积(10V)的无菌水冲洗；5V 1×Charge Buffer结合Ni2+；10V 1×Binding Buffer冲洗；2V含目标蛋白的上清上样；10V 1×Binding Buffer冲洗；5V含30-100mM imidazole Wash Buffer冲洗；3V含200-500mM imidazole Elute Buffer洗脱；收集过柱纯化的目标蛋白(图2)。目标蛋白以包涵体形式存在，在变性条件下纯化得到，需将以上收集的目标蛋白分别对pH为7.4、含5mM Tris的蛋白复性缓冲液进行透析各8h，离心除去不溶性沉淀物。PEG20000对透析后的目标蛋白上清液进行浓缩。用Bradford检测法测定纯化后蛋白浓度以及高效液相色谱(HPLC)分析(图3)和质谱分析测定蛋白纯度(图4)。
实施例3重组蛋白Rv3425对健康对照，肺结核以及肺外结核病人的血清的IgG反应检测。
利用酶联免疫吸附实验间接法检测不同血清标本中抗Rv3425的IgG反应，具体步骤是96孔板用抗原Rv3425(浓度为5μg/mL)包被过夜，然后用PBST 400μL/孔洗3次板，每次3分钟，接着用1％BSA的PBS(350μL/孔)封闭37℃孵育2小时后同样用PBST 400μL/孔洗3次板，每次3分钟，然后加入1∶100稀释的待测血清(100μL/孔)37℃孵育1h，同样用PBST 400μL/孔洗5次板，每次5分钟；然后加入新鲜稀释的酶标抗体(1∶1000稀释)400ul。37℃孵育1h，然后再同样用PBST 400μL/孔洗5次板，每次5分钟。最后加入临时配制的底物(底物缓冲液是OPD-H2O2溶液，是由临用前取A液(0.1M柠檬酸溶液)4.86ml与B液(0.2M Na2HPO4溶液)5.14ml混合，加入OPD 4mg，充分溶解后加入30％(v/v)的H2O250μL配制而成。)溶液100μL，37℃30min之后加终止液(50μL)。在酶标仪上，于492nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值.以健康对照者血清标本的平均OD值加上3倍标准方差作为判断标准(目前国外的实验大多用这个标准，也有用平均OD值加上2或者2.5倍标准方差，本发明采用的是比较高的标准)，若病人血清标本OD值大于此标准，即判断为阳性，反之则为阴性。
结果表明，重组Rv3425蛋白抗原在肺结核病人中的血清IgG阳性率为70.0％，在肺外结核病人中的血清IgG阳性率为59.4％，与接种过BCG疫苗的健康对照者相比较，在检测结核病人中的特异性为100％(图5)。在检测结核病人的敏感性方面，重组Rv3425蛋白抗原相当高的。“特异性”即区分是结核病还是其他相关疾病；敏感性即是否能检测出患了结核病。本发明的重组Rv3425蛋白可以单独作为诊断试剂，也可以与现在已有的诊断抗原联合，使用提高检测结核病人的敏感性。
权利要求
1.一种重组质粒，其特征在于，将Rv3425基因插入表达质粒的多克隆位点处即得。
2.如权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所用的表达质粒为pET32a、pET30a或者pET28a。
3.一种结核杆菌相关重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是将如权利要求1所述重组质粒转化入宿主细胞而得到的。
4.如权利要求3所述蛋白，其特征在于，用于转化的宿主细胞是BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株或者BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。
5.一种如权利要求3所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；(2)Rv3425基因的扩增；(3)Rv3425基因插入表达质粒；(4)将(3)所得的重组子转化入宿主细胞中；(5)诱导表达蛋白Rv3425；(6)分离纯化(5)的产物，得到Rv3425表达蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所用的表达质粒为pET32a、pET30a或者pET28a。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所用的宿主细胞为大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP或者BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。
8.一种如权利要求3所述重组蛋白的应用，其特征在于，将该重组蛋白用于制备检测结核病的试剂盒。
9.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于，它含有如权利要求3所述的蛋白。
全文摘要
本发明属于基因工程和诊断试剂的领域。目前，结核病诊断广泛使用皮肤检测试剂一结核分支杆菌纯蛋白衍生物。然而，结核分支杆菌纯蛋白衍生物存在与环境分支杆菌以及M.novis BCG疫苗株的交叉反应，所以其诊断价值受到减弱。而且，由于BCG是一株活疫苗，可能使患者免疫系统受到损伤，因此，用结核分支杆菌纯蛋白衍生物检测，可能使免疫力低下的受检测者感染其他疾病。本发明的Rv3425特异性抗原不论在检测肺结核还是肺外结核，敏感性都比较高，是一个免疫显性的B－细胞目标抗原，用于制备结核病检测试剂盒，敏感性高效并且安全可靠。
文档编号C12N1/21GK1888069SQ20061002890
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者王洪海, 张红梅, 王九玲, 雷建强, 张旻, 杨燕萍 申请人:复旦大学