专利名称：一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法
技术领域：
本发明涉及植物乳杆菌，特别是一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法。
背景技术：
乳酸菌是人体肠道中最重要的益生菌，其数量和组成对维持健康肠道环境和提高免疫功能起着关键作用。其主要作用在于可抑制有害菌群、维持肠道菌群平衡、保护肠粘膜屏障、代谢产生有机酸，降低肠道pH，促进肠道蠕动，腹泻便秘双重调节。
乳酸菌在生产、保存及被服用过程中，都会面临各种环境压力，包括温度、酸、渗透压、氧、高压及饥饿等恶劣条件的影响。这些因素都会影响菌的存活，从而影响其生理活性。虽然乳酸菌自身具有较强的耐酸性，大多数能在pH3的条件下生长，但在pH3以下的条件下就表现出敏感性，而且随着酸度的进一步增加，死亡率会急剧上升。因此提高乳酸菌对环境酸压力的耐受能力具有十分重要的现实意义。
目前，国内外对乳酸菌耐酸能力的提高方法主要集中在耐酸菌株的筛选上。江川等采用模拟人体胃酸环境(pH＝3)方法从104株人胃肠道源乳杆菌中筛选得到3株具有较强耐酸性能菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法，它将为乳酸菌耐酸性提高提供一个具现实意义的方法，从而提高产品品质，延长产品货架寿命。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于该植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-Onlly，在发酵培养基中添加弱酸或弱酸盐以提高植物乳杆菌细胞耐酸性。
该植物乳杆菌已于2004年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC(地址中国北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，并收到保藏登记号CGMCC NO 1258。其分类命名为植物乳杆菌，拉丁名Lactobacillusplantarum。植物乳杆菌LP-Onlly，其16S rRNA基因GeneBank(NCBI)序列登录号为AY590777。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20～80mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入50mmol/L乙酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10～20mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10mmol/L丙酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10～20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20mmol/L正丁酸。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20～80mmol/L乙酸钾。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入50mmol/L乙酸钾。
所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入2mmol/L柠檬酸钾或3mmol/L三聚磷酸钾。
图1是本发明方法中乙酸对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
图2是本发明方法中丙酸对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
图3是本发明方法中正丁酸对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
图4是本发明方法中乙酸钾对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
图5是本发明方法中柠檬酸钾对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
图6是本发明方法中三聚磷酸钾对植物乳杆菌耐酸性的影响情况示意图。
具体实施例方式本发明提供了一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法，主要技术方案就是在发酵培养基中添加弱酸或弱酸盐以提高植物乳杆菌细胞耐酸性。具体情况详叙如下1.菌种植物乳杆菌LP-Onlly(Lactobacillus plantarum LP-Onlly)，为上海交大昂立股份有限公司研究院从健康婴儿粪便中分离、鉴定并保存。
2.培养基包括斜面培养基、种子培养基及发酵培养基均为MRS培养基。
3.培养方法一级种子培养从斜面培养基上挑二环菌至种子培养液中，50ml三角瓶装液30ml，37℃培养16h。二级种子培养将一级种子液以万分之一的接种量接入种子培养液中，50ml三角瓶装液30ml，37℃培养16h。发酵培养将二级种子液以万分之一的接种量接入发酵培养液中，50ml三角瓶装液30ml，37℃培养16h。
4.分析方法
(1)耐酸性能评价方法将发酵细胞以生理盐水洗涤两次后于pH2、37℃下90min，测细胞残存率。
(2)活菌计数方法参见GB/T 4789.35-2003(乳酸菌饮料中的乳酸菌检验)。
实施例1在发酵培养基中加入乙酸。
如图1所示乙酸浓度(10mmol/L)对细胞耐酸性能较对照没有提高；而乙酸浓度从10mmol/L增加到50mmol/L时，细胞耐酸性较对照就有了非常大的提高，在pH2、37℃下90min细胞残存率约提高200倍；进一步增加乙酸浓度(从50mmol/L增加到80mmol/L)细胞耐酸性明显降低，但较对照也有较大提高。
实施例2在发酵培养基中加入丙酸。
如图2所示10mmol/L的丙酸浓度可使细胞耐酸性能得到较大提高，在pH2、37℃下90min细胞残存率较对照约提高90倍；丙酸浓度从10mmol/L增加到20mmol/L时，细胞耐酸性基本一致；进一步增加丙酸浓度(从20mmol/L增加到50mmol/L)细胞耐酸性急剧降低，此时，与对照相当。
实施例3在发酵培养基中加入正丁酸。
如图3所示10mmol/L的正丁酸浓度使细胞耐酸性能得到较大提高，在pH2、37℃下90min，细胞残存率较对照约提高120倍；进一步增加正丁酸浓度(从10mmol/L增加到20mmol/L)，细胞耐酸性进一步提高，在pH2、37℃下90min，细胞残存率较对照约提高200倍；再增加正丁酸浓度(从20mmol/L增加到50mmol/L)，细胞耐酸性急剧降低，此时，与对照相当。
实施例4在发酵培养基中加入乙酸钾。
如图4所示乙酸钾浓度(10mmol/L)对细胞耐酸性能较对照没有提高；而乙酸浓度从10mmol/L增加到50mmol/L时，细胞耐酸性较对照有非常大的提高，在pH2、37℃下90min细胞残存率约提高200倍；进一步增加乙酸浓度(从50mmol/L增加到80mmol/L)细胞耐酸性明显降低，但较对照也有较大提高。
实施例5在发酵培养基中加入柠檬酸钾。
如图5所示2mmol/L的柠檬酸钾浓度可使细胞耐酸性能得到较大提高，在pH2、37℃下90min细胞残存率较对照约提高100倍；柠檬酸钾浓度从2mmol/L增加到5mmol/L时，细胞耐酸性急剧降低；进一步增加柠檬酸钾浓度(从5mmol/L增加到10mmol/L)，细胞耐酸性基本一致，但较对照略有提高。
实施例6在发酵培养基中加入三聚磷酸钾。
如图6所示1mmol/L的三聚磷酸钾浓度对细胞耐酸性能较对照没有提高；而三聚磷酸钾浓度从1mmol/L增加到3mmol/L时，细胞耐酸性较对照有些提高，在pH2、37℃下90min细胞残存率约提高5倍；三聚磷酸钾浓度从3mmol/L增加到5mmol/L时，细胞耐酸性降低，此时，与对照相当。
本发明方法的作用原理是乳酸菌耐酸是因为其自身可维持细胞内外的pH梯度，使细胞内的pH不至于太低，但当内部的pH下降到超过一定的阈值，细胞功能将被抑制，从而导致细胞死亡。
众所周知，当细胞进入稳定期时，60个以上与细胞稳定性密切相关的基因在RpoS基因编码产生σs蛋白控制下诱导启动，因此，稳定期细胞耐热和耐酸等性能主要取决于σs浓度，而σs浓度可通过提高RpoS转录水平或rpos mRNA翻译水平或防止σs蛋白水解等手段来提高。研究表明，cAMP-CRP、UDP-glucose、EIIA、多磷酸盐(polyphosphate)、ppGpp、HSL、电离度为4.8～4.9的弱酸盐(如醋酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐等)、谷氨酸钠、海藻糖及胞内NADH向NAD的转化率均可提高RpoS的转录水平；而细胞向高渗或酸性pH转换、低温、生长达到一定细胞密度、一些蛋白如Hfq、HU、DksA、RprA等均可促进rpos mRNA翻译；突然的碳饥饿、渗透压提高、酸性pH转换、热冲击(如从30℃升至42℃ 20min)产生的热激蛋白如DnaK、DnaJ、GrpE均可使σs稳定；RssB-CIpXP途径中的CIpXP蛋白酶负责σs水解，而Crl蛋白可促进σs和RNA聚合酶的核心酶(E)结合，使σs避免与RssB结合被水解，从而提高σs活性。因此，可通过上述手段提高细胞内σs浓度，从而提高细胞耐酸性。
本发明方法通过在发酵培养基中添加弱酸(乙酸、丙酸及正丁酸)或弱酸盐(乙酸钾、柠檬酸钾及三聚磷酸钾)均可不同程度地提高植物乳杆菌细胞耐酸性；另外，乙酸和乙酸盐对植物乳杆菌耐酸性提高作用基本一致，这表明弱酸盐对细胞耐酸性的影响是通过其弱酸起作用的，而与其金属离子没有什么关系。本发明方法将为乳酸菌耐酸性提高提供一个具现实意义的方法，从而提高产品品质，延长产品货架寿命。
权利要求
1.一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于该植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-Onlly，在发酵培养基中添加弱酸或弱酸盐以提高植物乳杆菌细胞的耐酸性能。
2.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20～80mmol/L乙酸。
3.根据权利要求2所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入50mmol/L乙酸。
4.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10～20mmol/L丙酸。
5.根据权利要求4所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10mmol/L丙酸。
6.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入10～20mmol/L正丁酸。
7.根据权利要求6所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20mmol/L正丁酸。
8.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入20～80mmol/L乙酸钾。
9.根据权利要求8所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入50mmol/L乙酸钾。
10.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌耐酸性的方法，其特征在于在发酵培养基中加入2mmol/L柠檬酸钾或3mmol/L三聚磷酸钾。
全文摘要
本发明涉及植物乳杆菌，特别是一种提高植物乳杆菌耐酸性的方法。该方法中的植物乳杆菌为植物乳杆菌LP－Onlly，在发酵培养基中添加弱酸或弱酸盐以提高植物乳杆菌细胞耐酸性。本发明将为乳酸菌耐酸性能提高提供一个具现实意义的方法，从而提高产品品质，延长产品货架寿命。
文档编号C12N1/36GK1935981SQ200610028708
公开日2007年3月28日 申请日期2006年7月7日 优先权日2006年7月7日
发明者兰先德, 范小兵, 张和春, 杭晓敏, 潘玉辉, 杨国, 倪新华, 王劲松 申请人:上海交大昂立股份有限公司