专利名称：装置的制作方法
装置本发明涉及细胞和组织培养领域。具体地，本发明提供用于器官型培 养的新型装置。组织培养是先体外再体内地维持源自动物或植物生物体器官或组织的 细胞。几十年来，已经开发和改良了组织培养的方法。10 培养从植物或动物器官或组织直接获得的细胞称为原代培养。按照原代培养的方法，将器官外植体置于合适的无菌培养基中，其中所述无菌培 养基是装在被提供具有合适组成的无菌空气的合适的培养容器中的，由此 细胞从所述外植体的边缘生长。原代培养的另一种方法是通过酶和/或机械 处理解离器官或组织细胞，并且在如上所述的适合环境中培养解离的细15 胞。动物细胞原代培养的一个缺点是细胞仅具有有限的寿命。原代培养中 的细胞可以经历细胞分裂，但它们在经历被称为衰老的细胞死亡形式前， 通常仅进行有限次数的分裂。基于外植体的动物细胞原代培养的另一个缺 点是培养的细胞通常丧失许多源器官细胞的典型体内特征，除非进行特殊20的步骤从而阻止所述特征的丧失。基于外植体或基于解离细胞的原代培养 过程中的体内特征的丧失，和无限增殖细胞系的出现对生物和医药研究以 及产品幵发具有重要的蕴涵，其原因在于它意味着原代细胞培养不能准确 预测体内应答。作为结果，必须在完整动物体内进行许多生物检验，从而 评估候选药物的安全性和功效。所述在完整动物中的检验很昂贵，这导致25 更高的卫生保健成本，并且该检验会损害动物的健康。因此，多年来，存 在着相对大的开发更准确预测体内应答的体外检验的动力。器官培养是先体外再体内地维持动物器官的整体或部分，其发生在将器官的生命和功能维持一段时期的条件下。例如，存在培养肝脏(Wicks W.， 1968)，心脏(WildenthalK., 1971)和肠(CorradinoR.， 1973)的确定程序。器30官培养具有超越基于外植体原代细胞培养和细胞系的重要优点，在于其中维持了该器官大部分或全部生理性质。然而，器官培养的通量受到从宿主 手术摘除器官和建立培养体系所必需的操作的限制。此外，从每个供体动 物仅能获得一个，二个或很少的培养。这些限制致使器官培养对于药物筛选和药靶筛选，以及许多在生物学研究中的其他应用来说，太过缓慢和昂c 虫 5 贝c在组织培养领域中的一个重要进展是引入器官和组织切片的器官型 培养方法。在切片保持其源器官的细胞组成，形态学和所述生理性质的条件下培养动物器官的薄切片(50-500um)。培养器官切片的条件对完成器 官型培养是至关重要的。将器官切片培养在多孔膜的上表面上，并从所述io多孔膜的下表面供给营养，由此该器官切片不完全浸没，而是仅仅被一薄 层培养基所覆盖(StoppiniL.等，1991)。用于吸收氧气和去除二氧化碳的气体向所述切片的传送，比在按照外 植体培养的方法将切片完全浸没在培养基中时更有效得多。另外，器官型 切片培养不具有与上述基于外植体和基于解离细胞原代培养有关的缺点。15基于相同的原理，存在着许多其他组织切片的器官型培养实例。器官型切片培养显著地比器官培养更快且更灵活，但是它对于药物发 现所需的大规模筛选仍然太缓慢且昂贵。为从动物解剖器官或处理手术后 人类材料的所使用的程序是劳动密集的，且在大多数实验室中仅可能平行 地进行数10个培养。对于药物筛选，平行地提供几千、几万或几十万个20培养将更加有效。因此，器官型培养的理想方法将是一种基于来自特殊器 官的解离细胞或小的细胞团快，但容许真正的器官型培养的方法。令人惊讶地，已经发现有可能通过压縮位于膜上的解离细胞或小的细 胞团快(微外植体或外植体)，从它们产生器官型培养。所述膜的对侧按 照StoppiniL.等.1991所教导的方式供给营养。在本申请人的同时待审的25题为"方法"的申请中描述了利用解离细胞或微外植体产生器官型培养的 方法，所述题为"方法"的申请于2005年6月15日在英国提交 (GB0512214.8)，并且于2006年6月15日国际提交，将其引入本文作为参 考。源自解离细胞或微外植体的器官型切片培养和器官型培养的一个方 30面是将切片或压缩的细胞置于多孔膜上，并从该多孔膜的对侧提供液体营养培养基，从而组织或细胞培养位于该气液分界面处。目前存在着满足这些要求的装置。例如，由Millipore Corporation制造的具有Biopore膜的 Millicell-CM插入物，其由密封于聚苯乙烯支架的多孔膜组成。将顶上覆 盖有所述膜的聚苯乙烯支架置于装有液体培养基的Petri培养皿中，由此 5所述膜的下表面与液体培养基接触，并将所述器官切片置于多孔膜的上表 面上(见Millipore技术指示062)。然而，在现有技术中的用于器官型培养的装置具有大量的缺点，且不 为器官型培养提供最适条件。例如，目前存在的装置，在将细胞团加入到 多孔膜后，不容许向多孔膜的与细胞团相对的一侧加入培养基，也不容许io改变培养基。能够分别指定供给每种培养的培养基和独立地改变每种培养 基，对于评估培养基改变对该培养的作用应该是有用的。所述培养基改变 需要在不使多孔膜表面上的器官型培养在流体静压方面显著改变的条件 下进行，其原因在于该改变诱导细胞培养中的伸长和应力应答，而所述伸 长和应力应答可以混淆生物检验的结果。此外，目前存在的装置不容许高15通量，即它们不能用于平行地产生、维持和筛选多个器官型培养。因此存在着对制备和保持器官型培养的装置的需要，该装置被设计用 于在不使器官型培养受到不必要的应力影响下便于培养基的改变，并且被 设计用于便于高通量生产和筛选器官型培养。20 发明概述按照本发明的第一方面，提供了一种用于器官型培养的装置，所述装置包括导管，其具有一个开口末端和一个由与其横跨烙合(fused across)的多 孔膜封闭的末端；和 25 框架，其保持所述导管处于基本垂直的方向；其中所述导管适合于通过毛细作用容许将充足体积的液体培养基保 留在所述导管中从而与所述多孔膜表面接触，并由此向可以在所述多孔膜 上生长的细胞供给营养。在器官型培养过程中，在位于所述导管一个末端的多孔膜表面上维持 30该培养。本发明的一个关键特征是将所述导管设计为这样在器官型培养过程中，毛细作用力维持与所述细胞培养对侧的多孔膜表面，即所述导管 中的膜表面和培养基之间的接触。毛细作用力应用于维持导管中培养基允许通过吸移步骤移除或替换 培养基。当供给培养基时，应该使吸移管的尖端位于可实施的最靠近膜表 5面的位置。优选地，所述导管适合于这样当所述装置处于竖立或倒置位置时， 其通过毛细作用保持充足体积的液体培养基，从而维持所述导管内的多孔 膜表面和培养基之间的接触。所述导管在本文中可以称为培养基导管。通过竖立位置意指框架保持导管基本上垂直，其由多孔膜密封的末端 10位于最上方，由此当使用该装置时，所述器官型培养在该膜的上表面上生 长。通过倒置位置意指框架保持导管基本上垂直，其开口末端位于最上方 且由多孔膜封闭的末端位于最下方，由此当使用该装置时，所述器官型培 养位于该膜的下表面中。与本领域中存在的装置相反，本发明的装置由此 容许孵育器官型培养并用处于竖立或倒置位置的装置改变用于器官型培 15养的培养基。这种在培养和装置方向中的灵活性意味着具有面向上的物镜 镜头的显微镜或具有面向下的物镜镜头的显微镜均可互换地用于研究该 培养，并且液体输送装置可以用于任何方向，以添加或去除培养基。优选地，所述导管是圆柱体。所述导管还可以是矩形或不对称横截面 的。这样选择所述导管的精确尺寸和组成，使得在器官型培养过程中，其 20通过毛细作用保持充足体积的液体培养基，以维持导管内多孔膜表面和培 养基之间的接触，优选地无论所述装置是处于竖立和倒置的位置。保持的 液体体积是充足的，从而在使用中，在无需不合理地常常更换培养基的条 件下，向器官型培养供给足量的营养。毛细作用依赖于若干参数。毛细作用力是圆柱形管直径和矩形截面导25管宽度(width)或宽度(breadth)的反函数。对水性溶液的毛细作用力还依赖于受该力控制的溶液的表面张力，其中所述力可以通过在溶液中存在 表面活性剂如清洁剂来减弱。毛细作用受到液体分子和表面分子之间吸引 力强度的影响。在水性液体的情形中，毛细作用受到导管表面亲水性程度 的影响。影响液体培养基在导管中保留的另一个因素是培养基的体积。因30 此需要考虑这些因素，从而确保本发明的装置可以通过毛细作用保持一定体积的液体培养基与多孔膜表面接触。在本发明的装置中，两种不同的毛细作用力作用，从而保持导管中的 液体培养基与多孔膜接触。 一种力是通过液体培养基和所述管之间的吸引力所施加的毛细作用力。另一种力是通过液体培养基和所述膜的孔壁之间 5的吸引力所施加的。如果其足够强，则前者将会抵消重力，从而在不考虑 竖立或倒置的前提下，保持导管中的液体，并且后者将会保持该液体与所 述膜接触。在某个阈值，培养基上的重力将会超过毛细作用力，且不受其 他力控制的培养基将会从导管中落下。当导管是圆柱体时，保持在该圆柱 体中的液体的质量和由此从该圆柱体中移除所述液体所作用的重力与该 10圆柱体半径的平方成正比，而保持该圆柱体中液体所作用的毛细作用力与 半径成反比。因此，对于给定的液体和圆柱体长度，存在着最大半径，如 果超过该最大半径，将不能对抗重力而保持圆柱体中的液体，其中所述圆 柱体的表面组成是给定的，但是不存在比其低时将不对抗重力而保持液体 的最小半径。15 优选地，所述导管是圆柱体，其具有0.5cm或更小的半径，优选地，0.3cm或更小，优选地，0.25cm， 0.2cm， 0.15cm或更小。优选地，所述 圆柱体具有约0.3cm， 0.15cm或0.075cm的半径。已经发现具有0.5cm或 更小半径的圆柱形导管适合于维持lcm柱的标准液体培养基，如 Dnlbecco's极限必需培养基，与导管中多孔膜的表面的接触，这无需考虑20 该装置是处于竖立或倒置的位置。优选地，所述优选为圆柱体的导管，长 度约为lcm，从而容许其保持lcm的液体柱。优选地，所述导管在长度上 稍微大于lcm，优选地，长度约为l.lcm或1.2cm。优选地，所述导管由亲水性材料制成，优选地是亲水性聚合物，从而 当液体培养基处于所述导管中时，增加对其施加的毛细作用力。亲水性聚25合物己为本领域技术人员所已知。可以进一步增强制造导管的聚合物的亲 水性，例如，通过包含聚乙二醇基。本发明不受具有小于0.5cm的半径的圆柱体的限制，原因在于在技术 人员能力范围内，可以很好地确定可以用于所述装置的其他导管的尺寸。 特别地，技术人员应该能够计算施加于不同尺寸导管中给定体积的液体培30养基上的毛细作用力和重力，并从而确定哪种导管尺寸应该用于所述装置，以确保毛细作用力超过重力，从而将该液体保持在导管中。此外，导管中可以包括将縮颈(constrictkm)、平台或其它障碍，从而增加对从导管中移除培养基所作用的重力的对抗。按照拉普拉斯-开尔文(Laplace-kelvin)方程， 5 毛细作用力二表面张力/(Rl-R2)，其中Rl二以cm为单位的管或孔的半径(在该情形中是导管)，且R2 二与管或孔壁相接触的弯液层的厚度。1达因是在lcm秒—2时加速1克所需要的力。除非包括表面活性剂如 清洁剂，水性培养基的表面张力是约73达因cm—2。将清洁剂引入培养基 io中不是惯例操作，但是蛋白质也可以影响表面张力，且培养基中，特别是 血清形式的培养基中通常包括蛋白质。通常，液体培养基的表面张力是至 少50达因cm—2。施加于给定体积液体培养基上的总重力是98 x (以cm3 为单位的体积)达因。当为了本发明的目的计算毛细作用力时，通常无需 考虑弯液层的厚度(R2)。当R2很小时，它对毛细作用力的作用可以忽略， 15且随着R2接近R1，毛细作用力变得更大。由于为了本发明的目的，对于 给定的导管和水性培养基，仅需要确定是否达到了最小毛细作用力的要 求，所以R2的测量是不必要的。然而，如果需要更精确地计算毛细作用 力，测量R2当然是可能的。对于长lcm和半径0.5cm的圆柱体，应该由此要求至少为77达因的 20总毛细作用力，从而在倒置时，通过毛细作用对抗重力并维持导管中表面 张力为50达因cm—2的lcm的液体柱。如果该圆柱体表面的亲水性足够高， 则所述毛细作用力可以对该液体柱施加大于IOO达因的力。对于长lcm和半径0.3cm的圆柱体，应该因此要求至少为28达因的 总毛细作用力，从而在倒置时，对抗重力和维持导管中表面张力为50达 25因cm—2的lcm的液体柱。如果该圆柱体表面的亲水性足够高，则所述毛 细作用力可以对该液体柱施加大于170达因的力。只要不移动或振动所述装置，当倒置时，这些毛细作用力足够保持所 述液体柱，其原因在于由移动或振动所引起的加速改变所述液体柱的动 量，并可以克服控制力。优选地，导管的尺寸是这样的，即合理的动量改 30变，如可以由标准手工或机器人操作所导致的动量改变，不引起从导管中损失液体。优选地，这样选择导管的尺寸，即为在多孔膜表面保持给定体积的液 体培养基的所作用的毛细作用力是为释放该培养基的所作用的重力的至少6倍。已经发现是所述重力6倍的毛细作用力足以确保在标准操作下，5液体培养基在所述装置导管中的保留，甚至是当该培养基含有减小该培养 基表面张力的蛋白质成分，如血清中的那些蛋白质时。优选地，所述多孔膜通过胶粘，通过热封或通过超声焊接与导管的一 个末端横跨熔合。按照拉普拉斯-开尔文方程(见上)，多孔膜向导管中的 液体施加毛细作用力，其依赖于该膜中的孔的半径和表面成分。由该膜施 10加的毛细作用力应该足以浸湿该膜并保持液体与膜的接触。优选地，本发明的装置中的多孔膜包括具有尺寸 0.4Pm的孔。适合 用于本发明装置的膜包括但不限于由Millipore Corporation生产的光学透 明的亲水性聚四氟乙烯(PTEE，也已知为DuPont商标Teflon )膜，由 聚碳酸酯，PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)，或An叩oreTM (无机氧化铝，15Whatman Corp的商标)制成的膜。优选地，所述多孔膜是光学透明的。这个特征使该测试培养能够在所 有时刻接受显微镜检验和取样，以进行生化测定。优选地，所述多孔膜在 用于激发的波长处，通常在400-750nm的范围内产生低背景荧光。优选地， 所述多孔膜由亲水性聚四氟乙烯(PTEE)膜组成。20 优选地，所述框架保持导管处于垂直的方向，这样由所述膜封闭的导管末端或导管的开口末端均不与任何表面接触。优选地，所述装置进一步 包括密封圈，其确保将所述框架坚固地保持为与导管接触。优选地，所述 装置包括两个所述密封圈。所述装置可以进一步包括另外的工具，以确保 将所述框架坚固地保持为与导管接触，因此当倒置时不释放该导管。所述25另外的工具可以包括，例如，摩擦工具，如框架和导管之间的弹簧。优选地，所述装置进一步包括腔室，其围绕导管的开口末端。所述腔 室可以形成保持导管处于垂直方向的框架的一部分。当使用所述装置时， 该腔室容纳具有合适气体组成的空气，其与导管中的培养基接触，从而维 持该培养基中的最佳酸度和氧气水平。优选地，该腔室是密封的，以确保30在使用过程中液体培养基不暴露于外界空气。所述腔室可以进一步包括气体入口和气体出口，以容许控制腔室内的空气条件。优选地，所述密封的腔室进一步包括容许改变培养基的开口。优选地， 将所述开口设计为在改变培养基时，最小化培养基向空气的暴露。所述开 口可以通过隔膜或阀密封，所述隔膜或阀一般是密封的，但可以被吸移管 5尖端穿透，从而取出培养基并引入新的培养基。所述隔膜可以由橡胶或氯 丁橡胶制成。所述开口可以用于将特殊成分，如生长因子或抗生素或毒素， 引入到现存培养基中，而不是完全地改变培养基。优选地，所述吸移步 骤是在不使所述培养在流体静压方面显著改变的条件下进行的。对手工和机器人吸移构造领域中的技术人员应该显而易见的是，为了 10从导管中取出液体，必须施加比将液体保持在导管中的压力更大的负压。 避免吸移管尖端对多孔膜的破坏应该是很重要的，且由于这个原因，所述 吸移管尖端不应该前移到与所述膜接触。因此，可能不能通过单一的吸移 管尖端从导管移除全部的液体培养基。液体可能被保留在导管中，其保留 在吸移管尖端到达的最远端和所述膜之间的导管区域内。所述液体通过毛 15细作用力在导管中的滞留很可能与非常小的圆柱体半径有直接关系，尽管 其还依赖于吸移管尖端和液体的精确特性。如果确实发生液体滞留，则在 大多数情形中，它不会影响该培养物的健康。然而，在一些情形中，例如如果测试该培养物暴露于毒素物质，液体 的滞留可以潜在地影响试验数据。在这个情形中，液体的移除和用新鲜液 20 体的替换的吸移步骤可以重复必要多次，从而通过稀释去除毒素物质。例 如，如果所述圆柱体是lcm长，且吸移管尖端可以安全地前移到距所述膜 O.lcm的范围内，则最多可在该圆柱体中保留体积的10%。向该全部lcm 的长度加入新鲜液体会将毒素稀释到其初始浓度的10%。重复该过程的会 将毒素稀释到其初始浓度的1%。吸移步骤的时间规划应该考虑对容许毒25素平衡，从而最大化由稀释引起的去除功效的需要。优选地，所述装置进一步包括一个或多个导管，优选地为可除去的导 管，以容纳被重力场压縮前或过程中的细胞，所述导管或可除去的导管位 于所述膜的与装有培养基的导管的对侧上。该实施方案的装置容许同时进 行通过离心压縮细胞和将细胞输送到所述表面。提供导管，以保持细胞悬30 液处于正确的方向，所述正确的方向是就用于受重力场压縮的表面而言的。最佳方向是所述表面从最小重力场强度的位点远离细胞悬液。在离心 机中产生的重力场的情形中，与所述细胞悬液相比，将所述表面置于远离 该离心机转子旋转轴。优选地，在所述导管和表面的连接处提供了在表面 和与该表面相邻的导管边缘之间的密封垫，从而确保将细胞有效率地输送 5 到所述表面，且不从导管中损失。利用离心法压缩细胞后，在多孔膜的与 为容纳细胞悬液所提供的导管相对的一侧上，将液体培养基输送到为容纳 该培养基所提供的导管中。再通过毛细作用对细胞进行进一步的压縮。本 文中，将容纳细胞悬液的导管称为细胞悬液成对物，且将容纳液体培养基 的导管称为培养基导管。在压縮之前和过程中使用多于一个细胞悬液导10管，允许在与每个培养基导管接触的膜区域内的不同位点建立多于一个的 培养。如果细胞悬液导管不是可除去的，则它们可以通过胶粘或通过热封 或通过超声焊接与多孔膜永久地密封。如果细胞悬液导管是可除去的，则 它们与多孔膜非永久地密封。非永久密封垫的实例包括定形的边缘，其集 中压力和硅橡胶以及其他可压縮物质，所述硅橡胶以及其他可压縮物质可 以组成导管的全部或导管的密封垫边缘。那些熟悉离心法的人应该理解重 力场对包含靠近多孔膜的导管的装置的应用会将密封垫边缘向多孔膜按 压，其中所述靠近多孔膜的导管是就离心转子的旋转轴而言的。在可除去 的导管的情形中，这提高所述密封边缘的密封特性。在设计在重力场中使 用的装置的领域中的那些技术人员应该理解承重表面必须通过足够强度 的结构来支持，从而避免损坏。例如，本发明的多孔膜即使在弱重力场中， 不具有用于在不损坏该多孔膜的条件下，支持导管的足够强度。因此，已 经采取了一些步骤，其用于确保本发明的导管在所述装置的框架中受到足 够强度的结构的支持。如果在导管和多孔膜之间使用可压縮的密封垫，则 在所有情形中重力场影响下的压縮程度受到在所述装置框架中导管和足 够强度结构间的接触的限制。这些考虑对于设计用于重力场中的装置领域 中的那些技术人员是显而易见的。因此，本发明优选地包括细胞悬液导管，其具有一个开口末端和一个 被所述多孔膜表面封闭的末端，其中所述多孔膜的表面是密封于多孔膜的 与培养基导管的对侧。所述框架优选地保持培养基导管和细胞悬液导管处 于基本垂直的方向。优选地，所述装置进一步包括盖子，其覆盖导管外的多孔膜表面。该 盖子覆盖这样的多孔膜表面，即当使用所述装置时培养物位于所述多孔膜 表面上。当所述装置包括盖子时，所述腔室和框架优选地包括额外的端口， 以容许气体在腔室和盖子所围绕的膜上方的空间之间流动，这容许了在超 5过几周或更长的时期内控制培养物周围的空气。本发明第一方面的装置优选地适合用于高通量方法中，该方法涉及同 时制备和维持多个器官型培养。因此按照本发明的第二方面，提供了用于 高通量器官型培养的装置，其包括多个按照本发明第一方面的装置。优选地，用于高通量器官型培养的装置包括96,384， 1536或更多个按照本发明io第一方面的装置。本发明第二方面的装置可以由此含有数千个培养基导管，及在一些实施方案中数千个细胞悬液导管，且可以独立地用培养基供给每个培养基导管，且为此可以独立地改变培养基。优选地，通过上述多通道吸移管或机器人进行培养基的改变。 15 优选地，所述高通量装置包括单一的盖子，其覆盖所述装置中所有的独立导管。优选地，在所述高通量装置中的包围每个培养基导管开口末端的腔室 通过幵口连接，这容许气体在所述腔室间流动，由此可以通过在所述高通 量装置中单一的气流入口和出口控制流到所述装置中所有腔室中的气体。20 可以将所述高通量装置中的多个装置装配为单一单位。备选地，可以以按照本发明第一方面的独立装置提供所述高通量装置，每个所述独立装 置含有单一的培养基导管及在一些实施方案中一个或多个永久的或可除去的细胞悬液导管，所述导管可以由使用者装配到含有所需数量的导管的 高通量装置中。还可以以按照本发明第一方面的单独装置的条带提供所述25 高通量装置，例如，在2，4,8,或12组中，任选地，可以由使用者将其装 配到含有所需数量的导管的高通量装置中。尽管其不用于器官型培养，包 含条带的高通量装置在细胞培养领域中时众所周知的，其中所述条带含有 固定数量的孔。Dynatech在Thome A. (1979)的美国专利4,154,795中描述了这种类型的多孔装置。30 优选地，对于高通量装置，该装置的总尺寸和该装置中单独导管的位置应该与标准微滴定板匹配，从而允许将为标准微滴定板设计的机器人技 术使用于该装置。例如，按照本发明的第一方面，在包括96个装置的高通量装置中，优选地，将所述装置安排为8X12个装置的列阵，其类似于 标准96孔微滴定板。优选地，在所述由96个装置组成的高通量装置中的 5导管是圆柱体。优选地，每个包括培养基导管的圆柱体具有约0.3cm的半 径，其为标准96孔微滴定板中的孔的半径。已经在上文描述了作用于这 样的圆柱体的毛细作用和重力。所述细胞悬液导管的尺寸不受保持液体的 需要的限制，所述液体的保持是通过多抗重力的毛细作用实现的，原因在 于它们总是在最大重力场强度的位置与多孔膜一起使用。优选地，可以简io 单地通过为标准微滴定板设计的吸引装置来填充和抽吸每个包括细胞悬 液成对物的圆柱体。例如如果所述装置对于每个培养基导管含有一个细胞 悬液导管，且存在96个培养基导管，则每个细胞悬液导管的轴应该最佳 地与培养基导管的轴共线，所述培养基导管直接相反地位于多孔膜的对 侦IJ。如果所述装置对96个培养基导管中的每一个含有四个细胞悬液导管，15则所述细胞悬液导管的间隔应该等于384孔微滴定板的孔。如果所述装置 对96个培养基导管中的每一个含有16个细胞悬液导管，则所述细胞悬液 导管的间隔应该等于1536孔微滴定板的孔。每个细胞悬液导管的半径应 该足够大于合适的吸移管尖端或吸移针的半径，从而容许方便的吸移。 在包括384个按照本发明的第一方面的装置的高通量装置中，每个装20置中的培养基导管优选地是圆柱体，且所述圆柱体的半径优选地是约 0.15cm，即标准384孔微滴定板的孔半径。同样lcm长的该圆柱体中的液 体的重量仅仅是具有圆柱体直径0.3cm的相应重量的25% ，但是与上述较 大的圆柱体相比，其毛细作用力加倍。在包括1536个按照本发明的第一 方面的装置的高通量装置中，每个装置中的培养基导管优选地是圆柱体，25 且所述圆柱体的半径优选地是约0.075cm，即标准1536孔微滴定板的孔半 径。在这种情形中，同样lcm长的该圆柱体中的液体的重量仅仅是具有圆 柱体直径0.3cm的相应重量的6.25M，但是其毛细作用力高4倍。在包括 96， 384或1536个培养基导管的高通量装置中，其中对于每个培养基导管 可以有一个或多个细胞悬液导管，所述细胞悬液导管的数量和位置仅受使30用用于高通量吸移的合适器械的能力的限制。因此，按照本发明标准微滴定板总尺寸制成的96， 384或1536个培养基导管的装置都将液体保持在 处于倒置位置的培养基导管中，且都可以包含永久和可除去的细胞悬液导管。现在通过实施例，将详细描述本发明的多种方面和实施方案。应该理5 解可以进行不偏离本发明范围的细节修改。 附图简述
图1显示按照本发明第一方面的装置的横截面，其不具有细胞悬液导管。io 图2显示按照本发明第一方面的装置的横截面，其具有细胞悬液导管。图3显示按照本发明第二方面用于器官型培养的高通量装置的横截 面，其不具有细胞悬液导管。图4显示高通量装置和用于高通量装置的可除去的导管的横截面，其 包括4个用于在压缩之前和过程中容纳细胞的导管/孔。 15 图5显示按照本发明第一方面用于器官型培养的改良装置的横截面，其具有保持所述导管处于适当的位置的额外组件。实施例如图1中所示，本发明优选的装置包括作为培养基导管的圆柱体和通20过胶粘或热封或超声焊接于所述圆柱体的一个末端的多孔膜，以及框架， 该框架保持圆柱体垂直，并创造围绕所述圆柱体开口末端的腔室。所述圆柱体含有一定体积的液体培养基，其通过毛细作用保持在该圆 柱体中，由此它与所述多孔膜的下表面接触。显示所述体积的液体培养基 的液体弯液层。25 如图2中所示，本发明进一步优选的装置包括作为培养基导管的圆柱体和通过胶粘或热封或超声焊接于所述圆柱体的一个末端的多孔膜，和作 为细胞悬液导管的另一个圆柱体，其密封于所述多孔膜的与所述培养基导 管相对的一侧，以及框架，所述框架保持所述圆柱体垂直，并创造围绕所 述培养基导管圆柱体的开口末端的腔室。30 所述细胞悬液导管圆柱体在通过离心压縮之前或过程中容纳细胞悬液。显示了在离心后获得的细胞团。离心后，所述培养基导管容纳一定体 积的液体培养基，其通过毛细作用保持在圆柱体内，由此它与多孔膜的下 表面接触。显示所述体积的液体培养基的液体弯液层。图l和2的装置进一步包括盖子，其封闭所述容器的膜密封末端，且 5提供对器官型培养周围空气的控制，其中可能进行气体交换，但防止微生 物污染。在用于高通量装置的组件的情形中，所述盖子将优选地覆盖该整个组 件。所述盖子可以是松散匹配的，以容许气体扩散，从而具有与所述培养 皿或组件的边缘重叠的边缘，以在微小空气涡流的存在下最小化污染。组 10 织培养的实践者熟知应该最小化空气涡流。备选地，所述盖子可以是严格 匹配的，在该情形中可以在框架中提供端口，由此气体可以在腔室和盖子 与膜间的空间之间循环。所述腔室优选地包括预制的合并两个密封圈的塑料形状，其将腔室稳 定地定位在培养基导管圆柱体基部的周围。另外，如果存在细胞悬液导管， 15则使用两个密封圈将细胞悬液导管圆柱体定位在所述预制的塑料形状中。优选地，所述密封垫是由氯丁橡胶制造的密封圈。优选地，所述细胞 悬液导管由硅橡胶，即半刚性材料制成，从而确保在离心过程中对所述多 孔膜的密封。所述腔室的基部进一步包括隔膜，其可以被吸移管穿透，以帮助在不20向周围环境暴露培养基的情况下改变腔室内的培养基。优选地，所述腔室的内部对于气体扩散或灌注而言是可以进入的，且 所述腔室包括2个用于气体流动的孔或端口，以控制空气条件。所述腔室 和所述框架优选地包括额外的端口，从而容许气体在腔室和由所述盖子覆 盖的膜上方的空间之间流动。25 如图3中所示，按照本发明的用于多个器官型培养的高通量装置包括多个如图1中所示的用于单一器官型培养的装置。该高通量装置中每个培 养基导管圆柱体均含有它自己的液体培养基供给，其通过毛细作用保持与 所述膜接触。如图4中所示，按照本发明的用于多个器官型培养的进一步的高通量装置包括多个如图2中所示的用于器官型培养的装置。该高通量30装置中每个培养基导管圆柱体均含有它自己的液体培养基供给，其通过毛细作用保持与所述膜接触。对应于每个培养基导管圆柱体，存在一个或多 个细胞悬液导管圆柱体，其在离心之前和过程中容纳细胞悬液。在如图4 中所示的实施例中，对于每个培养基导管圆柱体，存在4个细胞悬液导管 圆柱体，及由此的4个器官型培养。5 图3和4中位于培养基导管圆柱体基部的腔室相通，且可能在腔室间进行气体流动，由此容许通过位于所述装置任意末端端口的气体流动控制 所有腔室中的空气条件。此外，通过框架中的端口使盖子和培养物之间的 空间与腔室相连，由此容许控制位于所述膜上的培养物周围的空气条件。如图5中所示，图1和2的装置可以包括进一步的元件，其保持所述10导管处于相对于所述框架来说合适的位置，所述元件诸如，例如所述导管和所述框架间的弹簧。参考文献Corradino R., 1973， J. Cell Biol.(细胞生物学)，巻58，第64-78页， 15Embryonic chick intestine in organ culture. A unique system for the study of the intestinal calcium absorptive mechanism (器官培养中的胚胎小鸡肠。用 于研究肠内钙吸收机制的独特系统).StoppiniL.等，1991, Neurosci. Methods (神经科学方法)，巻37第173-82 20页,A simple method for organotypic cultures of nervous tissue (用于神经组织 器官型培养的简单方法).Wicks W., 1968， J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，巻243,第900-6页， Induction of tyrosine-alpha- ketoglutarate transaminase in fetal rat liver (月台鼠25肝中酪氨酸a酮戊二酸酯转氨酶的诱导).Wildenthal K.， 1971, J. Appl. Physiol.,巻30,第153-7页，Long-term maintenance of spontaneously beating mouse hearts in organ culture (器官培 养中长期维持自发搏动的小鼠心脏).30
权利要求
1.用于器官型培养的装置，所述装置包括培养基导管，其具有一个开口末端和一个由多孔膜封闭的末端，所述多孔膜横跨该封闭的末端与其熔合；和框架，其保持所述培养基导管处于基本垂直的方向；其中所述培养基导管适合于通过毛细作用容许将充足体积的液体培养基保留在所述培养基导管中，从而与所述多孔膜表面接触，并由此向可以在所述多孔膜上生长的细胞提供营养。
2. 按照权利要求1的装置，其进一步包括细胞悬液导管，该细胞悬液 导管具有一个开口末端和一个由所述多孔膜表面封闭的末端，所述表面是 密封所述培养基导管的所述多孔膜表面的对侧；其中所述框架保持所述培 养基导管和所述细胞悬液导管处于基本垂直的方向。
3.按照权利要求1或权利要求2的装置，其中每个所述导管均适合于通过毛细作用容许将充足体积的液体培养基保留在所述导管中，从而在所 述装置处于竖立或倒置位置时，所述液体培养基均与所述导管中的多孔膜 表面接触。
4. 按照权利要求1—3中任一项的装置，其中所述培养基导管是圆柱20 体。
5. 按照权利要求2或权利要求3的装置，其中所述细胞悬液导管是圆 柱体。
6. 按照权利要求2或权利要求3的装置，其中所述培养基导管是圆柱 体，且所述细胞悬液导管是圆柱体。
7.按照权利要求4或6的装置，其中所述培养基导管是具有0.5cm或更小半径的圆柱体。
8. 按照上述权利要求中的任一项的装置，其中所述多孔膜通过胶粘、 通过热封或通过超声焊接与所述培养基导管的一个末端横跨熔合。
9. 按照权利要求2 —8中任一项的装置，其中通过重力场向所述多孔 30 膜按压边缘将所述细胞悬液导管与所述多孔膜密封。
10. 按照权利要求2 — 9中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管通过氯丁橡胶密封垫与所述多孔膜密封。
11. 按照权利要求2 — 9中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管通过 硅橡胶密封垫与所述多孔膜密封。
12.按照权利要求2 —11中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管可以在细胞培养前从所述装置中去除。
13. 按照权利要求2—11中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管通 过胶粘、通过热封或通过超声焊接与所述多孔膜密封。
14. 按照权利要求2—13中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管由 io 硅橡胶组成。
15. 按照权利要求2 — 14中任一项的装置，其中所述细胞悬液导管的 内部横截面面积小于所述培养基导管的内部横截面面积。
16. 按照上述权利要求中的任一项的装置，其中所述多孔膜任选地是 透明的。
17.按照权利要求16的装置，所述多孔膜由亲水性聚四氟乙烯(PTEE)组成。
18.按照权利要求1一17中任一项的装置，其中所述框架保持所述导管处于基本垂直的方向，使得由所述膜封闭的导管末端和所述导管的开口末端均不与任何表面接触。
19.按照权利要求2—18中任一项的装置，其中所述框架保持所述导管处于基本垂直的方向，使得与所述膜接触的细胞悬液导管末端在重力场中通过所述框架支持，从而防止对所述膜的损伤。
20.按照权利要求1一19中任一项的装置，其中所述装置进一步包括腔室，其围绕所述培养基导管的开口末端。
21.按照权利要求20的装置，其中所述腔室包括开口，以容许改变所述培养基。
22. 按照权利要求1一21中任一项的装置，其包括覆盖所述多孔膜表 面的盖子，其中所述多孔膜表面是在所述液体培养基的对侧。
23. 用于高通量器官型培养的装置，其包括多个按照权利要求1一22 30 中任一项的装置。
24.按照权利要求23的用于高通量器官型培养的装置，其包括96、 384、 1536或更多个按照权利要求1一22中任一项的装置。
全文摘要
本发明涉及细胞和组织培养领域。具体地，本发明提供用于器官型培养的新型装置。所述装置包括培养基导管，其具有一个开口末端和一个由多孔膜封闭的末端，所述多孔膜横跨该封闭的末端与其熔合；和框架，其保持所述培养基导管处于基本垂直的方向；其中所述培养基导管适合于通过毛细作用容许将充足体积的液体培养基保留在所述培养基导管中，从而与所述多孔膜表面接触，并由此向可以在所述多孔膜上生长的细胞提供营养。所述装置可以进一步包括细胞悬液导管，其具有一个开口末端和一个由所述多孔膜表面封闭的末端，所述表面是密封所述培养基导管的所述多孔膜表面的对侧；其中所述框架保持所述培养基导管和所述细胞悬液导管处于基本垂直的方向。
文档编号C12M3/06GK101218337SQ200680024632
公开日2008年7月9日 申请日期2006年6月15日 优先权日2005年6月15日
发明者卢茨·斯托皮尼 申请人:开普森特神经技术有限公司