专利名称：家蚕葡萄糖基转移酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及来自于经济动物家蚕的可以转移葡萄糖残基的 一种葡萄糖基转移酶基因。
背景技术：
糖类化合物作为自然界中含量最丰富的生物大分子之一，行使着重要的生物学功能。 可以作为能源的储存物，维持细胞的结构，构成胞外填充物，行使细胞间的信号识别和 传导功能等。另外，很多的蛋白质以糖蛋白的形式存在，它们包括酶、免疫球蛋白、载体 蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受 精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面。而且病菌、病毒的侵 染，癌细胞的增殖及转移，自身免疫疾病等都与细胞表面的糖密切相关。糖的多样性决 定了在催化其合成中起关键作用的糖基转移酶的多样性。在原核生物和真核生物中都有种 类繁多的糖基转移酶存在。
糖基转移酶是一群超家族的酶，它们普遍存在于动物，植物，细菌和病毒中。这些酶 能够催化核苷糖的糖基转移到一些小的疏水性的分子(糖苷配基)上，形成亲水性的化合 物，便于排泄，因此在抑制和排除一系列内生和外生的有毒化合物过程中起了重要作用。 昆虫一般利用尿苷二磷酸一葡萄糖作为糖的供体，因此称为葡萄糖基转移酶。昆虫的葡萄 糖基转移酶在许多过程中起重要作用，包括使作用物解毒，角质层形成，色素形成和嗅觉 方面。
生成绿茧的色素是黄酮类色素，是以桑叶中的黄酮类物质为前体，由蚕体自身合成的。 中间的代谢过程就有葡萄糖基转移酶的参与，说明蚕体内的糖基转移酶基因与茧色的形成 有关。
植物和哺乳动物的糖基转移酶基因研究的较多，而昆虫中研究的很少。在家蚕中仅报 道过一个糖基转移酶基因。随着糖组学的提出，糖基转移酶已成为人们的研究热点。糖基 转移酶的催化活性及其高度的底物专一性都与其结构密切相关。糖基转移酶在糖类酶促合 成中具有应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕葡萄糖基转移酶基因，通过对该基因功能的更深入研
究，可为培育彩色茧蚕品种，生产天然彩色丝绸奠定基础。
本发明申请人根据同源序列比对，在家蚕基因组中找到了葡萄糖基转移酶基因，然后 进行了基因克隆。具体方法如下
(1) 序列比对果蝇的葡萄糖基转移酶基因与家蚕基因组进行同源性比对，得到的序 列于NCBI中进行反比，进一步确定为葡萄糖基转移酶基因；
(2) PCR扩增根据比对序列设计引物Pl (5，ATGTGGTTAAAGTTTTTCTACTT3， )、 P2 (5， TTACAAAGCCTTGAATTTTCC 3，)，以5龄第3天的丝腺cDNA为模板进行PCR扩增；
(3) 基因的克隆扩增片断克隆到pMD18-T载体上，然后进行序列测定(上海Sangon)
(4) 序列同源性分析相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明，家 蚕葡萄糖基转移酶与蜕皮甾类葡萄糖基转移酶基因有一定的序列相似性；
(5) 基因外源表达表达的蛋白对其进行活性测定，结果表明这个酶催化一系列化合物 发生糖基化作用，对黄酮类化合物发生糖基化率最高。
本发明的优点是
酶活性测定实验表明，该酶可以使黄酮类化合物发生糖基化作用，表明其可以改变黄 酮类化合物的生物活性，比如溶解性及穿越组织的特性。通过对该基因功能的更深入研究， 可为培育彩色茧蚕品种，生产天然彩色丝绸奠定基础。
具体实施例方式
Trizol法提取家蚕5龄三天丝腺组织的RNA，反转录成cDNA;以此为模板用特异性引 物进行扩增，扩增的片断克隆到pMD18-T载体上，序列测定(上海Sangon)表明扩增的 片断为编码葡萄糖基转移酶的全长cDNA基因，包含完整的开放阅读框；在NCBI站点上用 BLAST完成序列同源性分析，表明这个葡萄糖基转移酶是家蚕中未报道的新基因。 上述方法获得的家蚕葡萄糖基转移酶全长cDNA基因及推测氨基酸序列如下 GGAATCGAATTCGTCAGTCACAACTAGTCACTTTTGGTGTAGTGTCCGTTTTCTCCACA ATG TGG CTG AAA TTT TTT TAT TTT TTT AGC CTG GTG CTG TGC (XG MWLKFFYFFSLVLCP TGC TAT GCG GCG CAG GGC GCG AGC ATT CTG GCG GTG TTT AGC AGC CYAA(JGASILAVFSS CTG AGC TAT AGC GAT CAT CTG GTG TTT CGT GGC TAT GTG AGC CTG LSYSDHLVFRGYVSL CTG GCG CAG CGT GGC CAT AGC GTG GTG GTG atg ACC CCG TAT CCG LAQRGHSVVVMTPYP GGC GAA TTT CAG TAT CCG GAA GTG GAA AAC ATT ATT GAA CTG GAT
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权利要求
1、一种家蚕葡萄糖基转移酶基因，其特征在于其序列如下GGAATCGAAT TCGTCAGTCA CAACTAGTCA CTTTTGGTGT AGTGTCCGTT TTCTCCACAA 60TGTGGCTGAA ATTTTTTTAT TTTTTTAGCC TGGTGCTGTG CCCGTGCTAT GCGGCGCAGG 120GCGCGAGCAT TCTGGCGGTG TTTAGCAGCC TGAGCTATAG CGATCATCTG GTGTTTCGTG 180GCTATGTGAG CCTGCTGGCG CAGCGTGGCC ATAGCGTGGT GGTGatgACC CCGTATCCGG 240GCGAATTTCA GTATCCGGAA GTGGAAAACA TTATTGAACT GGATGTGAGC CAGGAAAGCG 300CGCCGTTTTG GGAAGAATAT AAACGTCTGa tgACCAACAC CGATGATTAT TATCCGCGTC 360TGAAAGCGCT GAACGAACTG AGCCTGAAAA TTGCGATTGC GCAGCTGAAA AGCAAACAGa 420tgACCGCGCT GCTGATTAAC CCGAACGTGA AATTTGATCT GGTGATTACC GAAGCGGATG 480TGCCGCTGCT GTATGCGCTG GCGGATAAAT ATCAGACCCC GCATATTACC ATTAGCACCT 540TTAACGGCAA AATTCATCAG TATGAAGCGA AAGGCAACCC GATTCATCCG ATTCTGTATC 600CGGATGTGAA CAGCCTGAAC TATGGCAACC TGACCCGTTG GCAGAAAATT ATTGAATTTT 660ATCGTCATAT TCAGACCAAA ACCGAATTTT ATAACAACTA TCTGCCGCTG TGCGATGTGG 720CGGCGAAAAA AATTCTGGGC CTGAAACGTG ATCTGCAGGA AGTGGAATAT GATATTGATa 780tgCTGTTTAT TGCGAGCAAC CCGCTGCTGA TTGGCAACCG TCCGGTGGTG CCGGCGATTC 840AGTTTGTGGA TCGTatgCAT ATTAAACCGC GTatgAGCCT GCCGCAGAAC CTGCAGAGCC 900TGCTGGATAG CCAGACCAAA GGCGTGATTT ATTTTAGCCT GGGCACCCTG CAGGAAGCGG 960AAAAACTGAG CGTGAAAACC CTGCAGGTGT TTGCGGATGC GTTTCGTGAA CTGCCGTTTA 1020CCGTGCTGTG GAAAATTGGC AAAatgAGCA CCCTGAAACT GAGCGATAAC GTGATTACCG 1080ATGTGTGGTT TCCGCAGCAG CAGCTGCTGG CGCATAAAAA CGTGCGTGCG TTTATTACCC 1140ATGGCGGCCC GCGTAGCCTG GAAGAAGCGC TGTTTTATGA AGTGCCGATT ATTGGCTTTC 1200CGCTGATTAC CAGCCGTAAA ATTTTTATTC GTGAACTGAC CAAATATGGC GCGGGCGAAA 1260TTCTGGATCC GCTGCATATT GATAAACAGA CCCTGAAACA GGTGATTAGC ACCGTGGCGA 1320CCGATGAAAA ATATAAAAAA GCGATTATTA AACTGAAAGG CatgGTGGTG GATCCGCTGA 1380TTAGCGGCCC GGATAACGCG GTGTGGTGGA CCGAATATGT GCTGCGTAAC CGTGGCGCGC 1440AGCATCTGCG TAGCCCGGTG GTGGGCGTGA CCTTTATTAA ATATTATatg CTGGATATTC 1500TGACCTATAT TCTGGCGGTG GTGCTGTTTC TGCTGTATCT GACCTTTCTG GTGCTGAAAT 1560GCATTTATCG TCGTCTGCGT GCGCGTTTTG TGCTGCGTAC CGGCCAGGGC CCGGAAGGCA 1620AATTTAAAGC GCTGTAAATC CATCTTTTGT TGGTTTTATC GAATTAAAAT GTTTATTTAG 1680TATCGATAAT ATTAAACATA TTCGTGTGAA AAACAAAACA AAAAAAAAAA AAAAAAAA1738。
2、 一种家蚕葡萄糖基转移酶基因编码的蛋白质，其特征在于其序列如下MWLKFFYFFS LVLCPCYAAQGASILAVFSS30LSYSDHLVFRGYVSLLAQRGHSVVVMPYP60GEFQYPEVENIIELDVSQESAPFWEEYKRL90MTNTDDYYPRLKALNELSLKIAIAQLKSKQ120MTALLINPNVKFDLVITEADVPLLYALADK150YQTPHITISTFNGKIHQYEAKGNPIHPILY180PDVNSLNYGNLTRWQKIIEFYRHIQTKTEF210YNNYLPLCDVAAKKILGLKRDLQEVEYDID240MLFIASNPLLIGNRPWPAIQFVDRMHIKP270RMSLPQNLQSLLDSQTKGVIYFSLGTLQEA300EKLSVKTLQV FADAFRELPFTVLWKIGKMS330TLKLSDNVITDVWFPQQQLLAHKNVRAFIT360HGGPRSLEEALFYEVPIIGFPLITSRKIFI390RELTKYGAGEILDPLHIDKQTLKQVISTVA420TDEKYKKAIIKLKGMWDPLISGPDNAVWW450TEYVLRNRGAQHLRSPVVGVTFIKYYMLDI480LTYILAWLFLLYLTFLVLKCIYRRLRARF510VLRTGQGPEGKFKAL525。
全文摘要
一种家蚕葡萄糖基转移酶基因，根据同源序列比对，在家蚕基因组中找到并克隆得到。酶活性测定实验表明，该酶可以使黄酮类化合物发生糖基化作用，表明其可以改变黄酮类化合物的生物活性，比如溶解性及穿越组织的特性。通过对该基因功能的更深入研究，可为培育彩色茧蚕品种，生产天然彩色丝绸奠定基础。
文档编号C12N15/54GK101205540SQ20071009255
公开日2008年6月25日 申请日期2007年8月7日 优先权日2007年8月7日
发明者向仲怀, 夏庆友, 成 鲁, 黄飞飞 申请人:重庆拓桑生物科技有限公司