专利名称：一种肠毒素c2蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，具体说是一种肠毒素C2蛋白的制备方法。
背景技术：
超抗原(superantigen, SAg)是一组由细菌或病毒编码的蛋白质分子， 可以极低浓度(l 10ng/mL)刺激大部分T细胞增生，具有超强的增强机 体免疫反应功能和一定的抗肿瘤活性。因此，超抗原是一种极好的免疫调 节剂和增效剂，可望被开发成潜在的新型抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗。
金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins， SEs)是一类 具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典 型微生物超抗原，受到人们的广泛重视。近年来，人们在对金黄色葡萄球 菌肠毒素(SE)结构、免疫学功能及其抗肿瘤等进行了大量研究工作，其 中主要集中在对TSST1、 SEA、 SEB等的研究方面。
然而，肠毒素C2 (SEC2)作为金黄色葡萄球菌肠毒素家族中的一员， 国内外对其结构与功能方面的研究至今不多，且已有的研究结论尚不明确。
SEC2分子晶体的拓扑异构学结构和与MHC II、 TCR的结合位点同SEB、 TSST-1极为相似，唯一的特点是在分子表面溶剂暴露区有一个锌离子结合 位点，第83位天冬氨酸，第118位组氨酸，第122位组氨酸和晶格中相邻 分子的第9位天冬氨酸共同配位这个锌离子。原子吸收光谱显示，即使在 溶液中锌离子依然结合于SEC2分子。锌离子的存在可能对维持复合物的构 象起着重要作用，如在两个分子间形成盐桥，或者作为一个具有催化作用 的阳离子。
目前制备SEC2的方法主要有两种， 一种是从分泌野生型SEC2的金黄 色葡萄球菌培养液中，以离子交换和凝胶排阻的方式获得，该方法可以得 到天然野生型的SEC2蛋白，但金黄色葡萄球菌本身的SEC2分泌量非常少， 在培养液中含量极低(纳克级)，且需经三次柱层析方可得到纯品，操作过 程复杂，耗时长，蛋白损失量巨大，产量严重受限。另一种方式是以基因 工程方式在大肠杆菌中大量表达带有纯化标签(如组氨酸标签His-tag或 谷胱甘肽转移酶标签GST)的重组SEC2蛋白，并以亲合层析(如Ni +离子 亲合层析或谷胱甘肽亲合层析)的方式纯化，该方法产量大，耗时少，但 引入的纯化标签均是以融和蛋白的形式结合于重组SEC2分子，影响其空间 构象进而影响其生物学活性。虽然现已有商品化的蛋白酶类可以切除融合 的纯化标签，但其切除效率、切除后再纯化过程以及蛋白酶本身的成本也 限制了其广泛使用。
发明内容
3本发明的目的在于提供一种野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2 ( SEC2 ) 的制备方法。
为实现上述目的，本发明所釆用的技术方案如下该蛋白为一种超抗 原，具有SEQIMO. 1的氨基酸序列，其制备方法
(1)以金黄色葡萄球菌基因组作为模板，釆用分别带有Wco I和Ib I 酶切位点及5，端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码金黄色 葡萄球菌肠毒素的基因片断，将获得的目的基因片段序列连入载体；
(2 )利用亚克隆技术构建重组质粒，将该质粒转入大肠杆菌后，釆用常 规方法IPTG诱导蛋白表达；
(3)利用结合金属离子的亲和纯化柱纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋 白，电泳鉴定结果显示获得了高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白；
其中步骤(l)分别带有lo I和I酶切位点及5'端保护碱基为 引物为 wsec—F: 5 ，-CGCCATGGAGAGTCAACCAGA-3 ， ， wsec-R: 5 ， -7H CTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，(下划线部分分别为Wco I和XAo I酶 切位点，斜体字体为5'端保护碱基)。
所述结合金属离子的亲和纯化柱为填料表面结合了二价金属阳离子； 其中二价金属阳离子可为Fe2+、 Co2+、 Cu1Zn2+。所述二价金属阳离子优 选为Zn2+。所述釆用亲和纯化柱纯化时用含咪唑的洗脱液洗脱。所述洗脱 液其中咪唑浓度为50-120mM。所述与步骤(l)获得的目的基因片段序列连 入pet28a载体，并按照步骤2得到重组pET-28a-sec2质粒，而后转化至 大肠杆菌BL21 (DE3),经纯化后得到金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白置于 截留分子量为14000道尔顿的透析袋，经对PBS透析得到具有生物学活性的 纯品蛋白。本发明具有的优点
1. 本发明可表达不含有任何多余氨基酸残基的野生型SEC2的重组表 达质粒pet28a-sec2,并将其转化于合适的表达宿主，在诱导剂诱导下可高 效表达野生型SEC2蛋白。
2. 本发明提供了一种基因工程菌，该菌株含有可表达不含有任何多余 氨基酸残基的野生型SEC2的重组表达质粒pet28a-sec2，在合适的诱导剂 作用下可高效表达野生型SEC2蛋白。表达强度占菌体总蛋白的30%以上， 且为可溶性表达，不产生包涵体，便于后续分离纯化。
3. 本发明蛋白自身具有结合金属离子的特点，釆用亲合层析方法纯化 野生型SEC2，仅需一次过柱即可得到高纯度的野生型SEC2蛋白，不需额外
引入任何纯化标签及多余氨基酸残基。并通过本发明得到的蛋白，经体外刺 激BALB/C小鼠脾淋巴细胞增殖实验和体外肿瘤杀伤实验证实，该蛋白具有 与野生型SEC2标准品完全一致的生物学活性。
4. 本发明方法简便易搡作，其纯化速度及纯度明显高于离子交换层析 或分子筛层析等方法。并且本发明纯化方法还可用于其他具有金属离子结合功能的多种蛋白质及大分子的纯化。
5.本发明利用SEC2蛋白分子自身具有的Zn2 +离子结合位点，以结合了 Zn2 +离子的亲合填料为纯化介质，仅需一次过柱即可得到高纯度的野生型 SEC2蛋白，其纯化具有较高的产量和98%以上的纯度，并且不需额外引入 任何纯化标签及多余氨基酸残基。本发明方法简便易操作，其纯化速度及 纯度明显高于离子交换层析或分子筛层析等方法。
图l为本发明PCR扩增的SEC2基因琼脂糖凝胶电泳图。(其中l为 DL20000 DNA分子量标准，由上至下分子量分别为(bp): 2000、 1000、 750、 500、 250、 100; 2为PCR扩增的编码野生型SEC2蛋白的基因sec2。)
图2为本发明中SEC2的大肠杆菌异源表达SDS-PAGE电泳分析图。(其中 l为未经诱导的转化了 pet28a-sec2载体的BL21 (DE3)大肠杆菌；2为经1. OmM IPTG诱导的转化了 pet28a-sec2载体的BL21(DE3)大肠杆菌；3为蛋白分子 量标准(由上至下分别为116， 66, 45, 35, 25, 18， 14KD)。)
图3为本发明SEC2在大肠杆菌中异源表达的可溶性分析SDS-PAGE电泳 图。(其中l为诱导的转化了 pet28a-sec2载体的BL21(DE3)大肠杆菌的菌体 全蛋白；2为诱导的转化了 pet28a-sec2载体的BL21 (DE3)大肠杆菌菌体蛋 白不可溶性成分；3为诱导的转化了 pet28a-sec2载体的BL21(DE3)大肠杆 菌菌体蛋白可溶性成分；4为蛋白分子量标准(由上至下分别为116, 66, 45, 35， 25, 18, 14KD)。)
图4为本发明SEC2经Zn"离子亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳分析图。 (其中l为蛋白分子量标准(由上至下分别为116， 66, 45， 35， 25， 18, 14KD); 2为经Zn"离子亲和层析纯化后的异源表达的SEC2蛋白。)
图5为本发明中SEC2的超抗原活性(BALB/C小鼠脾淋巴细胞增殖活性) 结果图。
图6为本发明中SEC2的体外抑瘤活性(活化BALB/C小鼠脾淋巴细胞抑 制小鼠瘤细胞L929活性)结果图。
具体实施方式
实施例l
(1 )模板DNA的提取接种产野生型SEC2的金黄色葡萄球菌单菌落 于5ml液体LB培养基中，37'C摇床过夜培养，取1. 5ml的培养物离心收集 菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA作为PCR反应模板(基因组DNA提 取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼， J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 )。
(2) PCR扩增
以分别带有iVcol和酶切位点及5，端保护碱基的引物 wsec-F: 5' -CGCCATGGAGAGTCAACCAGA-3 ', wsec-R: 5 '-rCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'(下划线部分分别为Wco I和Ji20 I酶 切位点，斜体字体为5，端保护碱基)PCR反应体系为10 x Pyrobest反 应缓冲液5nl、 dNTP 250jumo1、质量浓度为0. 02%的BSA 2jul、上下游 引物各25pmol、模板基因组DNA 0. l|ig、 Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa 公司产品)2U，无菌超纯水补齐体积至50nl。
PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C, 45秒；55 °C， 45秒；72。C, 45秒；共30个循环；第三阶段72。C， 10分钟
(3)PCR扩增产物经质量浓度为1.2%琼脂糖凝胶电泳分析(参见图1)， 切下大小约为700bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试 剂盒使用说明书进行胶回收。
实施例2
原核异源表达载体pet28a-sec2的构建
将纯化后的PCR产物片段经WcoI和EoI限制性内切酶消化，以T4DNA 连接酶连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体 pet28a-sec2，转化￡ coh'BL21 (DE3)感受态细胞(转化搡作按F.奥斯伯， R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，L斯 特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社 1995年第三版P39-40 ),提取质粒DNA，经5coffl、 J力ol双酶切鉴定正确重 组克隆，并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。
得的DNA片段具有序列表SEQ ID N0:1中的氨基酸序列
ESQPDPTPDE LHKSSEFTGT MGNMKYLYDD HYVSATKVMS VDKFLAHDLI 50
YNISDKKLKN YDKVKTELLN EDLAKKYKDE VVDVYGSNYY VNCYFSSKDN 100
VGKVTGGKTC MYGGITKHEG NHFDNGNLQN VLIRVYENKR NTISFEVQTD 150
KKSVTAQELD IKARNFLINK KNLYEFNSSP YETGYIKFIE NNGNTFWYDM 200
MPAPGDKFDQ SKYL画YNDN KTVDSKSVKI EVHLTTKNG 239
(1) SEQ ID NO. 1的信息
/ 、t^r t",I丄4< /-r
(参见序列表)
性
(b) 分子类型蛋白质
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源金黄色葡:
(StapAj^ococcus aureus)
y残酸 线
汁l刑二 i如t
:;长类链拓
6实施例3
蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中的异源表达。
(1 )接种转化了 pET-28a-sec2质粒的BL21 (DE3)单菌落于含40ug/ml 卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1%体积接种量转接下一 级，37。C摇床培养至OD,为0. 6，加入终浓度1. Ommol/L的IPTG， 30。C诱 导表达6小时。4000rmp离心10分钟收集菌体，取少量样品以2x上样缓 冲液((上样缓冲液为100mg十二烷基磺酸钠(SDS) , 2g甘油，2mg溴酴 蓝，O.lmip-巯基乙醇，并以50mM Tris-HC1 (pH8. 0)定容至10ml)处理， 处理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81 和P87)， 12%SDS-PAGE电泳(电泳条件50伏特，30分钟，然后再120 伏特，2小时)，考马斯亮蓝染色分析表达产物(参见图2)。
(2)异源表达的SEC2的可溶性分析及纯化前的预处理将离心收集 的菌体以TE缓冲液(lOmM Tris-HC1, 20mM EDTA， pH8. 0 )重悬清洗两次， 以除去菌体表面吸附的培养基中的二价金属离子，并用平衡缓冲液(50mM NaH2P04， 300mMNaCl， 5mM imidazole, pH8. O)重悬，超声波破碎，于10000rmp 离心30分钟收集上清，并以和上清等体积的平衡缓冲液重悬沉淀，取同样 体积以12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析表达产物的可溶性(参见 图3)。结果表明，异源表达的SEC2的表达量占全菌蛋白的30%以上，且 为可溶性表达，不产生包涵体。 实施例4
异源表达的SEC2的亲和层析纯化。
(1 ) Zn"离子亲和层析柱的制备釆用0. 5M的NaOH清洗NTA柱层析 填料2个柱体积，并以去离子水清洗5个柱体积，在以100mM的EDTA溶液 清洗2个柱体积以除去填料中的一切二价金属离子，并以去离子水清洗5 个柱体积，而后以lOOmM的ZnS04溶液清洗5个柱体积以使Zn"离子充分结 合于柱填料，并以去离子水清洗5个柱体积，最后以5个以上柱体积的平 衡缓冲液平衡该亲和层析柱。上述操作控制流速为lml/min。
(2) 将收集的菌体破碎(超声波振幅15%,破碎5秒间歇9秒，直至 液体清亮)后上清液上样于平衡好的亲和层析柱，以平衡缓冲液冲洗10个 柱体积以上以直至基线，最后以2个柱体积的洗脱缓冲液(50mM NaH2P04, 300mMNaCl， 100mM咪唑，pH8. 0 )洗脱目的蛋白，收集目的蛋白。以上操 作控制流速为0. 3ml/min。
(3) 将收集的目的蛋白置于截留分子量为14000道尔顿的透析袋中， 对PBS透析过夜，取适量样品以12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析 纯度(参见图4),其余于-80'C保存备用。结果表明，通过本发明所提供的 方法，可以得到纯度高于9 8 %的可溶性野生型S E C 2蛋白纯品。
实施例5
异源表达的SEC2蛋白的生物学活性分析。
7增殖活性检测
取SPF级纯系小鼠Balb/c,拉颈处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻 压碎后过200目筛网。将过筛后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min 收集细胞沉淀，用5mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min 离心5min。再以不含血清的RPMI-1640培养基(购自Gibco公司)清洗细 胞2次，最后用含10%小牛血清(购自天津巿灏洋生物制品科技有限责任 公司)的RPMI-1640培养液调节细胞浓度，以8 x 1(Tcells/孔加到96孔板 中。分别将经纯化的本发明异源表达的SEC2蛋白以不同终浓度(参见图5 横坐标)加入各孔。以相同浓度的野生型SEC2标准品(购自沈阳协合生物 制药股份有限公司)作为阳性对照，以100pmol/mL的牛血清白蛋白(BSA ) 做阴性对照自然释放孔，同时设培养基空白孔(只加含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液)，每个样品设3个复孔。常规条件培养72h后，加入30u1/ 孔的质量浓度为0. 5%的MTT (溴化3-4， 5-二甲基噻唑-2, 5-二酚四唑) (购自辽宁博奥春天生物科技有限公司)溶液。继续培养4h， 1500r/min 离心5分钟后弃上清培养液，以120ul/孔加入二甲基亚砜溶液(腿SO),溶 解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。
通过以下公式计算增殖指数PIPI=(实验孔-培养基空白孔)/ (阴性 对照自然释放孔-培养基空白孔)
如图5所示本发明异源表达的SEC2蛋白在不同浓度下都具有和标准品 完全相当的超抗原活性。本实验所用到小鼠为SPF级BALB/c纯系小鼠，为 体内外均无寄生虫和特殊病原菌的近交系小鼠，实验结果精度高，重复性 好。
(2) SEC2突变蛋白的抗肿瘤活性检测
将小鼠纤维瘤细胞L929 (购自ATCC)传代培养后用胰蛋白酶-EDTA消 化液消化，将消化后的细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基稀释成 浓度为2 x 105cells/mL的单细胞悬液，以1 x 104cells/孔接种于96孔板。 将分离获得的小鼠脾淋巴细胞以2 x 105cells/孔加入到上述含有L929细胞 的96孔板中，使效耙细胞数比例为20: 1。将纯化的异源表达的野生型SEC2 蛋白以终浓度40pmol/mL加入各孔。以BSA作为阴性对照，野生型SEC2标
准品作为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔及空白对 照孑L，每样品设3个复孔。按常规条件培养72h,加入30ul/wel1的MTT液。 继续培养4h, 1000r/min离心弃上清，加入浓度为120ul/孔的DMSO，溶解 15min后，酶标仪上以570腿测定各孔的吸光值。
抑瘤率(Tumor growth inhibi t ion， ％ ) =100-[(实验孔-淋巴细胞自 然释放孔)/ (肿瘤细胞对照孔-空白对照孔)]x100。
实验结果显示(参见图6)本发明异源表达的SEC2蛋白具有和标准品 完全相当的体外抑瘤活性。
8序列表
SEQUENCE LISTING <110>中国科学院沈阳应用生态研究所 <120> —种肠毒素C2蛋白的制备方法 <130〉 <歸 1
<17t)〉 Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 239
〈212〉 PRT
<213> S卞邻hylococxus aureus 〈220〉
<221〉 PKT
<222〉 (1).. (239) 〈223>
<400〉 1
Glu Ser Gin Pro Asp 1 5
Phe Thr G1y Thr Met 20
Val Ser Ala Thr Lys 35
Leu lie Tvr Asn lie
50
Lys Thr Glu Leu Leu 6^
Val Val Asp Val Tvr
Ser Lvs Asp Asn Val 100
Gly Gly lie Thr Lys
Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lvs Ser Ser Glu 10 15
Gly Asn Met Lys Tvr Leu T>r Asp Asp His Tyr ' 30
Val Met Ser Val Asp Lvs Phe Leu Ala His Asp 40 45
Ser Asp !>ys Lys Leu L^s Asn Tyr Asp Lys Val 55 60
Asn Glu Asp Leu Ala Lvs Lvs Tvr Lys Asp Glu 70 75 80
Gly Ser Asn Tyr TVr Val Asn Cvs Tyr Phe Ser '9J3 95
Glv Lvs Val Thr Glv Glv Lvs Thr Cvs Met Tvr 105 110
His Glu G1y Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu115
120
序列表 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Us Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tvr Glu Phe ' 165 l于O 175
Asn Ser Ser Pro Tvr Glu Thr Glv Tyr lie Lvs Phe lie G]u Asn Asn 180 ' 185 190
Glv Asn Thr Phe Trp Tvr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe .195 200 20^
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp 210 ' ' 215 ' 220 '
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Glv 225 230 235
10
权利要求
1. 一种肠毒素C2蛋白的制备方法，该蛋白为一种超抗原，具有SEQIDNO.1的氨基酸序列，其特征在于(1)以金黄色葡萄球菌基因组作为模板，采用分别带有Nco I和Xho I酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码金黄色葡萄球菌肠毒素的基因片断，将获得的目的基因片段序列连入载体；(2)利用亚克隆技术构建重组质粒，将该质粒转入大肠杆菌后，采用常规方法IPTG诱导蛋白表达；(3)利用结合金属离子的亲和纯化柱纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白，电泳鉴定结果显示获得了高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白；其中步骤(1)分别带有Nco I和Xho I酶切位点及5’端保护碱基为引物为wsec-F5’-CG<u>CCATGG</u>AGAGTCAACCAGA-3’，wsec-R5’-TCG<u>CTCGAG</u>TTATCCATTCTTTGTTG-3’。
2. 按权利要求1所述的肠毒素C2蛋白的制备方法,其特征在于所述 结合金属离子的亲和纯化柱为填料表面结合了二价金属阳离子；其中二 价金属阳离子可为Fe2+、 Co2+、 Cu2 +或Zn2+。
3. 按权利要求2所述的肠毒素C2蛋白的制备方法，其特征在于所述 二价金属阳离子优选为Zn"。
4. 按权利要求1所述的肠毒素C2蛋白的制备方法，其特征在于所述采用亲和纯化柱纯化时用含咪唑的洗脱液洗脱。
5. 按权利要求4所述的肠毒素C2蛋白的制备方法，其特征在于所述洗脱液其中咪唑浓度为50-120mM。
6. 按权利要求1所述的肠毒素C2蛋白的制备方法，其特征在于所述 与步骤(1)获得的目的基因片段序列连入pet28a载体，并按照步骤2得 到重组pET-28a-sec2质粒，而后转化至大肠杆菌BL21 (DE3),经纯化后 得到金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白置于截留分子量为14000道尔顿的透析 袋，经对PBS透析得到具有生物学活性的纯品蛋白。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术，具体说是一种肠毒素C2蛋白的制备方法。具体为(1)以金黄色葡萄球菌基因组作为模板，采用分别带有Nco I和XhoI酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规PCR扩增编码金黄色葡萄球菌肠毒素的基因片断，将获得的目的基因连入载体；(2)利用亚克隆技术构建质粒转入大肠杆菌后，采用常规方法IPTG诱导蛋白表达；(3)利用结合金属离子的亲和纯化柱纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白。本发明所得的肠毒素C2蛋白不含任何引入的多余氨基酸残基，由此保持与由金黄色葡萄球菌表达的野生型SEC2完全相同的生物学活性。并且其纯度达到98％以上。本发明方法简便易操作，其纯化速度及纯度明显高。
文档编号C12N15/09GK101457219SQ200710158820
公开日2009年6月17日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者张惠文, 张成刚, 徐明恺, 王小刚 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所