专利名称：融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因 及克隆和异源表达方法。
背景技术：
免疫毒素是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新的治疗策 略，现已广泛应用于肿瘤治疗。融合免疫毒素是由靶向分子和细胞毒性分 子结合而成的产物，抗体或基因工程抗体可变区片段常作为靶向分子，近 年来单链抗体片段(Single Chain Variable Fragment, scFv)因其分子量
小、肿瘤穿透力强、血液清除快和半衰期短等特点而被广泛的应用于药物 靶向载体的研究。
人表皮生长因子受体2 (Human Epidermal Growth Factor Rec印tor-2, HER-2)是一种肿瘤相关抗原，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30%的过表达， 并且其过表达与患者的不良预后相关。HER-2受体表达于肿瘤细胞表面， 是肿瘤耙向治疗的合适靶点。目前，以HER-2作为靶点对HER-2过表达的
肿瘤进行靶向性治疗已经成为研究热点。
病毒蛋白r ( Viral Protein R, Vpr )是I型人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus I, HIV-1 )的非结构基因vpr所编码的一含96 个氨基酸、分子量大约为14kDa的蛋白。
Vpr蛋白具有使人细胞或裂殖酵母细胞的细胞周期停止于G2/M期的作 用，长期以来的研究表明，处于G2/M期的肿瘤细胞对于化疗和放疗都很敏 感。因此设法使细胞周期停滞在G2/M期会提高肿瘤细胞对治疗的敏感性。 研究结果表明，Vpr蛋白对肿瘤细胞同样具有核定位以及将肿瘤细胞周期 停滞在G2/M期和杀死细胞的功能，因此Vpr用于肿瘤的治疗可以满足以下 要求1、 Vpr可使肿瘤细胞停留在G2/M期，转入肿瘤细胞可提高化疗和 放疗疗效；2、 Vpr具有核定位功能，可提高基因冶疗的效率，更有效地摧 毁肿瘤细胞。
Vpr结合了线粒体内膜的腺喋呤核苷酸转移蛋白，并穿过线粒体外膜 移动，导致线粒体内膜的去极化，使线粒体内膜膨胀并最终导致线粒体外 膜渗透，释放促凋亡因子诱导细胞凋亡，该过程不依赖转录调节。因此Vpr 蛋白通过线粒体作为作用靶点杀伤细胞，而不受P53功能的限制。与传统 药物相比，Vpr在阻止肿瘤凋亡逃逸、杀伤肿瘤方面更具有优势。Vpr的另 一个重要特性是特异性的杀伤快速分裂的细胞，而对不分裂的细胞没有作 用，这一点对于癌症的治疗非常重要。另外，Vpr与糖皮质激素受体作用 导致的NF-KB抑制进一步增加了肿瘤细胞对凋亡的敏感性。 一些初步研究
3已经证实Vpr在抑制肿瘤生长方面具有强大作用。但Vpr蛋白的作用靶点 缺乏特异性，多数快速生长细胞及体内大多淋巴细胞均可被Vpr蛋白识别 并产生毒性作用，这种特异性的缺乏严重限制了 Vpr蛋白作为抗肿瘤制剂 在临床中的开发和应用。因此解决Vpr蛋白作用的靶向性问题成为进一步 研发及利用Vpr蛋白的前提条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表 达方法。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为融合免疫毒素B-L-Vpr 基因具有序列表SEQ ID No:l中碱基序列。融合免疫毒素B-L-Vpr基因 所编码的蛋白具有SEQ ID No: 2中氨基酸序列。
融合免疫毒素b-l-vpr基因的克隆将人源性抗HER-2的单链抗体基 因b和HIV-1 Vpr编码基因vpr通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性 核酸内切酶连接技术连接，即得具有序列表SEQ ID No:l中碱基序列的融 合免疫毒素B-L-Vpr基因；其中，所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为 GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC;所述的人源性抗HER-2 的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No: 3中碱基序列。
其中所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b,釆用引物 B-F: 5， - AAT ， CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT -3， B-R: 5， - CTC ， ^ ^ ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC -3， 通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No:3中碱基序列。 所述HIV-1 Vpr ^码基因vpr，具有序列表SEQ ID No: 5中碱基序列。 所述HIV-1 Vpr编码基因vpr,釆用引物 V-F: 5， - ATA GAA TTC ATG GAA CAA -3， V-R: 5， - GCG CTC GAG GTT AGG AT -3， 通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No:5中碱基序列。 融合免疫毒素B-L-Vpr的异源表达方法融合免疫毒素B-L-Vpr基因 以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌为BL21(DE3)宿主菌，异源表达融合 免疫毒素B-L-Vpr包涵体蛋白，该包涵经变性、纯化、复性得融合免疫毒 素B-L-Vpr。
本发明具有以下优点
1. 本发明构建的融合免疫毒素基因，其引入的连接序列保证抗体片段 和Vpr蛋白各自的生物学活性。
2. 本发明构建的融合免疫毒素基因，可进一步提供直接用于生产 B-L-Vpr融合免疫毒素的工程菌株。
3. 本发明构建的融合免疫毒素基因可在HER-2受体过表达的肿瘤细胞 周围对该肿瘤产生杀伤作用，避免Vpr蛋白分子对正常细胞的毒性作用， 消除全身给药引起的副反应。
44. 本发明中所述融合免疫毒素的分子量小于普通抗体分子量的1/3,克 服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，抗肿瘤的作用更为明显。
5. 本发明利用现代生物技术手段，以抗HER-2单链抗体作为靶向分子, 以Vpr蛋白作为杀瘤效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B-L-Vpr， 并在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白；该融合免疫毒素可特异性识 别结合HER-2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。
图1为人源性抗HER-2的单链抗体基因b的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳 图。(其中l为b的PCR扩增产物；2为入-EcoT14 I digest DNA分子量 标准，由上至下分子量分别为(bp): 19329、 7743、 6223、 4254、 3472、 2690、 1882、 1489、 925、 421。)
图2为HIV-1 Vpr蛋白编码基因vpr的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。 (其中1为人-Hind III digest DNA分子量标准，由上至下分子量分别 为(bp): 23130、 9416、 6557、 4361、 2322、 2027、 564、 125; 2、 3、 4 为vpr的PCR扩增产物。)
图3为本发明融合免疫毒素表达载体b-1-vpr的经Wcol和Jiiol双酶 切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。(其中1为pET-28a-b-1-vpr的WcoJ和J/joJ双 酶切验证；2， DL20000 DNA分子量标准，由上至下分子量分别为(bp): 2000、 1000、 750、 500、 250、 100。)
图4为本发明经包涵体变性、纯化、复性后的融合免疫毒素B-L-Vpr 蛋白的SDS-PAGE电泳图。(其中1为复性后的B-L-Vpr蛋白；2为蛋白分 子量标准(由上至下分别为116, 66, 45, 35, 25, 18， 14KD)。)
图5为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr的特异性结合细胞ELISA 实验结果图，图中纵坐标Binding Degree为结合程度。
图6为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr体外抗HER-2受体过表达 的肿瘤SK-Br-3的实验结果图，图中纵坐标Tumor cell growth inhibition为 肿瘤细胞生长抑制率百分数。
图7为本发明复性的融合免疫毒素B-L-Vpr体外抗HER-2受体非表达 的肿瘤MCF-7的实验结果图，图中纵坐标Tumor cell growth inhibition为肿 瘤细胞生长抑制率百分数。
具体实施例方式
实施例1
融合免疫毒素B-L-Vpr基因具有序列表SEQ ID No: 1的碱基序列。 ATGGCCCAGG TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GCAGAGGTGA AAAAGCCCGG 50 GGAGTCTCTG AAGATCTCCT GTAAGGGTTC TGGATACAGC TTTACCAGCT 100 ACTGGATCGC CTGGGTGCGC CAGATGCCCG GGAAAGGCCT GGAGTACATG 150 GGGCTCATCT ATCCTGGTGA CTCTGACACC AAATACAGCC CGTCCTTCCA 200 AGGCCAGGTC ACCATCTCAG TCGACAAGTC CGTCAGCACT GCCTACTTGC 250AATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGA300
CATGACGTGGGATATTGCACCGACCGGACTTGCGCAAAGTGGCCTGAATA350
CTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAG400
GCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTG450
ACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTC500
CTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACC550
AGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATCACACCAAT600
CGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTC650
AGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATT700
ACTGTGCCTCCTGGGACTACACCCTCTCGGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGG750
ACCAAGGTCACCGTCCTAGGTGCGGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGG800
TTCCGGATCTGAATTCATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAGGGGCCGCAGA850
GGGAACCATACAATGAATGGACATTAGAGCTTTTAGAGGAACTTAAGCAT900
GAAGCTGTTAGACACTTTCCTAGGCCATGGCTCCATGGCTTAGGACAATA950
TATCTATGAAACCTATGGGGATACTTGGGCAGGAGTTGAAGCTATAATAA1000
GAATTTTGCAACAACTACTGTTTGTTCATT TCAGAATTGGGTGCCAACAT1050
AGCAGAATAGGCATTATGCAACAGAGAAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAG1100
ATCCTAA1107
(1 ) SEQ ID No: 1的信息
(a) 序列特征
*长度11G7碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型CDNA
(c) 假设:否
(d) 反义否
(e) 最初来源人工序列
由SEQ ID No: 1中核苷酸所编码的融合免疫毒素蛋白，具有SEQ ID No: 2 中的氨基酸序列。
MAQVQLVQSG AEVKKPGESL KISCKGSGYS FTSYWIAWVR QMPGKGLEYM 50 GLIYPGDSDT KYSPSFQGQV TISVDKSVST AYLQWSSLKP SDSAVYFCAR 100 HDVGYCTDRT CAKWPEYFQH WGQGTLVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSQSVL 150 TQPPSVSAAP GQKVTISCSG SSSNIG丽YV SWYQQLPGTA PKLLIYDHTN 200 RPAGVPDRFS GSKSGTSASL AISGFRSEDE ADYYCASWDY TLSGWVFGGG 250 TKVTVLGAAA GSGSGSGSGS EFMEQAPEDQ GPQREPYNEW TLELLEELKH 300 EAVRHFPRPW LHGLGQYIYE TYGDTWAGVE AIIRILQQLL FVHFRIGCQH 350 SRIG頂WRR ARNGASRS 368(2) SEQ ID No: 2的信息
(a) 序列特征 *长度368残基 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型蛋白质
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源人工序列 实施例2
1 )人源性抗HER-2的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No: 3中碱
基序列。
ATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGG50
GGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCT100
ACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATG150
GGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCA200
AGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGC250
AATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGA300
CATGACGTGGGATATTGCACCGACCGGACTTGCGCAAAGTGGCCTGAATA350
CTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAG400
GCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTG450
ACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTC500
CTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACC550
AGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATCACACCAAT600
CGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTC650
AGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATT700
ACTGTGCCTCCTGGGACTACACCCTCTCGGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGG750
ACCAAGGTCACCGTCCTAGGTGCG774
(1) SEQ ID No: 3的信息
(a) 序列特征 *长度774碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型cDNA
(c) 假设否
(d) 反义否(e )最初来源人源性抗HER-2的单链抗体基因b。
2 )人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3. 9的制备 上游引物V-F: 5， —AAT ， 2CC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT—3，； 下游引物V-R: 5， -CTC TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC-3', 横线所示为添加的酶七5H工一下游分别为WcoJ和峁"。
PCR反应体系为:10 x Pyr。best buffer 5ju1、 dNTP 250jumo1、质 量浓度为0.02% BSA 2jul、上下游引物各25pmo1、模板含scFv-b的质粒 DNA 0. 1 jug (含该质粒DNA的大肠杆菌DH5a ,该质粒DNA的提取操作如 下取lml含该质粒DNA的大肠杆菌DH5a菌液，10000rpm离心30s钟收 集菌体，悬浮于100ja 1溶液I ( 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris'Cl (pH 8.0), 10mmol/L EDTA)中，吹打均勾，冰浴10min。加入200 |il的溶液 II (0. 2mol/LNa0H,质量百分比1%十二烷基磺酸钠SDS ),颠倒混合几次， 于室温下放置5min，再加入150jul冰冷的溶液ni (5 mol/L KAC 60ml， 冰醋酸11.5ml, H20 28.5ml)缓慢倒置混合几次，再于室温下放置10min, 12000rpm离心12min。小心吸取上清液，力口 RNA酶2 |u 1 (10mg/mL), 37°C 温育lh充分降解RNA。加入等体积Tris平衡酚(购自北京宝莱索科技有 限公司)和氯仿异丙醇溶液抽提，12000rpm离心5min,吸出上清液。加入 两倍体积无水乙醇于室温放置2min,沉淀双链DNA, 12000rpm离心5min, 吸出上清液。用lml体积百分比70%乙醇洗沉淀块，12000rpm离心2min, 沉淀块真空干燥或者室温干燥后溶解于30 n 1无菌超纯水)、Pyrobest DNA 聚合酶(TaKaRa公司产品)2U,无菌超纯水补齐体积至50 ja 1。
PCR反应条件为 第一阶段95°C， 5分钟；
第二阶段94。C, 50秒；55°C, 50秒；72°C， 90秒；共30个循环； 第三阶段72。C, IO分钟；
PCR产物的回收PCR扩增产物经质量浓度为1.2%琼脂糖凝胶电泳分 析并分离(参见图l所示)，切下大小为770bp的目的带，按杭州维特洁生 化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收。
4 )回收后产物的双酶切回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶Wcol 和iVotl充分消化，消化产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收， 即得SEQ ID No: 3序列表所述的碱基序列。
实施例3
1 ) HIV-1 Vpr蛋白编码基因vpr，具有序列表SEQ ID No: 5中碱基序列。
ATGGAACAAG CCCCAGAAGA CCAGGGGCCG CAGAGGGAAC CATACAATGA 50 ATGGACATTA GAGCTTTTAG AGGAACTTAA GCATGAAGCT GTTAGACACT 100 TTCCTAGGCC ATGGCTCCAT GGCTTAGGAC AATATATCTA TGAAACCTAT 150 GGGGATACTT GGGCAGGAGT TGAAGCTATA ATAAGAATTT TGCAACAACT 200
8ACTGTTTGTT CATTTCAGAA TTGGGTGCCA ACATAGCAGA ATAGGCATTA 250 TGCAACAGAG AAGAGCAAGA AATGGAGCCA GTAGATCCTA A 291 (1) SEQ ID No: 5的信息 U)序列特征
*长度291碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型cDNA
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源HIV-1病毒
2) HIV-1 Vpr基因vpr的制备 上游引物V—F: 5， - ATA GAA TTC ATG GAA CAA -3， 下游引物V-R: 5， — GCG CTC GAG GTT AGG AT -3， 横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为五cMI和Ii30l。
PCR反应体系为:10 x Pyrobest buffer 5 ja 1、 dNTP 250 jamol 、 0.02% BSA2yl、上下游引物各25pmo1、模板含vpr基因的质粒DNA 0. 1 n g (含 该质粒DNA的大肠杆菌DH5a ,该质粒DNA的提取操作如实施例2中scFv-b 的质粒DNA中所述)、Pyrobest DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50 Hl。
PCR反应条件为 第一阶段95°C, 5分钟；
第二阶段94。C, 45秒；55°C， 45秒；72°C, 50秒；共30个循环； 第三阶段72。C， IO分钟；
PCR产物的回收PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参 见图2所示)，切下大小为300bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公 司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；
回收后产物的双酶切回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶5coi I 和Xkl充分消化，消化产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收， 即得SEQ ID No:5序列表所述的碱基序列。
实施例4
编码连接短肽的DNA Linker序列，具有如下碱基序列(寡聚核苷酸
链)
GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC
1) DNA Linker序列基因的设计合成 设计并合成两条寡聚核苷酸链
正向链L-F: 5, , GGT TCC GGA TCT GGC AGC GGT TCC GGA TCT
9G-3，；
反向链L-R: 5， -AA AGA GCC GGA ACC GCT GCC AGA TCC GGA ACC TGC _3，
上下游分别添加和fcoi I粘末端，所编码的甘氨酸丝氨酸短肽为 (GS) 5序列。
2)寡聚核苷酸链的退火
10x退火杂交缓冲液(SSC)成分:1.5mol/L NaCl, 0. 3M柠檬酸三 钠.2H20,以HC1调pH至7. 0;
退火反应体系10 xSSC buffer 正反寡聚核苷酸链各5 pmol,
无菌超纯水补齐体积至IO Jil;
退火反应条件94°C 10min; 0°C 10min; 72°C 20min
实施例5
1) 融合免疫毒素B-L-Vpr基因的制备
将退火后的linker片段、经Wcol和勘tl双酶切的b片段、经5coi I 和双酶切的vpr片段和经Wcol和Xkl双酶切的pET-28a片段按摩尔 比例为3: 3: 3: 1的比例混合，以T4 DNA连接酶16'C连接，构建融合免疫 毒素表达载体pET-28a-b-l-vpr。连接产物转化coii BL21(DE3)感受态 细胞(转化搡作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，LG. 塞德曼，J. A.史密斯，L斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约 John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 ),以50|ig/ml的卡那霉
素抗性筛选转化子。
2) 融合免疫毒素B-L-Vpr基因的验证
将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA (质粒DNA提取方法按J.萨 姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷 泉港出版社2001年第三版P27-30 ),经Wcol和双酶切鉴定(参见附 图3所示)，并以鉴定正确的重组克隆质粒为模板，用T7启动子和终止子 为引物，以Sanger双脱氧末端终止法测序证实，参见SEQ ID No: 1序列表 所示的碱基序列。
实施例6融合免疫毒素B-L-Vpr的表达及纯化
1 )融合免疫毒素B-L-Vpr的表达接种转化了 pET-28a-b-l-vpr质粒 的￡ coH BL21 (DE3)单菌落于含50)ig/ml的卡那霉素的液体LB培养基中， 过夜活化培养，以1%体积百分比接种量转接下一级，37'C摇床培养至OD自 为O. 6,加入终浓度1. 0mmol/L的IPTG, 37。C诱导表达6小时。离心收集菌体。
2)融合免疫毒素B-L-Vpr的变性收集诱导表达后的菌体，每100ml 原培养物的菌体重悬于10ml 20mmol/L Tris-HC1 pH7. 5的缓冲液，于0°C 超声破碎直至菌液变得清亮，12000g离心20min收集包涵体沉淀。每100ml 原培养物的包涵体以10ml包涵体清洗溶液(2M尿素，lOmMTris-HCl， 0. 5%Triton X 100, pH 8.0)重悬，室温下放置10min,期间不断振荡摇匀， 12000g离心20min,弃上清。将每100ml原培养物的清洗后的包涵体以10ml 包涵体变性缓冲液(0. 5 MNaCl, 8M尿素，5mM咪哇，20mM Tirs-HC1 pH8. 0 ) 重悬，室温下放置30min,期间不断振荡摇匀使包涵体蛋白充分溶解，12000g 离心40min,保留上清部分。
3) 融合免疫毒素B-L-Vpr的纯化将上清部分以0. 3ml/min的流速上 样于包涵体变性缓冲液平衡好的Ni亲和层析柱，以包涵体变性缓冲液平衡 至基线，用含40隱ol/L咪唑的包涵体变性缓冲液洗去杂蛋白，用含 80mmol/L咪唑的包涵体变性缓冲液洗脱融合免疫毒素蛋白B-L-Vpr,收集 目的蛋白峰。
4) 融合免疫毒素B-L-Vpr的复性将洗脱下的纯化的变性目的蛋白 置于处理好的透析袋中，每10ml纯化的变性目的蛋白置于1L的复性缓冲 液(含400mM L-蛋白氨酸(L-arginine)、 lmM还原型谷胱甘肽(GSH )和 0. 2mM氧化型型谷胱甘肽(GSSG)的PBS, pH7. 9 )中透析复性。透析操作 于4。C进行，缓慢搅拌使透析充分均匀，每4h更换一次透析缓冲液，共三 次。最后将透析袋置入大量PBS缓冲溶液中继续于4'C缓慢搅拌透析过液。 12000g离心20min,取上清以SDS-PAGE电泳(电泳条件50伏特，30分 钟，然后再120伏特，2小时)(参见图4),考马斯亮蓝染色分析复性的融 合免疫毒素B-L-Vpr (参见SEQ ID No: 2序列表所示的氨基酸序列)(电泳 缓冲液配方Tris 15.lg,甘氨酸94, Og， SDS 5. Og,加水至5000ml,处 理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81和 P87 )。
实施例6
融合免疫毒素B-L-Vpr生物学活性研究 1 )融合免疫毒素B-L-Vpr特异性结合细胞ELISA实验 以1 x 105cel ls/孔接种MCF-7细胞(无HER-2受体表达)、SK-Br-3细 胞(HER-2受体过表达)于96孔板，待细胞贴壁后去除培养基，PBS洗2 次；每孔加150|Lil 4%多聚甲醛，室温固定15min,用无菌超纯水洗板3 次；每孔加250ml的含质量浓度2。/。BSA的PBS, 37。C封闭lh,用无菌超纯 水洗板3次；将融合免疫毒素蛋白B-L-Vpr以含2%BSA的PBS稀释成 10ug/ml浓度，每孔加50yl，每样3个复孔，37。C温育lh，无菌超纯水 洗板3次；以含2。/。BSA的PBS将兔抗His-tag抗体稀释1000倍，每孔加 50yl, 37。C温育lh,用无菌超纯水洗板3次；以含2 % BSA的PBS将FITC 标记的羊抗兔抗体稀释64倍，每孔加50pl，以锡纸包裹培养板，避光37 'C温育lh,用无菌超纯水洗板3次；以不加融合免疫毒素作为对照孔，同 时设BSA平行对照，其他操作同上；酶标仪检测荧光，激发光波长495nm、 发射光波长525nm。
结合程度=(实验孔-对照孔)参见图5由实验结果可知，纯化复性的融合免疫毒素B-L-Vpr可以特 异性的结合HER-2受体过表达的肿瘤细胞SK-Br-3。
2 )融合免疫毒素B-L-Vpr体外特异性抑瘤活性实验 将MCF-7细胞、SK-Br-3细胞以5xl()4cells/孔加入96孔板,将融合 免疫毒素B-L-Vpr及单独表达的Vpr蛋白(参见序列表5中的碱基序列所 编码的蛋白)分别以不同浓度加入各孔，同时设空白对照孔(仅加培养基 RPMI-1640 )、肿瘤细胞对照孔(仅加肿瘤细胞)，每样3个复孔。同样方法 以BSA为阴性对照设各孔。按常规条件(37'C、 5%0)2浓度)培养72h,加 入50ul/孔的MTT液(含0. 5 %四甲基偶氮唑盐的PBS )。继续培养4h, 1000g 离心收集细胞，加入DMS0120ul/孔，溶解15min后，酶标仪上以570nm测 定各孔的吸光值。
抑瘤率(Tumor growth inhibition, % )=100-[(实验孔_空白对照孔)/ (肿瘤细胞对照孔-空白对照孔)]x100。
参见图6、 7实验结果显示，纯化复性的融合免疫毒素B-L-Vpr可以 对HER-2受体过表达的肿瘤细胞SK-Br-3产生特异性的靶向杀伤作用，其 作用效果明显强于单独Vpr蛋白。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法
〈130〉
<160> 6
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 1107
〈212> DNA
〈213〉 人工设计
〈220〉
<221〉 CDS
<222> (1)..(1107)
<223>
〈400〉 1 atg gcc cag Met Ala Gin 1
gtg Val
cag Gin 5
ctg gtg cag tct Leu Val Gin Ser
ggg GIy 10
gca Ala
gag Glu
gtg aaa Val Lys
朋g ccc Lys Pro 1^
48
ggg gag tct ctg aag ate t.cc tgt aag ggt tct gga tac age ttt acc Gly (ilu Ser Leu lie Ser Cvs Lvs My Ser Gly Tvr Ser Phe Thr 20 25 - 30
96
age tac tgg ate gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag Ser Tyr Trp lie Ala Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu (}lu 35 40 45
144
tac atg ggg etc ate tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac age ccg Tyr Met GIy Leu lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro '50 55 60 '
192
tec ttc caa ggc cag gtc acc ate tea gtc gac aag tec gtc age act Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Val Asp Lvs Ser Val Ser Thr 65 70 75 80
240
gcc tac ttg caa tgg age agt, ctg aag ccc teg gac age gcc gtg tat Ala Tvr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95
288
ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc acc gac egg act. tgc gca Phe Cvs Ala Arg His Asp Val (ily Tvr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala 100 li)5 110
336
aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gin His Trp Gly Glri Gly Thr I一eu Val Thr
384
13序列表 125
gtc tec tea ggt gga ggc ggt tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt, ggc Val Ser Ser Gly Glv Gly Gly Ser G1y Glv Glv Gly Ser Glv Glv Gly 130 13纟 14b
432
gga tcg cag tct gtg t1:g acg cag ccg ccc tea gtg tct gcg gcc cca Glv Ser Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro 145 150 155 160
480
gga cag aag gtc acc ate tec tgc tct gga age age tec aac att ggg Giy Gin Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Glv 165 170 175 '
528
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576
etc etc ate tat gat cac acc aat egg ccc gca ggg gtc cct gac cga Leu Leu lie Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg 195 200 205
624
ttc tct ggc tec aag tct ggc acc tea gcc tec ctg gcc ate agt ggg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly 210 21^ 220 '
672
ttc egg tec gag gat gag get gat tat tac tgt gcc tec tgg gac tac Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala人sp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr 225 230 235 2^10
720
acc etc tcg ggc tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag gtc acc gtc eta Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Glv Glv Gly Thr Us Val Thr Val Leu 245 250 255
768
ggt gcg gcc gca ggt tec gga tct ggc age ggt tec gga tct, gaa ttc Gly Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glv Ser Gly Ser Glu Phe 260 26^ 270
816
atg gaa caa gcc cca gaa gac cag ggg ccg cag agg gaa cca tac aat Met Glu Gin Ala Pro Glu Asp Gin Glv Pro Gin Arg Glu Pro TVr Asn 275 280 285
864
gaa tgg aca tta gag ctt tta gag gaa ctt aag cat gaa get gtt aga Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys His Glu Ala Val Arg 290 295 300
912
cac ttt cct agg cca tgg etc cat ggc tta gga caa tat ate tat gaa His Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Gly Leu Gly Gin Tyr lie Tvr Glu 305 310 31^ 320
960
acc tat ggg gat act tgg gca gga gtt gaa get ata ata aga att ttg Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Gly Val Glu Ala lie lie Arg lie Uu 325 330 335
1008
caa caa eta ctg ttt gtt cat ttc aga att ggg tgc caa cat age aga Gin Gin Leu Uu Phe Val His Phe Arg lie Glv Cvs Gin His Ser Arg 340 345 350
1056
ata ggc lie Gly
lie
355
Met
Gin
c解 Gin
卿 Arg
卿 Arg 360
gca Ala
卿 Arg
Asn
Gly
gcc Ala 365
叫t Ser
卿 Arg
tec Ser
U04
taa
1107
<210〉 2
<211〉 368
〈212〉 PRT
<213〉 人工设计<formula>formula see original document page 15</formula>序列表
290
295
300
His Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Gly Leu Glv Gin Tyr lie Tyr Glu 305 310 31^ 320
Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Glv Val Glu Ala lie lie Arg lie Leu 325 330 335
Gin Gin Leu Leu Phe Val His Phe Arg lie Gly Cvs Gin His Ser Arg 340 345 350
lie Gly lie Met Gin Gin Arg Arg Ala Arg Asn Glv Ala Ser Arg Ser 355 360 365
<210> 3
<211> 774
<212> 腿
〈213〉人源性抗HER-2的单链抗体基因b
<220〉 〈221〉 <222〉 <223>
CDS
(l).. (774)
<400〉 3
atg gcc cag gtg cag Met Ala Gin Val Gin 1 5
ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lvs Pro 10 让
48
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96
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144
tac atg ggg etc ate tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac age ccg Tyr Met Glv Leu lie Tyr Pro Glv Asp Ser Asp Thr L,vs Tvr Ser Pro 50 ' '55 60 :
192
tec ttc caa ggc cag gtc acc ate tea gtc gac aag tec gtc age act Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Val人sp I>vs Ser Val Ser Thr 65 70 75 80
240
gcc tac ttg caa tgg age agt ctg aag ccc teg gac age gcc gtg tat Ala Tvr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr ' 85 90. 95
288
ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc acc gac egg act tgc gca Phe Cvs Ala Arg His Asp Val (^y Tvr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala ' 100 105 110
336
aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc Lvs Trp Pro Glu Tyr Phe Gin His Trp Glv Gin Glv Thr I>eu Val Thr ' 115 120 125
384
gtc tec tea ggt gga ggc ggt tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc Val Ser Ser Glv G1y Gly Glv Ser Glv Glv Glv Glv Ser G1y G1y Glv 130 135 140
432
16序列表
gga tcg cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tea gtg tct gcg gcc cca Glv Ser Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro 150 155 160
480
gga cag aag gtc acc ate tec tgc tct gga age age tec aac att ggg Gly Gin Lys卩al Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly ' 165 170 175
528
aat aat tat gta tec tgg tac cag cag etc cca gga aca. gcc ccc aaa Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Glv Thr Ala Pro Lys '180 185 190
576
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624
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672
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720
acc etc tcg ggc tgg gtg ttc ggc gga ggg a.cc aag gtc acc gtc eta Thr Leu Ser Gly Trp卩al Phe Glv (!lv Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 245 25b 255
768
ggt gcg Gly Ala
774
〈210〉 4 <211> 258 〈212〉 PRT
〈213〉人源性抗HER-2的单链抗体基因b <400> 4
Met Ala Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val
1
5
10
Lys Lys 15
Pro
Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20
25
30
Ser Tyr Trp lie Ala Trp Val Arg Gin Met Pro Glv Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Tyr Met Glv Leu lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro 50 55 60 '
Ser Phe Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr
65
70
75
80
Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr
85
90
95
Phe Cys Ala Arg His Asp Val Glv Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cvs Ala 100 1^5 110
Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gin His Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
17115
120
序列表 125
Val Ser Ser Glv Gly Glv Glv Ser Gly Gly Glv Glv Ser Gly Gly Glv 130 13^ 14b
Glv Ser Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro 14^5 150 155 160
Glv Gin Lvs Val Thr lie Ser Cvs Ser Glv Ser Ser Ser Asn lie Glv ' ' 165 17b 175
Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys 180 185 190
Leu Leu lie Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg 195 200 205
Phe Ser Glv Ser Lvs Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly 210 21^ 220
Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tvr Tyr Cvs Ala Ser Trp Asp Tyr 225 230 ' '235 240
Thr Leu Ser Glv Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 245 25b 255
Gly Ala
〈210〉 <211> <212> <213>
5
291 腿
HIV-l病毒
〈220> <221> <222> <223>
CDS (l)..
(291)
<400〉 5 atg gaa caa Met Glu Gin 1
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48
gaa tgg aca tta gag ctt tta gag gaa ctt aag cat gaa get gtt aga Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lvs His Glu Ala Val Arg 20 25 30
96
cac ttt cct agg cca tgg etc cat ggc tta gga caa tat ate tat gaa His Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Gly Leu G1y Gin Tyr lie Tyr Glu 35 40 4^
144
acc tat, ggg gat act t.gg gca gga gtt gaa get ata ata aga att ttg Thr Tvr G工y Asp Thr Trp AlaVal Glu Ala lie lie Arg lie Leu 50 55 60
192
18序列表
caa caa cta ctg ttt gtt cat ttc aga att ggg tgc caa cat age aga Gin Gin Leu Leu Phe Val His Phe Arg lie Glv Cys Gin His Ser Arg 65 70 75 80
240
ata ggc att atg caa cag aga aga gca aga aat gga gcc agt aga tec lie Glv lie Met Gin Gin Arg Arg Ala Arg Asn Glv Ala Ser Arg Ser 85 90 95
288
taa
291
<210〉 <211〉 〈212〉 <213>
6
96 PRT
HIV-l病毒
<400> 6
Met 1
Glu Gin Ala Pro Glu Asp Gin Gly Pro Gin Arg Glu Pro Tyr Asn 5 10 化
Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lvs His Glu Ala Val Arg 20 25 30
His Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Gly Leu Gly Gin Tyr lie Tyr Glu 35 40 &
Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala Glv Val Glu Ala lie lie Arg lie Leu 5b 55 60
Gin Gin Leu Leu Phe Val His Phe Arg lie Glv Cys Gin His Ser Arg 65 70 75 80
lie Glv lie Met Gin Gin Arg Arg Ala Arg Asn Glv Ala Ser Arg Ser 85 90 9权利要求
1. 一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNo1中碱基序列。
2. —种按权利要求1融合免疫毒素B-L-Vpr基因，其特征在于融合 免疫毒素B-L-Vpr基因所编码的蛋白具有SEQ ID No:2中氨基酸序列。
3. —种按权利要求1所述的融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆，其特 征在于将人源性抗HER-2的单链抗体基因b和HIV-1 Vpr编码基因vpr 通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接，即得 具有序列表SEQ ID No:l中碱基序列的融合免疫毒素B-L-Vpr基因；其中，所述连接短肽DNA Linker 的碱基序列为 GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC;所述的人源性抗HER-2 的单链抗体基因b具有序列表SEQ ID No: 3中碱基序列。
4. 按权利要求3所述的融合免疫毒素b-l-vpr基因的克隆，其特征在 于其中所述的人源性抗HER-2的单链抗体基因b,釆用引物B-F: 5， - AAT ，里gCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT -3， B-R: 5， - CTC ，堅堅ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGTC -3， 通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No:3中碱基序列。
5. 按权利要求3所述的融合免疫毒素b-l-vpr基因的克隆，其特征在 于所述HIV-1 Vpr编码基因vpr,具有序列表SEQ ID No: 5中碱基序列。
6. 按权利要求5所述的融合免疫毒素b-1-vpr基因的克隆，其特征在 于所述HIV-1 Vpr编码基因vpr，釆用引物V-F: 5， - ATA GAA TTC ATG GAA CAA -3， V-R: 5， - GCG CTC GAG GTT AGG AT -3， 通过PCR技术扩增出具有序列表SEQ ID No:5中碱基序列。
7. —种按权利要求1所述的融合免疫毒素B-L-Vpr的异源表达方法， 其特征在于融合免疫毒素B-L-Vpr基因以pET-28a为表达载体，以大肠 杆菌为BL21(DE3)宿主菌，异源表达融合免疫毒素B-L-Vpr包涵体蛋白， 该包涵经变性、纯化、复性得融合免疫毒素B-L-Vpr。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种融合免疫毒素B-L-Vpr基因及克隆和异源表达方法。具有序列表SEQ ID No1中碱基序列，同时融合免疫毒素B-L-Vpr基因所编码的蛋白具有SEQ ID No2中氨基酸序列。本发明以抗HER-2单链抗体作为靶向分子，以Vpr蛋白作为效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B-L-Vpr，并在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白。该融合免疫毒素可对HER-2受体过表达的肿瘤细胞产生特异性的细胞抑制作用。
文档编号C12N15/62GK101463359SQ20071015902
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者张惠文, 张成刚, 徐明恺, 王小刚 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所