用于确定对血管内皮生长因子受体2调节剂的敏感性的生物标志物和方法

专利名称：用于确定对血管内皮生长因子受体2调节剂的敏感性的生物标志物和方法
用于确定对血管内皮生长因子受体2调节剂 的敏感性的生物标志物和方法本申请根据美国法典第35编第119条(e)要求享有2007年4月13曰提 交的美国临时申请序列号60/911,547的权益。本申请援引并入该申请的全部教导。发明领域本发明一般地涉及药物基因组学领域，更具体地说，涉及用于在患者 中监测应答或确定敏感性的的方法和程序，以鉴定个体化的遗传概貌 (genetic profile),这将有助于疾病和病症的治疗。发明背景癌症是一种在组织临床学上具有高度异质性的疾病。尽管人们已经将 常规的组织学和临床特征与预后关联起来，但是相同的肿瘤表观预后类型 在其对治疗的反应性和患:者的结果生存率上存在很大变化。需要新的预后性和预测性标志物(其有助于针对每位患者提供个体化的 疗法)来在临床上准确预测患者对治疗(诸如小分子或生物分子药物)的应 答。这个问题可以通过鉴定能够更好地预测患者对治疗的敏感性的新参数 来解决。患者样品的分类是癌症诊断和治疗的一个关键环节。通过将患者 对治疗的应答与分子和遗传标志物关联起来，可以为非应答性患者提供新 的开发治疗方法的机会，或者可以因为某种治疗的功效的可信度更高而突 出其相对于其它治疗选项的适用性。此外，对有可能对药品、药物或联合 疗法产生良好应答的患者的预选能够减少临床研究需要的患者数量或加快 完成临床开发方案所需的时间(M. Cockett et al., Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000》。确定哪些患者对抗血管发生疗法(诸如VEGFR-2调节剂)有应答或预测 患者的药物敏感性的能力是特别有挑战性的，因为药物应答不仅反映了靶 细胞内在的特性，而且反映了宿主的代谢特性。利用遗传信息预测或监测药物应答的努力主要集中于具有广泛作用的个别基因，诸如多药抗性基因mdrl和mrpl (P. Sonneveld， J. Intern. Med.， 247:521-534 (2000》。随着大规模表征基因mRNA表达模式的微阵列技术的发展，人们已有 可能系统地寻找分子标志物和将癌症分类为迥异的亚群，而这些亚群在传 统的组织病理学方法下是不明显的(J. Khan et al.， Cancer Res.， 58:5009-5013 (1998); A.A. Alizadeh et al" Nature, 403:503-511 (2000); M. Bittner et al.， Nature, 406:536-540 (2000); J. Khan et al" Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001); and T.R. Golub et al" Science, 286:531-537 (1999); U. Alon et al" P.N.A.S. USA, 96:6745-6750 (1999))。这类技术和分子工具为在任意指定时 间监测细胞群内大量转录物的表达水平提供了可能(参见，例如，Schena et al.: Science, 270:467-470 (1995); Lockhart et al" Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchard et al., Nature Biotechnology, 14:1649 (1996); Ashby等的美国专利号5,569,588)。最近的研究显示，由人肿瘤的微阵列分析产生的基因表达信息可以预 测临床结果(L丄van，t Veer et al., Nature, 415:530-536 (2002); M. Shipp et al.， Nature Medicine, 8(1 ):68-74 (2002); G. Glinsky et al.， J. Clin. Invest" 113(6):913-923 (2004))。这些发现为更好地预测和监测个体肿瘤对疗法的应 答，从而极大地改进癌症治疗提供了希望。PCT申请号PCT/US2006/034201提供了可用于鉴定对包含施用 VEGFR-2调节剂的癌症疗法会产生治疗应答的哺乳动物的生物标志物。需要新的和替代性的确定药物敏感性或监测患者应答的方法和程序来 为个体化诊断的开发提供条件。个体化诊断对于基于患者的分子水平应答 的疾病和病症治疗而言是必需的。发明概述本发明还提供用于确定患者对一种或多种二元VEGFR-2 (血管内皮生 长因子受体2)/FGFRl (成纤维细胞生长因子受体l)调节剂的敏感性，或在 分子水平监测对上述调节剂的应答的方法和步骤。本发明还提供在进行治 疗之前确定或预测需要治疗疾病状况(诸如癌症)的个体是否会对治疗产生 应答的方法，其中所述治巧包括施用一种或多种二元VEGFR-2/FGFR1调节 剂(dual VEGFR-2/FGFR1 modulators)。 所述一种或多种二元VEGFR_2/FGFR1调节剂可以是小分子，单克隆抗体，反义分子或它们的等 同物，RNAi分子或者它们的等同物，等等。
本发明还提供用于确定患者对一种或多种血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)调节剂的敏感性或在分子水平上监测对所述调节剂的应答的方 法和程序。本发明还提供在进行治疗之前确定或预测需要治疗疾病状况(诸 如癌症)的个体是否会对治疗产生应答的方法，其中所述治疗包括施用 一种 或多种VEGFR-2调节剂。所述一种或多种VEGFR-2调节剂是可以选自， 例如，以下各项的化合物 一种或多种VEGFR-2特异性配体， 一种或多种 小分子VEGFR-2抑制剂，或一种或多种VEGFR-2结合性单克隆抗体。 本发明提供用于确定患者对一种或多种FGFR-1调节剂的敏感性或在分子 水平上监测对所述调节剂的应答的方法和程序。本发明还提供在进行治疗 之前确定或预测需要治疗疾病状况(诸如癌症)的个体是否会对治疗产生应 答的方法，其中所述治疗包括施用一种或多种FGFR-1调节剂。所述一种或 多种FGFR-1调节剂可以是，例如，选自以下各项的化合物 一种或多种 FGFR-1特异性配体， 一种或多种小分子FGFR-1抑制剂，或一种或多种 FGFR-1结合性单克隆抗体。
一方面，本发明提供 一 种预测哺乳动物对包括施用调节剂的癌症治疗 方法产生治疗应答的可能性的方法，其中所述方法包括(a)测量哺乳动物 中的FGF2水平；(b)将哺乳动物暴露于选自下组的所述调节剂二元 VEGFR-2/FGFR-l调节剂，VEGFR-2调节剂和FGFR-1调节剂；(c)在步骤 (b)的暴露后，测量哺乳动物中的FGF2水平，其中与步骤(a)中测量到的FGF2 水平相比，步骤(c)中FGF2水平的增加指示哺乳动物将对所述癌症疗法产生 治疗应答的可能性增加。
另一方面，生物标志物可以包括FGF2以及一种或多种其他生物标志 物，诸如，FGF1, VEGFR-2或IV型胶原。
本领域技术人员利用已知的技术，可以容易地确定足以指示哺乳动物 是否将会对癌症疗法产生治疗应答的生物标志物水平差异。可以为生物标 志物水平的增加或降低建立关联，以确定所述差异是否足以鉴定出将产生
治疗应答的哺乳动物。对于足够的生物标志物水平差异而言，在一个方面， 可以在确定哺乳动物是否将对治疗产生治疗应答之前预先加以确定。在一 个方面，生物标志物水平的差异是mRNA水平的差异(例如，通过RT-PCR或微阵列来加以测量)，诸如表达水平的至少约两倍的差异，至少约三倍的
差异，或至少约四倍的差异，或更高。在另一个方面，通过质谱法或FISH 或IHC在蛋白水平上确定生物标志物的差异。在又一个方面，生物标志物 水平的差异是指Anova分析中p值〈0.05。在另又一个方面，所述差异是在 ELISA分析法中测定的。
如本文使用的，所谓产生治疗应答，是指癌症的减轻或去除。这表示 患癌个体的预期寿命将延长，或癌症的一种或多种症状将减轻或改善。该 术语涵盖癌性细胞生长的减弱或肺瘤体积的减小。哺乳动物是否产生治疗 应答可以通过本领域公知的许多方法测量，诸如PET成像。
哺乳动物可以是，例如，人，大鼠，小鼠，狗，兔，猪，绵羊，牛， 马，猫，灵长类动物，或猴。
本发明的方法可以是例如体外方法，其中测量哺乳动物的至少一种生 物标志物水平的步骤包括从哺乳动物采取生物样品，然后测量该生物样品 中所述生物标志物的水平。生物样品可以包括，例如,血清，新鲜的全血， 外周血单个核细胞，冷冻的全血，新鲜血浆，冷冻血浆，尿液，唾液，皮 肤，毛嚢，骨髓或肿瘤组织中的至少一种。
至少一种生物标志物的水平可以是，例如，生物标志物的蛋白和/或 mRNA转录物的水平。
在另 一方面，本发明提供一种预测哺乳动物对包含施用调节剂的癌症 疗法产生治疗应答的可纟k性的方法，其中所述方法包括(a)将哺乳动物暴 露于所述调节剂(b)在步骤(a)的暴露后，测量该哺乳动物的FGF2水平， 其中与未暴露于所述调节剂的哺乳动物的生物标志物的水平相比，步骤(b) 中所测FGF2水平的增加提示哺乳动物将对所述癌症疗法产生治疗应答的 可能性增加，其中所述调节剂选自下组二元VEGFR-2/FGFR-l调节剂， VEGFR-2调节剂和FGFR-1调节剂。
另一方面，本发明提供一种确定化合物是否抑制哺乳动物的VEGFR-2 活性的方法，包括(a)将哺乳动物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴 露后，检测哺乳动物的FGF2水平，其中与未暴露于所述化合物的哺乳动 物的FGF2水平相比，步骤(b)中所测FGF2水平的差异指示所述化合物抑制 哺乳动物的VEGFR-2活性。
另一方面，本发明提供一种确定化合物是否抑制哺乳动物的VEGFR-2活性的方法，包括(a)将哺乳动物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴 露后，测量哺乳动物的胶原IV水平，其中与未暴露于所述化合物的哺乳动 物的胶原IV水平相比，步骤(b)中所测得的胶原IV水平的差异指示所述化 合物抑制哺乳动物的VEGFR-2活性
另一方面，本发明提供一种预测癌症患者是否正在接受有效剂量的包 含施用VEGFR-2调节剂的癌症治疗的方法，包括以下步骤(a)测量来自所 述患者样品的胶原IV的水平；和(b)将所述样品的胶原IV水平与标准比较， 其中所述样品的胶原IV水平相对于所述标准减少指示患者正在接受治疗上 有效的剂量的所述癌症治疗的可能性增加，而所述样品的胶原IV水平相对 于所述标准增加或不变指示所述患者正在接受治疗上有效的剂量的所述癌 症治疗的可能性降低。所述癌症治疗可以是本文所列的任意一项治疗，可 以包括，例如，VEGFR-2调节剂的施用，或二元VEGFR-2/FGF调节剂的 施用。在所述患者被预测没有接受有效剂量的所述癌症治疗的情况下，可 能有理由以更高的剂量或给药频率，单独地或与其它治疗联合地施用所述 治疗。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否已暴露于(has been exposed to)抑制VEGFR-2活性的化合物的方法，所述方法包括(a)将哺乳 动物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，检测哺乳动物的FGF2 水平，其中与未暴露于所述化合物的哺乳动物的FGF2水平相比，步骤(b) 中所测FGF2水平的差异指示哺乳动物已经暴露于抑制VEGFR-2活性的化 合物。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否已暴露于(has been exposed to)抑制VEGFR-2活性的化合物的方法，所述方法包括(a)将哺乳 动物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的胶原IV 水平，其中与未暴露于所述化合物的哺乳动物的胶原IV水平相比，步骤(b) 中所测得的胶原IV水平的差异指示哺乳动物已经暴露于抑制VEGFR-2活 性的化合物。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否正在对抑制VEGFR-2 活性的化合物产生应答的方法，所述方法包括(a)将哺乳动物暴露于所述 化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，检测哺乳动物的FGF2水平，其中与未 暴露于所述化合物的哺乳动物的FGF2水平相比，步骤(b)中所测FGF2水平的差异指示哺乳动物正在对抑制VEGFR-2活性的化合物产生应答。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否正在对抑制VEGFR-2 活性的化合物的产生应答的方法，所述方法包括(a)将哺乳动物暴露于所 述化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的胶原IV水平，其中与 未暴露于所述化合物的哺乳动物的胶原IV水平相比，步骤(b)中所测胶原IV 水平的差异指示哺乳动物正在对抑制VEGFR-2活性的化合物产生应答。
在又一方面，本发明提供一种确定化合物是否抑制哺乳动物的FGFR-1 活性的方法，所述方法包括(a)将哺乳动物暴露于所述化合物；和(b)在步 骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的FGF2水平，其中与未暴露于所述化合物 的哺乳动物的FGF2水平相比，步骤(b)中所测FGF2水平的差异指示所述化 合物抑制哺乳动物的FGFR-1活性。
在又一方面，本发明提供一种确定化合物是否抑制哺乳动物的FGFR-1 活性的方法，包括(a)将哺乳动物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴 露后，测量哺乳动物的胶原IV,其中与未暴露于所述化合物的哺乳动物的 胶原IV水平相比，步骤(b)中所测得的胶原IV水平的差异指示所述化合物 抑制哺乳动物的FGFR-1活性。
在另又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否已暴露于(has been exposedto)抑制FGFR-1活性的4t合物的方法，所述方法包4舌(a)将哺乳动 物暴露于所述化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的FGF2水 平，其中与未暴露于所述化合物的哺乳动物的FGF2水平相比，步骤(b)中 所测得的FGF2水平的差异指示哺乳动物已经暴露于抑制FGFR-1活性的化 合物。
在另又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否已暴露于抑制 FGFR-1活性的化合物的方法，所述方法包括(a)将哺乳动物暴露于所述化 合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的胶原IV水平，其中与未暴 露于所述化合物的哺乳动物的胶原IV水平相比，步骤(b)中所测得的胶原IV 水平的差异指示哺乳动物已暴露于抑制FGFR-1活性的化合物。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否正在对抑制FGFR-1活 性的化合物的产生应答的方法，所述方法包括(a)将哺乳动物暴露于所述 化合物；和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的FGF2水平，其中与未 暴露于所述化合物的哺乳动物的FGF2水平相比，步骤(b)中所测FGF2水平的差异指示哺乳动物正在对抑制FGFR-1活性的化合物产生应答。
在又一方面，本发明提供一种确定哺乳动物是否正在对抑制FGFR-1活 性的化合物的产生应答的方法，包括(a)将哺乳动物暴露于所述化合物； 和(b)在步骤(a)的暴露后，测量哺乳动物的胶原IV水平，其中与未暴露于所 述化合物的哺乳动物的胶原IV水平相比，步骤(b)中所测胶原IV水平的差 异指示哺乳动物正在对抑制FGFR-1活性的化合物产生应答。
如本文使用的，"产生应答"涵盖哺乳动物中藉由生物学和细胞学应 答、以及临床应答(比如症状的改善，治疗效果，或不良事件)作出的应 答。
本发明还提供分离的FGF2生物标志物，分离的FGF1生物标志物，分 离的VEGFR-2生物标志物，和分离的IV型胶原生物标志物。本发明的生 物标志物包括全长FGF2、 FGF1 、 VEGFR-2和IV型胶原的核苷酸和氨基酸 序列，及其片段和变体。
本发明还提供包括本发明两种或更多种生物标志物的生物标志物系列。
本发明还提供用于确定或预测患者对包括一种或多种VEGFR-2调节 剂、 一种或多种FGFR-1调节剂或一种或多种二元VEGFR-2/FGFR-l调节
剂的治疗是否敏感或耐药的试剂盒。所述患者可能患有癌症或肿瘤，例如， 结肠癌症或肿瘤。
在一方面，试剂盒包括合适的容器，所述容器包括用于测试来自患者 组织标本或患者样品的细胞的一种或多种本发明的专用微阵列、 一种或多 种VEGFR-2调节剂、 一种或多种FGFR-1调节剂或一种或多种二元 VEGFR-2 / FGFR-1调节剂，和使用说明书。试剂盒还可以包括用于在mRNA 或蛋白水平上监测生物标志物系列之表达的试剂或材料。
在另一方面，本发明提供包括两种或更多种生物标志物的试剂盒。
在又一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括用于测量选自FGF2、 FGF1、 VEGFR-2和IV型胶原中的至少一种物质之存在的抗体和核酸中的 至少一种。在一个方面，所述试剂盒还包括用于确定哺乳动物是否将对癌 症疗法产生治疗应答的说明书，所述癌症疗法包括施用抑制VEGFR-2活性、 FGFR-1活性或二元VEGFR-2/FGFR-1活性的化合物。
本发明还提供用于确定患者将对利用一种或多种VEGFR-2调节剂、一种或多种FGFR-1调节剂或一种或多种二元VEGFR-2/FGFR-l调节剂的治 疗敏感或是耐药的筛选分析法。
本发明还提供一种监测对患有疾病的患者的治疗的方法，其中所述疾 病通过包括施用 一种或多种VEGFR-2调节剂， 一种或多种FGFR-1调节剂， 或一种或多种二元VEGFR-2 / FGFR-1调节剂的方法进行治疗。
本发明还提供在分子水平基于患者应答治疗疾病和病症必需的个体化 遗传概貌。
本发明还提供包括一种或多种生物标志物的专用微阵列，例如寡核香 酸微阵列或cDNA微阵列，所述生物标志物具有与针对一种或多种 VEGFR-2调节剂， 一种或多种FGFR-1调节剂，或一种或多种二元VEGFR-2 / FGFR-1调节剂的敏感性或耐药性相关联的表达模式。
本发明还提供针对 一种或多种本发明的生物标志物的抗体，包括多克 隆或单克隆抗体。
当阅读本发明的详细说明并结合附图后将更好的理解本发明。
附图简述
本专利的文件包含至少一幅彩色的附图。根据要求并支付必要费用后， 专利与商标局将提供包括彩图的本专利的拷贝。

图1 (图1A-1C)显示IV型胶原的IHC结果。 图2 (图2A-2B)显示VEGFR-2的IHC结果。 图3 (图3A-3C)显示FGF1的IHC结果。 图4 (图4A-4D)显示FGF2的IHC结果。
图5显示应答者和非应答者中肿瘤从基线起的百分比变化对FGF2染色 的箱线图。
图6显示Kaplan-Meier曲线，其显示随时间的无进展生存。
图7所示结果显示brivanib调节FGF2生长因子基因表达水平而贝伐 单抗(bevacizumab)不调节，尽管brivanib和贝伐单抗均调节VEGF基因表达 水平。显示的结果获自AFFYMETRIX⑧人阵列。
图8所示结果显示在体外brivanib抑制FGF2诱导下的肿瘤细胞系生 长的IC50值比舒尼替尼(sunitinib)低得多。
图9显示brivanib敏感性和brivanib耐药性胂瘤细胞系中FGFR1、
12FGF2、 VEGFR2和VEGF的mRNA表达水平。
图10所示结果显示当用FGF2刺激增殖时brivanib直接抑制结肠癌 细胞生长。
图11所示结果显示当用FGF2刺激增殖时brivanib直接抑制卵巢癌 和胰腺癌细胞系生长。
图12所示结果显示与贝伐单抗和舒尼替尼相比，brivanib抑制被 FGF2而不是被VEGF刺激的GEO肿瘤细胞生长。
图13显示利用Western印迹所示的brivanib对FGFR1 、 VEGFR2 、 ERK 和AKT的磷酸化的影响。
图14显示对响应于FGF2刺激的67种途径的表达分析。如其所示，只 有FGF途径被显著地诱导。
图15显示用1 |am brivanib或l|iim舒尼替尼处理后，响应于FGF2刺激 的FGF途径的表达分析。如其所示，仅在只有brivanib而非舒尼替尼存在 的条件下FGF2诱导的表达被消除。
发明详述
许多临床前研究已经证明VEGF通过其同源受体(VEGFR跨膜蛋白酪 氨酸激酶家族)在驱动血管生成过程中起着重要作用。尤其值得注意的是， VEGFR-2信号传导途径是肿瘤血管发生的主要驱动者已经得到实验的支 持。VEGFR-2信号途径是在以AVASTIN (贝伐单抗)的批准为基础的癌症 治疗中的一个经临床验证的途径，贝伐单抗通过阻止VEGF配体结合而间 接地抑制该信号途径。Brivanib已经显示可强力抑制VEGFR-2，并可抑制 FGFR-1和FGFR-2——后者是构成血管生成途径的基础的另 一蛋白酪氨酸 激酶受体家族，受FGF生长因子的调节。人们认为brivanib通过抑制多种 重要的血管发生途径(VEGF和FGF),在GEO结肠癌模型中显示比贝伐单 抗更大的对抑制肿瘤生长能力的影响。
该项生物标志物研究已经鉴定出了 一组在分子水平上反映抗血管发生 和抗肺瘤活性的生物标志物，brivanib对它们的影响比贝伐单抗更大。这些 生物标志物受影响的程度与该体内肿瘤模型中观察到的功效高低密切相 关。这些生物标志物在确定癌症患者的最佳抗血管发生疗法方面具有重要 的临床意义。在药物候选物的临床开发中，鉴定出能够使人们快速、容易地读取功 效、药物暴露量或临床应答的生物标志物日益重要。本发明的各实施方案 包括测量分泌蛋白或血浆生物标志物(代表一类生物标志物)的水平的变化。 在一个方面，使用一种易得的材料来源一一血浆样品作为标志物分析的替
代组织(surrogate tissue)。
本发明提供应答特定信号转导途径的调节(respond to the modulation of a specific signal transduction pathway)并且也与VEGFR-2调节剂敏感性或耐 药性相关的生物标志物。这些生物标志物可以用于预测和监测针对一种或 多种VEGFR-2调节剂的应答。在一个方面，本发明的生物标志物选自FGF2、 FGFl、 VEGFR-2和IV型胶原，包括多核苷酸和多肽序列。在另一个方面， 本发明的生物标志物是由于遗传密码的筒并性而编码序列表提供的多肽序 列的核苷酸序列。
所述生物标志物可以作为分子工具用来预测和监测针对影响VEGFR-2 活性或VEGFR-2信号转导途径的VEGFR-2调节剂的应答。
本文使用的"约"当涉及测量值诸如数量、持续时间等等时，其旨在 涵盖从给定值起± 20%或± 10%的变化，更优选± 5%，更优选± 1%，和进 一步更优选的±0.1%,只要这种变化适于实施本文公开的方法。
测量本文所述任一指定标志物水平的方法可以利用本领域公知的方法 来实施，这样的方法包括，但不限于PCR; RT-PCR; FISH; IHC;免疫 检测法；免疫沉淀；Western印迹；ELISA;放射免疫分析；PET成像；HPLC; 表面等离子体共振，和分光光度学；和质谱法，等等。
本发明的生物标志物可以利用本领域已知的任意免疫特异性结合方法
非竟争性分析系统Western印迹，放射免疫分析，ELISA (酶联免疫吸附 测定)，"夹心，，免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀 素反应，免疫扩散测定，凝集测定，补体固定测定，免疫放射测定，荧光 免疫测定，蛋白A免疫测定，略举数例。这类分析法是本领域常规和公知 的(参见,例浊口， Ausubel et al.， eds.， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)，其在此完整引入作为参考)。示 例性的免疫测定法在下文简单描述(但不是意图构成限制)。
免疫沉淀方案通常包括在裂解緩冲液(诸如添加了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA, PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的RIPA緩冲液(1% NP-40 或TritonX-100， 1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS, 0.15MNaCl， 0.01 M磷酸钠 pH7.2， 1。/。TRASYLOL⑧))中裂解细胞群体，向所述细胞裂解物中添加感兴 趣的抗体(即，针对本发明的生物标志物的抗体)，在4'C温育一段时间(例如， 1-4小时)，向所述细胞裂解物添加蛋白A SEPHAROSE⑧和/或蛋白G SEPHAROSE⑧珠子，在4。C温育约1小时或更长时间，用裂解缓沖液清洗 珠子并将珠子重悬于SDS/样品緩冲液。感兴趣的抗体免疫沉淀特定抗原的 能力可以通过例如western印迹分析来力。以评价。本领域才支术人员知道可以 调节哪些参数以增加抗体与抗原的结合和降低背景(例如，用SEPHAROSE 珠子来对细胞裂解物进行预澄清)。关于免疫沉淀方案的进一步讨论可参见， 例^口， Ausubel等人编,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.16.1 (1994)。
Western印迹分析通常包括制备蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶(例如， 8%-20%SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中蛋白样品的电泳，将所述蛋白 样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙膜上，在封 闭溶液(例如，含3。/。BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，用清洗緩沖液(例如， PBS-Tween 20)清洗膜，用封闭緩沖液稀释的一抗(感兴趣的抗体)封闭膜， 用清洗緩沖液清洗膜，用封闭緩冲液稀释的偶联了酶底物(例如，辣根过氧 化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32P或1251)的二抗(其识别一抗， 例如，抗人抗体)封闭膜，用清洗緩沖液清洗膜，和测量抗原的存在。本领 域技术人员了解那些参数可以加以改变来增加检测到的信号并减低背景噪 声。关于western印迹规程的进一步讨论参见，例如，Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1， John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.8.1 (1994)。
ELISA包括制备抗原，用所述抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中 加入偶联有可检测的化合物如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶) 的感兴趣抗体并温育一段时间，和测量所述抗原的存在。在ELISA中感兴 趣的抗体不一定要偶联可测量的化合物；而可以向孔中加入偶联有可测量 化合物的二抗(其识别感兴趣的抗体)。此外，可以不用抗原包被孔，而用抗 体包被孔。在这种情况下，可以在将感兴趣的抗原添加到包被的孔之后， 添加偶联有可测量的化合物的二抗。本领域技术人员了解哪些参数可以加
15以改变来增加测量到的信号，以及本领域已知的ELISA其他变化。关于 ELISA的进一步讨论参见，例如，Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1， John Wiley & Sons, Inc., New York, 11.2.1 (1994)。
或者，可以利用串联质谱、或与串联质谱联用的一维或多维高效液相 层析鉴定生物标志物多肽的相对量。该方法考虑了以下事实即对于利用 与串联质谱联用的一维或多维高效液相层析分离的、身份已知的蛋白而言， 其片段的数目的增加与该蛋白在样品中存在的水平直接相关。这种方法是 本领域技术人员公知的，在许多出版物中有描述，例如，2-D Proteome Analysis Protocols, A丄Link, ed., Humana Press (1999), ISBN: 0896035247; Mass Spectrometry of Proteins and Peptides, J.R. Chapman, ed., Humana Press (2000)， ISBN: 089603609X。
本文使用的术语"调节"或"调节剂"是指特定活性的数量、质量或 作用的增加或降低，或样品中测量到的DNA、 RNA或蛋白水平的增加或降 低。
VEGFR-2调节剂
本文使用的术语"VEGFR-2调节剂"旨在表示一种化合物或药物，它 们是直接或间接调节VEGFR-2活性或VEGFR-2信号转导途径的生物分子 或小分子。因此，本文使用的化合物或药物旨在包括小分子和生物分子。 直接调节或间接调节包括VEGFR-2活性或VEGFR-2信号转导途径的活化 或抑制。在一个方面，抑制是指对VEGFR-2与VEGFR-2配体(诸如，例如， VEGF)之结合的抑制。在另一个方面，抑制是指VEGFR-2激酶活性的抑制。
VEGFR-2调节剂包括，例如，VEGFR-2特异性配体，小分子VEGFR-2 抑制剂，和VEGFR-2单克隆抗体。在一个方面，VEGFR-2调节剂抑制 VEGFR-2活性和/或抑制VEGFR-2信号转导途径。在另 一个方面，VEGFR-2 调节剂是抑制VEGFR-2活性和/或抑制VEGFR-2信号转导途径的VEGFR-2 单克隆抗体。
VEGFR-2调节剂包括生物分子或小分子。
VEGFR-2调节剂还包括反义和RNAi分子。
生物分子包括所有分子量大于450的脂类以及单糖、氨基酸及核苷酸 的聚合物。因此，生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；以及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核香酸包括，例如，DNA 和RNA。
生物分子还包括如上所述的任一分子的衍生物。例如，生物分子的衍 生物包括寡肽、多肽、肽和蛋白的脂类和糖基化衍生物。
生物分子的衍生物还包括寡糖和多糖的脂类衍生物，例如脂多糖。最 典型地，生物分子是抗体，或抗体的功能等同物。抗体的功能等同物具有 与所述抗体相当的结合特性，并抑制表达VEGFR-2的细胞的生长。这类功 能等同物包括，例如，嵌合、人源化和单链抗体及其片段。
抗体的功能等同物还包括具有与所述抗体的可变或高变区氨基酸序列 基本上相同的氨基酸序列的多肽。与另一序列基本上相同，但通过一个或 多个取代、添加和/或缺失而与该另 一序列不同的氨基酸序列视为等同的序 列。优选的，蛋白中被取代、添加或缺失的氨基酸数低于序列中氨基酸残 基数目的50%，更优选低于25%，进一步更优选低于10%。
抗体的功能等同物优选的是嵌合或人源化抗体。嵌合抗体包括非人抗 体的可变区和人抗体的恒定区。人源化抗体包括非人抗体的高变区(CDR)。 人源化抗体中除了高变区以外的可变区(例如，框架可变区)和恒定区是属于 人抗体的。
非人抗体的合适的可变区和高变区可以来源于由任何在体内生成单克 隆抗体的非人哺乳动物所产生的抗体。除了人之外的哺乳动物的合适实例 包括，例如，兔，大鼠，小鼠，马，山羊，或灵长类动物。
功能等同物还包括具有与完整抗体相同或相当的结合特性的抗体片 段。抗体的合适片段包括任何这样的片段，其包含足够的高变(即，互补决 定)区部分，使其能够特异地并以足够亲和力与VEGFR-2酪氨酸激酶结合从 而抑制表达这类受体的细胞的生长。
这类片段可以，例如，包含Fab片段或F(ab')2片段中的之一或二者。 优选的，抗体片段包含完整抗体的所有6个互补决定区，尽管具有不足全 部的互补决定区(诸如3、 4或5个CDR)的功能性片段也包括在抗体片段之 内。
在一个方面，所述片段是单链抗体，或Fv片段。单链抗体是这样的多 区。因此，Fv片段包括完整的抗体联合位点(antibody combining site)。这些链可以在细菌或真核细胞中产生。
抗体和功能等同物可以是任一类免疫球蛋白的成员，诸如IgG， IgM， IgA, IgD，或IgE,及其亚类。
在一个方面，所述抗体是IgGl亚类的成员。功能等同物也可以是任一 上述类型和亚类组合的等同物。
在一个方面，VEGFR-2抗体是CDP-791 (UCB)。在另一个方面， VEGFR-2抗体是IMC-112lb (ImClone Systems)。在又一个方面，VEGFR-2 调节齐寸是AVE-005 (VEGF trap, Regeneron Pharmaceuticals)。
除上述讨论到的生物分子之外，本发明中有用的VEGFR-2调节剂也可 以是小分子。任意不是生物分子的分子在本文中均被认为是小分子。小分 子的一些实例包括有机化合物、有机金属化合物、有机和有机金属化合物 的盐、糖、氨基酸、和核苷酸。小分子还包括这样的分子如果不是由于 它们的分子量未超过450的话，它们本应^C看作生物分子。因此，小分子 可以是分子量为450或更低的脂类，寡糖，寡肽，和寡核苷酸及它们的衍 生物。
需要强调的是，小分子的分子量可以是任意的。它们被称作小分子仅 仅是因为它们的分子量通常低于450。小分子包括在自然界发现的化合物以 及合成化合物。在一个实施方案中，VEGFR-2调节剂是抑制表达VEGFR-2 的肺瘤细胞生长的小分子。在另一实施方案中，VEGFR-2调节剂是抑制表 达VEGFR-2的耐药性肿瘤细胞的生长的小分子。
文献中已经描述了许多可用于抑制VEGFR-2的小分子。 在一个方面，VEGFR-2调节剂是brivanib， 25]-2-氨基丙酸 (2-[4-(4-氟-2-曱基-lH-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,l-f][l,2，4]三嗪-6-基 氧基]-l-曱基乙基)酯，具有如下结构(化合物I):<formula>formula see original document page 18</formula>
在另一个方面，VEGFR-2调节剂选自美国专利号6,869,952 (援引并入本文)中描述的化合物。在又一个方面，VEGFR-2调节剂选自PCT
发明者吉瑟斯·P·帕拉达, 苏珊·M·加尔布雷思 申请人:百时美施贵宝公司