专利名称：一种ca15-3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和
应用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒 及其检测方法和应用
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤 的7-10%，在妇女仅次于子宫癌。它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间，绝经期前后 的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿 瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检 测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。20世纪80年代，专家利用杂交瘤技术获得了能识别肿瘤特异性大分子糖蛋白抗 原(carbohydrate antigen, CA)，并研制了单克隆抗体识别系统。CA是肿瘤细胞的相关 抗原。常用的CA系列有CA 125(卵巢癌相关抗原)；CA 19-9 (胰腺、肠癌相关抗原)；CA 15-3 (乳腺癌相关抗原)。CA153是一种乳腺癌相关抗原，对乳腺癌的诊断和术后随访有一 定的价值。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至 今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种CA15-3基因的原位杂交检测 试剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种CA15-3基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应 用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。CA 15-3 (乳腺癌相关抗原)，CA15-3基因序列号:EF026321，756bp。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂 交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种CA15-3基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。
本发明优点在于
1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌发生动态过程，以及用于乳腺癌预
防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测CA15-3异常表达，在影像医学检 查及其它检查未发现占位性乳腺癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿 块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床乳腺癌病患一个真正的预后早 期诊断。这样才有可能实施乳腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底 根治乳腺癌恶疾。
图1是本发明实施例中乳腺癌症病人CA15-3基因表达图片。图2是正常乳腺CA15-3基因表达图片。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中， 所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体
和标本组成如下
消化液 100 iil/管 11,/盒无色透明液体
保护液 100 yl/管 11,/盒无色透明液体
预杂交液1300 ill/管 2 1,/盒无色透明液体
正义杂交液lOiU/管1管/盒 无色透明液体
反义杂交液lOiU/管1管/盒 无色透明液体
封闭液1000u 1/ ,r i管/盒 无色透明液体
碱性磷酸酶抗体lyl/管1管/盒 无色透明液体
显色剂A175u 1/ 管:1管/‘盒 黄色液体
显色剂B320u 1/ 管；1管/'盒 无色透明液体
缓冲液I 10x90ml/ 瓶1瓶/'盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液II 10x80ml/ 瓶1瓶/'盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液III 10x20m/瓶3瓶/'盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV 10x90ml/ 瓶1瓶/'盒 浅黄色或无色透明液体
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒 无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，100mg 蛋白酶 K，加 DEPC_H20 5ml ；
2、保护液0. 2g的glycine加入1ml的IX缓冲液I ；
3、预杂交液1X缓冲液II 7.5ml
50XD 3ml
10mg/ml yest t--RNA 750ul
llmg/ml SALMONTESTES DNA682ul
0. 04M EDTA 3ml
50% formamide15ml
4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml IX缓冲液III
5、10x缓冲液I (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HP04. 12H20 360g
KC1 2g
KH2P042g加三蒸水至11，并高压灭菌；6、10x 缓冲液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g柠檬酸钠88. 2gHC1 几滴加三蒸水至11，并高压灭菌；7、缓冲液 III :(PH7. 9)Tris 121. lgNaCl 87. 66gHC1 60ml 左右加三蒸水至11，并高压灭菌；8、缓冲液 IV:1M Tris-HC1(PH9. 5) :Tirs 121. lg 加 HC1 3ml 左右，加水 900ml，调 PH 至 9. 5，加 水至11，并高压灭菌；1M NaCl :NaCl 58. 44 加水至 11，并高压灭菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加1X缓冲液I至11，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；10、显色剂 A :NBT lg 加 70% DMF11. 44ml ；11、显色剂8 :BCIP lg 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种CA15-3基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用10ml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心lOmin ；2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 lOmin ；3、弃上清.沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心lOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在_20°C，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将10X缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II ；按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. IX缓冲液II ；3、将10X缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液III;
4、10 X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至100ml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液lOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液lml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗lOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2 X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(lml封闭液加5mllX缓冲液 III) lOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml IX缓冲液III) lOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到30ml 1 X缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的CA15-3基因表达量，用来确定乳腺癌是否发生，因为CA15-3基因在正常人中低表达，如果 CA15-3基因表达高，说明癌症已经发生，从而获得癌症早期基因水平的诊断信息。本发明实施例采样为乳腺癌病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有乳腺癌患者CA15-3基因有过度表达， 细胞染色；正常对照组CA15-3基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。实施例3用CA15-3基因试剂盒检测乳腺癌疾病与用VEGF基因试剂盒检测乳腺癌疾病之间 平行实验。为了科学评价上述基因各自在乳腺癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行 试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例乳腺癌 疾病患者的外周血，同时检测CA15-3基因和VEGF基因(VEGF基因序列号NM-001025366， 6pl2”3665bp cds :492…1730bp。)的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、 结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现 CA15-3基因在乳腺癌疾病病人中表达量比VEGF基因在同一疾病病人的表达量要高。结果 表明，CA15-3基因对乳腺癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比VEGF基因更好，原位杂交 基因表达图显示，CA15-3基因的表达量是70%，VEGF基因的表达量是50%。本发明的试剂 盒作于乳腺癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>756<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1ttctttcatggggaagcagatttgggtaccacccaagtattgactcacccatcaacaacc60
gctatgtatttcgtacattactgccagccaccatgaatattgtacggtaccataaatact120
tgaccacctgtagtacataaaaacccaatccacatcaaaaccccctccccatgcttacaa180
gcaagtacagcaatcaaccctcaactatcacacatcaactgcaactccaaagccacccct240
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gttcctacttcagggccata aagcctaaat agcccacacg ttccccttaa ataagacatc 540acgatggatcacaggtctat caccctatta accactcacg ggagctctcc atgcatttgg 600tattttcgtctggggggtat gcacgcgata gcattgcgag acgctggagc cggagcaccc 660tatgtcgcag tatctgtctt tgattcctgc ctcatcctat tatttatcgc acctacgttc 720aatattacag gcgaacatac ttactaaagt gtatta75权利要求
一种CA15 3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述的 增效剂是碱性磷酸酶抗体。
8.一种CA15-3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述 的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
9.一种CA15-3基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种CA15-3(癌抗原15-3)基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种CA15-3基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测乳腺癌疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993942SQ200910056179
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056179.发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司