专利名称：O157:h7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及0157: H7大肠菌的环介导等温扩增快速^r测试剂盒及枱， 测方法。
(二)
背景技术：
新发现和重新抬头的病原微生物是当前世界医学面临的新课题，肠出 血性大肠菌0157: H7就是其中的一种。0157: H7是肠出血性大肠艾希 菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC )最主要的血清型，于1982 年首次在美国发现，为新发病原菌。其致病性强，感染剂量极低，食入不 足10个细菌即可引起疾病。该菌主要引起出血性肠炎(HC)、溶血性尿 毒综合症(HCS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP),病死率高达30% 以上，是全球关注的世界性公共卫生问题。我国自1988年在江苏徐州检 出首抹EHEC0157: H7后，各地加强了对肠道门诊、畜禽及肉制品等的 食品检测，相继从腹泻病人、家畜、家禽及食品中多次检出0157: H7 大肠菌。通过对近几年我省0157分离林毒力基因检测(PCR法)发现我 省主要以Stx2为主，同时携带Stx2和Stxl基因的菌林则比较少，这与国 内其他省市分离出的大多数菌抹相似，但与Fagan等报道则不同，故本研 究主要选取stx2基因为耙基因进行检测。rfbE与fliC基因分别编码0157: H7菌体抗原O抗原及鞭毛抗原H抗原，针对这两种基因的检测将有助于 0157: H7血清型诊断的进一步验证。
目前，大多数基层实验室鉴定0157: H7大肠菌仍主要依赖于传统培 养方法、生化和血清学鉴定方法，检验方法繁瑣，费时费力，报告检验结果时间长，难以适应快速检测的要求。近年来，PCR法检测0157: H7 大肠菌得到了迅速发展，主要有常规PCR、多重PCR、 Real-time PCR等， 但这些方法均需特殊的仪器，不适合在基层或小型实验室推广使用。 Notomi等是2000年开发出的一种新的DNA环介导恒温扩增法 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),因其具有才喿作筒Y更易4亍、 结果判读简单等特点，可以在基层实验室推广使用，该方法已在一些国家 地区被广泛应用，而国内对此技术研究则刚刚起步，应用LAMP技术检 测0157: H7大肠菌目前未见文献报道。
环介导等温扩增技术原理环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等2000年开发出的一种新的DNA 环介导的恒温扩增法，即利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同耙序列 设计的4-6条引物，特异地识别革巴序列上的6个特定区域，在60 65。C 等温条件下高效特异地扩增目的靶基因，终产物是具有与目的靶基因反 相重复序列的茎环DNA。如果再设计1-2条环引物，则可大大提高扩增 反应速度。该方法的一大特点是，可以通过反应副产物一白色焦磷酸镁沉 淀的产生与否判断靶基因的存在，抑或在体系中加入荧光染色试剂，在紫 外灯下观察，对反应产物实时监测。
发明内容
本发明就是根据上述原理，针对0157: H7的O抗原编码rfbE、志 贺样毒素stx2、 H鞭毛抗原编码flic基因分别设计LAMP引物，提供一种 特异性强、灵敏度高的0157: H7大肠菌的环介导等温扩增快速4企测试剂 盒及4企测方法。
本发明采用的技术方案是
0157: H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、BstDNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸混合物、PCR緩冲液， 所述特异性扩增引物序列如下
rfbE FIP ( O抗原编码rfbE特异性扩增内引物FIP ):
CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT;
rfbE BIP ( O抗原编码rfbE特异性扩增内引物BIP ):
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
rfbE F3 ( O抗原编码rfbE特异性扩增外引物F3 ):
AACAGTCTTGTACAAGTCCA;
rfbE B3 ( O抗原编码rfbE特异性扩增外引物B3 ):
GGTGCTTTTGATATTTTTCCG;
rfbE LB ( O抗原编码rfbE特异性扩增环引物LB ):
CGAAAC A AGGCC AGTTTTTTACC;
stx2 FIP (志贺样毒素stx2特异性扩增内引物FIP ):
GGTTAATAACAGACACCGATGTGG誦ACAGAGATATCGACCCCT;
stx2 BIP (志贺样毒素stx2特异性扩增内引物BIP ):
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
stx2 F3 (志贺样毒素stx2特异性扩增外引物F3 ):
GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG;
stx2 B3 (志贺样毒素stx2特异性扩增外引物B3 ):
GGCCACATATAAATTATTTTGCTC;
flic FIP ( H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增内引物FIP ): GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP (H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增内引物BIP):TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3 (H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增外引物F3 ): GAACTGACGGTTC AGGCC;
flic B3 ( H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增外引物B3 ): AGCCATTCAGACCCAGAGT。
上述为试剂盒的组要成分，其他辅助成分可按本领域常规方法选才奪。 其中脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)为dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的 混合，通常为dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物质的量比1: 1: 1: 1的混 合物。
所述试剂盒中还可包括甜菜碱(Betaine )、 MgS04、 MnCl2和钙黄 绿素(Calcein )。本发明方法主要参照2008年Tomita等4艮道，可在LAMP 反应体系中加入适量MgS04、 MnCl2、钙黄绿素，反应结果在白光下通过 肉眼观察绿色是否生成进行判定，实现反应及产物;险测一步完成。该方法 是在Notomi等的方法基础上加以改进的最新方法，结果可通过在白光下 肉眼观察是否产生绿色钙锰复合物来判断靶基因存在与否，它比以往在白 光下通过肉眼观察有否产生白色焦磷S交镁沉淀更易于判断。
本发明还涉及0157: H7大肠菌的环介导等温扩增快速^r测方法，所 述方法包括
(1)设计特异性扩增引物序列如下 r腿FIP:
CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT; rfbE BIP:
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT;
9r舰F3: AACAGTCTTGTACAAGTCCA; r舰B3: GGTGCTTTTGATATTTTTCCG; r舰LB: CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC; stx2 FIP:
GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT; stx2 BIP:
TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; stx2 F3: GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG; stx2 B3: GGCCACATATAAATTATTTTGCTC; flic FIP:
GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP:
TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3: GAACTGACGGTTCAGGCC; flicB3: AGCCATTCAGACCCAGAGT; (2)提取待测样品DNA，在以待测样品DNA为模板、步骤(1)中 序歹'JrfbEFIP、 rfbEBIP、 rfbEB3、 rfbELB、 stx2FIP、 stx2BIP、 stx2 F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3为引物的 反应体系中进行LAMP反应； (3 ) LAMP反应结束后，进行分析，若LAMP反应结果为阳性，则
待测样品中含有0157: H7大肠菌。 所述反应体系中主要成分终浓度组成如下 Bst DNA聚合酶緩冲液 终浓度为1 x引物r舰FIP、 stx2FIP、 flicFIP
各1.2~2.0pM
引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flicBIP
各1.2~2.0pM
引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3
各O.l ~0.5一
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3
各0.1 ~0.5nM
引物rfbE LB、
0.1 -0.5jiM
dNTP
0.4mM~ 1.0 mM
Bst DNA聚合酶
10U/反应
溶剂为DEPC水。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate (焦碳酸二 乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ级纯水。
所述緩冲液终浓度为1 x ，是指緩冲液中各组分在反应体系终浓度与 1 x BstDNA聚合酶緩冲液相同，即表示緩冲液中各组分在反应液中终浓 度如下20mMTris-HCl(pH8.8)、 lOmMKCl, 10mM (NH4)2S04、 4mM MgS04 、 0.1% TritonX-100。
所述反应体系中还包括终浓度如下的组分0.5 1.0M的甜菜碱、 2~6mM的MgS04、 0.3~0.8mM的MnCl2和10~30(iM的钙黄绿素。 所述步骤(2) LAMP反应条件设置为60。Clh， 80。C2min。 具体的，所述方法如下 (1)设计特异性扩增引物序列rfbE FIP、 rfbE BIP、 rfbE F3、 rfbE B3、 rfbE LB、 stx2FIP、 stx2BIP、 stx2F3、 stx2B3、 flicFIP、 flicBIP、 flicF3 和flic B3;
(2 )提取待测样品DNA,配制LAMP反应体系终浓度组成如下 1 OxBst DNA聚合酶緩冲液 终浓度为1 x
引物rfbE FIP、 stx2 FIP、 flic FIP 各1.6(iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flic BIP 各1.6pM
引物rfbEF3、 stx2F3、 flic F3 各0.2(iM
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3 各0.2jxM
引物r舰LB 0.4 jiM
dNTP混合物 0.6mM
甜菜碱 0.8M
钙黄绿素 25|iM
MnCl2 0,5mM
MgS04 4mM
Bst DNA聚合酶 8U/反应
样品DNA 适量 溶剂为DEPC水；
LAMP反应条件设置为60。Clh, 80。C2min;
(3) LAMP反应结束后，肉眼观察产物颜色变化，呈现明显绿色判定为
阳性，即样品含有0157: H7大肠菌，呈现橙色判断为阴性，呈现
橙绿色则通过2%琼脂糖进行凝胶电泳观察条带是否出现，电泳条
带明显者判定为阳性，不明显者判定为阴性(或取相应LAMP产物
2ul再次LAMP，观察颜色变化)。每次试验均做阴阳性对照。 本发明有益效果主要体现在
1. 本方法不需要使用昂贵、精密的仪器设备，仅需一金属裂解仪/恒温水 浴装置；
2. 耗时短，在恒温条件下进行反应，l小时左右即可完成，大大缩短了该 菌的检测周期(从菌抹核酸的提取至检测完成仅需1.5h左右)；
3. 白光下通过肉眼目测反应体系颜色变化即可进行结果判断，实现反应及产物检测一步完成，操作简便；
4. 该方法为快速基因检测提供了又一新的方法手段；
5. 该方法简易、快速、特异、敏感，其特点和优势是，它不仅适合于科 研工作，还可以作为基层检验部门及小型实验室疾病应急诊断等使用，如 对流行病学人员稍加培训，即可自行在应急车上或开展现场流行病学调查 时使用，在快速检测方面有着较为广泛的应用前景。
(四)
图1为16抹0157标准株及地方分离株rfbE基因LAMP扩增结果； 图2为16抹0157标准抹及地方分离抹Stx2基因LAMP扩增结果； 图3为16抹0157标准林及地方分离林fliC基因LAMP扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围
并不仅限于此
实施例1:
准抹0157: H7、地方0157分离抹及其它肠道实验林)进行;险测，将该 结果与普通PCR、定量PCR法结果进行比较，以验证本方法特异性。实 验中大肠菌028ac84-1373、 LT-85-44及84-135其fliC基因LAMP结果为 阳性，结果其普通PCR与定量PCR结果也均为阳性，推测认为这可能与 该三抹菌均携带编码0157: H7鞭毛抗原H抗原的fliC基因有关。
反应体系如下 10x緩冲液
引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP
2.5 " 各1.6pM 1物rfbE BIP 、 stx2 BIP 、 flic BIP 各1.6pM
引物r舰F3、 stx2F3、 flic F3 各0.2jiM
引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3 各0.2|iM 引物rfbE LB 0.4 )iM
dNTP混合物(l: 1: 1: 1) 共0.6mM 甜菜碱 0.8M 钙黄绿素 25 jiM
MnCl2 0.5mM MgS04 4mM Bst聚合酶 8U酶/反应
样品菌4朱DNA 4pL DEPC水补足至25 |u L。
LAMP扩增条件设置为60°C 1 h, 80°C2min。
其中16株0157标准林及地方分离抹rfbE、 Stx2、 fliC基因LAMP 扩增结果分别见图1、图2和图3;(图中1~16菌4朱依次为882364标准 抹、W933标准抹、97隱1 (0157:H7)、 99-1 (0157:H7)、 00-2 ( 0157: H醒)、 00-4 (0157:H7)、 00-5 (0157:H7)、 05-1 (0157:H7)、 00-6 (0157:H7)、 00-7 (0157:H7)、 06-12 (0157:H7)、杭3-325 ( 0157:H-)、杭3-189 (0157:H-)、 HZl-68 (0157:H-)、杭4-257 ( Ol57: H画)、杭3-307 (0157: H-))。
通过实验部分菌抹的LAMP扩增结果，可以看出，使用本发明方法 检测，可针对目标菌抹进行检测鉴定，特异性好。 灵敏度检测
取菌量为5xl07cfU/mL的0157:H7大肠菌，用双蒸水进行IO倍稀释，
14分别从10" ~ 1(rS稀释液中吸取100uL，经100。C15min裂解再高速离心后， 各制成100uL的DNA模板，按照上述条件进行LAMP敏感性试验。
以最低检出稀释度模板量计算灵敏度,本体系检测三种靶基因的最低 检出限均为26cfU/反应，灵敏度高。<formula>formula see original document page 16</formula><211> 21 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223〉人工序列 <400> 4
ggtgcttttg atatttttcc g 21
<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 5
cgaaacaagg ccagtttttt acc 23
<210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 6
ggttaataac agacaccgat gtggacagag atatcgaccc ct 42
<210> 7 <2U> 43 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 7
taaggaatca ccttgcagat aaactagtac attggcatcg tgt 43
<210> 8 <211> 24<formula>formula see original document page 18</formula><213> Unknown <220>
<223>人工序列 <400> 12
gaactgacgg ttcaggcc 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
<400> 13
agccattcag acccagagt 19
权利要求
1. O157H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸混合物、PCR缓冲液，其特征在于所述特异性扩增引物序列如下rfbE FIPCTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT；rfbE BIPTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；rfbE F3AACAGTCTTGTACAAGTCCA；rfbE B3GGTGCTTTTGATATTTTTCCG；rfbE LBCGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC；stx2 FIPGGTTAATAACAGACACCGATGTGGACAGAGATATCGACCCCT；stx2 BIPTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；stx2 F3GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG；stx2 B3GGCCACATATAAATTATTTTGCTC；flic FIPGCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT；flic BIPTGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG；flic F3GAACTGACGGTTCAGGCC；flic B3AGCCATTCAGACCCAGAGT。
2. 如权利要要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括甜菜碱、 MgS04、 MnCl2和钙黄绿素。
3. 0157: H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测方法，所述方法包括(1)设计特异性扩增引物序列如下 r腿FIP: CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT;r舰BIP: TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; rfbEF3: AACAGTCTTGTACAAGTCCA; rfbEB3: GGTGCTTTTGATATTTTTCCG; rfbELB: CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC;stx2 FIP: GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT; stx2 BIP: TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT; stx2 F3: GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG; stx2 B3: GGCCACATATAAATTATTTTGCTC;flic FIP: GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT; flic BIP: TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG; flic F3: GAACTGACGGTTCAGGCC; flicB3: AGCCATTCAGACCCAGAGT;(2 )提取待测样品DNA，在以待测样品DNA为模板、步骤(1 )中序歹'J rfbE FIP、 rfbEBIP、 rfbEF3、 rfbEB3、 rfbELB、 stx2 FIP、 stx2BIP、 stx2F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3为引物的反应体系中进4亍 LAMP反应；(3) LAMP反应结束后，进行分析，若LAMP反应结果均为阳性，则待测样 品中含有产stx2毒力基因的0157: H7大肠菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述反应体系中主要成分终浓度组成Bst DNA聚合酶緩冲液终浓度为lx引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP各1.2~2.0[iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flicBIP各1.2~2.0jaM引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3各O.l ~0.5拜引物rfbEB3、 stx2B3、 flic B3各0.1 ~0.5(iM引物rfbE LB、0.1 ~0.5|iMdNTP0.4mM ~ 1.0 mMBst DNA聚合酶5 10U/反应溶剂为DEPC水。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述反应体系中还包括终浓度如下的组分0.5 1.0M的甜菜石咸、2 6mM的MgSO4、0.3 0.8mM的MnCl2和10~30|iM的钙黄绿素。
6. 如权利要求3 5之一所述的方法，其特征在于所述步骤(2) LAMP反应条件设置为60。Clh, 80。C2min。
7. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )设计特异性扩增引物序列rfbE FIP、 rfbE BIP、 rfbE F3、 rfbE B3、 rfbE LB、stx2 FIP、 stx2 BIP、 stx2 F3、 stx2 B3、 flic FIP、 flic BIP、 flic F3和flic B3;(2 )提取待测样品DNA，配制LAMP反应体系终浓度组成如下10xBst DNA聚合酶緩冲液纟冬浓度为lx引物rfbEFIP、 stx2FIP、 flicFIP各1.6(iM引物rfbEBIP、 stx2BIP、 flic BIP各1.6|xM引物rfbEF3、 stx2F3、 flicF3各0.2一引物rfbEB3、 stx2B3、 flicB3引物rfbE LB0.4 一dNTP混合物0.6mM甜菜碱0駕钩黄绿素MnCl20.5mM MgS04 4mMBst DNA聚合酶 8U /反应样品DNA 适量溶剂为DEPC水；LAMP反应条件设置为60。Clh, 80。C2min;(3) LAMP反应结束后，肉目艮观察产物颜色变化，呈现明显绿色判定为阳性，即样品含有0157: H7大肠菌，呈现;险色判断为阴性，呈现橙绿色则通过2%琼脂糖进行凝胶电泳观察条带是否出现，电泳条带明显者判定为阳性，不明显者判定为阴性。
全文摘要
本发明提供了一种O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒。本发明针对O157:H7的O抗原编码rfbE、志贺样毒素stx2、H鞭毛抗原编码flic基因分别设计LAMP引物，提供一种特异性强、灵敏度高的O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。本发明有益效果主要体现在(1)不需要使用昂贵、精密的仪器设备，仅需一金属裂解仪/恒温水浴装置；(2)耗时短，在恒温条件下进行反应，1小时左右即可完成；(3)白光下通过肉眼目测反应体系颜色变化即可进行结果判断，操作简便；(4)本发明方法简易、快速、特异、敏感，在快速检测方面有着较为广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101487057SQ200910096030
公开日2009年7月22日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者朱水荣 申请人:浙江省疾病预防控制中心