专利名称：一种萤火虫荧光素酶及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种萤火虫荧光素酶及制备方法，具体涉及一种萤火虫荧光素 酶的氨基酸序列以及编码该荧光素酶的DNA分子的碱基序列，利用含有该 DNA分子的重组表达载体和转化体制备萤火虫荧光素酶的方法。
背景技术：
萤火虫荧光素酶(firefly hiciferase)属氧化还原酶类，是一种能将化学能 转化为光能的高效生物催化剂，该萤火虫荧光素酶在ATP、 Mg^和氧气存在时， 以荧光素(hiciferin)为底物，进行氧化反应，发出光子。ATP是所有生物体都 具有的一种重要的能量化学物质。ATP生物发光计数法利用了 ATP与萤火虫荧 光素-荧光素酶复合物的特异生化反应来测定样品中ATP的含量当荧光素底物 和荧光素酶处于过量饱和的情况下，每一分子ATP释放出一个光子，因此光的 强度与检测样本中ATP的水平成正比；高灵敏的ATP荧光检测仪能及时读取释 放光子的数量，以相对发光强度(RLUs)来显示ATP的含量，因此这种发光特 性使得萤火虫荧光素酶能够在各种各样测定ATP的研究中广泛应用。
早期萤火虫荧光素酶的获得主要通过从萤火虫发光器官中提纯得到。Dewet J.R.等于1985年首次克隆了北美萤火虫(P. Pyralis)的荧光素酶基因，并在大 肠杆菌中表达，得到具有生物活性的荧光素酶。与自然提取得到的荧光素酶相 比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同反应条件下酶稳定性也没 有差异。随着基因工程技术的发展，已经有各种重组荧光素酶表达载体和表达 产物应用于各研究领域，但从已有的报道来看，此类重组荧光素酶暴露在外界 时会迅速失去活性，酶活性稳定性低，而且需要各种层析技术分离纯化，导致 现有的萤火虫荧光素酶的制备方法步骤烦琐，耗时，操作麻烦。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的萤火虫荧光素酶，该酶比自然提取到 的荧光素酶或者重组的自然荧光素酶具有更高的酶活性稳定性，这是通过在自 然的荧光素酶蛋白的N端加了一段氨基酸片断形成的，形成的融合蛋白称为 AGG-Luc融合蛋白，这种新的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
本发明的第二个目的是提供编码本发明的萤火虫荧光素酶的DNA分子， 这是一种经密码子优化的萤火虫荧光素酶基因片断，称为Luc基因，其核苷 酸序列如序列表中的序列1所示，其编码的序列是从序列1的5'末端1-1632 位核苷酸。
本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体以及将该重组表达载体转 入宿主细胞得到的转化体，该重组表达载体包含编码萤火虫荧光素酶的DNA 分子，该DNA分子以能够表达本发明的萤火虫荧光素酶的形式存在，这样该 DNA分子导入到宿主细胞中得到转化体后，在加入适当的诱导剂的条件下， 在转化体中按照需要表达蛋白。
作为一种优选的实施方式，该重组表达载体可为在pPLagg-l(苏州浦隆生物有 限公司)的BamHI和HindIII位点间插入经过密码子优化的北美萤火虫(P. Pyralis)荧光素酶基因(Luc基因)第1-1632位脱氧核糖核苷酸得到 pPLagg-l-Luc。在pPLagg-l-Luc表达载体中，萤火虫荧光素酶基因位于高效启 动子T7和乳糖操纵子下游，在beta-异丙基-巯基半乳糖苷(IPTG)存在时能被 高效诱导转录，并翻译生成AGG-Luc融合蛋白。大肠杆菌BL21 ( DE3 ) (Stratagene公司)是一个合适的宿主，可以将pPLagg-l-Luc重组表达载体稳 定地整合到其染色体组中，并受控于乳糖操纵子，因此大肠杆菌BL21 (DE3) 与pPLagg-l-Luc重组表达载体相容，在得到重组菌株BL21(DE3)后，经IPTG 诱导得到重组AGG-Luc融合蛋白。大肠杆菌BL21 (DE3) -pPLagg-Luc，可在 含有蛋白胨、酵母提取物等的丰富培养基中生长，菌体产量大，蛋白表达率高。 本发明的第四个目的是提供一种萤火虫荧光素酶的制备方法，含有Luc基因 的重组表达载体转化入宿主细胞后，得到含有该表达载体的转化体，经培养、 诱导和纯化后得到重组AGG-Luc融合蛋白。重组表达的AGG-Luc融合蛋白在 N端含有AGG蛋白，提高了表达产物的可溶性和稳定性，AGG蛋白可在高盐 条件下沉淀，通过离心即可分离纯化重组AGG-Luc融合蛋白，该制备方法操作 简单，省时，效率高。
本发明利用大肠杆菌偏爱密码子优化的萤火虫荧光素酶基因，构建重组表 达载体pPLagg-l-Luc,转化入大肠杆菌BL21 (DE3)得到工程菌株，利用高 盐条件进行高效纯化，无需任何层析介质，制备方法快速高效，制得的萤火虫 荧光素酶的酶活稳定性得到提高。火虫荧光素酶的试剂和应用该试 剂的测试试剂盒，本发明还提供了检测方法，在检测方法中ATP的检测是使 用了萤火虫荧光素酶的试剂，它是本领域已知的，特征在于萤火虫荧光素酶是 一种本发明的蛋白，本发明的酶蛋白与自然提取的萤火虫荧光素酶或者重组自 然提取的萤火虫荧光素酶相比，酶活可达2.2X101C)RLU/ing。本发明的蛋白、DNA、载体和转化体将通过参照下面的非限制性实施例、 图、表以及序列表，以示例的方式描述。
图1为本发明中的工程菌株BL21 (DE3) -pPLagg-Luc分别在IPTG诱导和未诱导条件下的10%SDS-PAGE电泳图；M:蛋白质分子量标准；U:未诱导条件下；I:诱导条件下；图2为重组萤火虫荧光素酶纯化过程中各步骤产物的10% SDS-PAGE电泳图；M:蛋白质分子量标准；S:纯化前的上清液；SI:第一次离心后的上 清液；D2:第三次离心后的沉淀；S2第二次离心后的上清液；P:最终纯 化产物；图3为利用本发明阐述的制备方法得到的重组萤火虫荧光素酶与野生型 的萤火虫荧光素酶活测定曲线。
具体实施方式
下面将结合附图和序列表来进一步阐述本发明。1、 编码萤火虫荧光素酶的DNA分子的制备 DNA分子的合成采用一种热动力学平衡的由内向外的PCR基因合成方法(Thermodynamically balanced inside曙out (TBIO) PCR-based gene synthesis), 具体内容参见Nucleic Acids Research, 2003， Vol. 31, No. 22，合成的DNA分子的 碱基序列如序列表中的序列l所示。2、 重组萤火虫荧光素酶表达载体pPLagg-l-Luc的构建 根据荧光素酶的cDNA全序列和表达载体pPLagg的多克隆位点序列，设计一对 特异性PCR引物pPLagg-Luc-S:5， GCGCGAATTCGCAGATAAGAATATTTTATATGGG 3" pPLagg- Luc-AS: 5'AGTCAAGCTTCCCATTGGTGTGTTTTTCTAA 3" 其中pPLagg-Luc-S中含有BamHI识别序列；pPLagg-Luc-AS中含有Hindlll识别序列。以荧光素酶的DNA分子为模板，用上述两条引物进行PCR扩增，得到Liic 基因片段(编码萤火虫荧光素酶的基因)；PCR产物纯化后，取2pg加入限制性 内切酶BamHI和Hindlll各10U ( Takara公司)，37度完全酶切后进行琼脂糖 凝胶电泳，用胶回收试剂盒(Axygen公司)回收约1.6kb的Lnc基因酶切片段； 取3fig pPLagg-l(苏州浦隆生物有限公司)表达载体，同样以BamHI和Hindlll 酶切并回收6.5kb载体DNA片段；按如下反应体系进行连接反应lOOng Luc 基因酶切片段，lOng pPLagg-l载体酶切片段，T4DNA连接酶缓冲液ljil， T4 DNA连接酶(NEB公司)ljil， 20度连接反应过夜。连接产物直接转化克隆宿主大肠杆菌DH5a,将重组菌涂布于含有100pg/ml 氨节青霉素的LB琼脂平板，该平板中还含有酵母提取物、蛋白胨、NaCL等， 重组菌在平板中过夜生长后挑取单克隆，用质粒小提试剂盒(Axygen公司)提 取重组质粒，经双酶切和DNA测序鉴定后得到pPLagg-l-Luc重组表达载体。 测序结果表明获得的Luc基因的核苷酸序列是序列表中的序列1，其开放阅读 框自序列表中序列1的5，端1至1632位脱氧核糖核苷酸，编码序列表中序列2 的萤火虫荧光素酶。3、制备重组萤火虫荧光素酶融合蛋白1) 获得含重组表达载体的工程菌株制备大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，将pPLagg-l-Luc重组表达载体转 化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，然后将重组菌涂布于含有100ng/ml氨苄青霉素 的LB琼脂平板，挑取单克隆，并以菌落PCR方法鉴定含有pPLagg-Luc重组 表达载体的BL21 (DE3)工程菌株，将该工程菌株命名为BL21 ( DE3) -pPLagg-Luc。2) 含表达载体的工程菌株的培养与诱导表达接种BL21 (DE3) -pPLagg-Luc工程菌株至10ml含100ng/ml氨苄青霉素的 LB培养基中，37度振荡培养过夜；次日以l: 100接种至1L TB培养液中，37 度振荡培养3小时，至OD600 (菌体密度)为0.6时，加入终浓度为0.5mM的 IPTG， 30度继续震荡培养5小时，诱导重组荧光素酶融合蛋白的表达，同时设立不加入IPTG的样品作为对照，并进行10%SDS-PAGE分析，结果表明，诱 导剂IPTG能明显诱导重组荧光素酶的表达，显示为新出现一条约llOkD的特 异条带，如图l所示。3)重组荧光素酶融合蛋白的纯化按上述步骤二的方法培养并诱导BL21 (DE3) -pPLagg-Luc工程菌株，收集 诱导5小时的培养菌液1L, 8000g室温离心5分钟，弃去上清；菌体沉淀用50ml buffer AGG-A (20mM THs-HCl， pH8.0; 2mM EDTA)重悬；悬浮液以8000g 室温离心5分钟，弃去上清；沉淀用50ml buffer AGG-B(50mM Tris曙HCl, pH8.0; 50mM NaCl， 5%甘油)重悬，悬浮液进行超声破碎(150W， 2分钟)，16， OOOg 4度离心20分钟，弃去沉淀，上清至冰上备用。在50ml超声后上清液中(纯化前的上清液S),加入25ml buffer AGG-C(5M NaCl),充分混匀后置37度5分钟，15， OOOg室温离心15分钟，弃去上清(第 一次离心后的上清液Sl);沉淀用25ml buffer AGG-D ( 1.6 M NaCl)充分重悬 后，15， OOOg室温离心15分钟，弃去上清(第二次离心后的上清液S2);沉淀 以20ml buffer AGG-E ( 50mM Tris隱Cl, pH8.0; 50mM NaCl and 10%甘油) 充分重悬(第三次离心后的沉淀D2)， 15, OOOg离心15分钟，弃去沉淀；收集 上清液(最终纯化产物P)，进行10%SDS-PAGE分析，结果显示最终纯化产物 为一条约llOkD的特异条带，且没有其它杂带，如图2所示，与预期结果相符， 为了显示高盐条件下纯化的过程，对纯化前的上清液S、第一次离心后的上清液 Sl、第二次离心后的上清液S2、第三次离心后的沉淀D2也进行10%SDS-PAGE 分析，如图2所示。 4)酶的保存将纯化产物转移至透析袋中，在buffer AGG-F(20mM Tris-acetate， pH7.4; lmM DTT; lmM EDTA)透析24h;透析后经Amicon离心浓縮管(Millipore 公司)浓缩后，加入甘油至终浓度为50%, -20度避光储存。5)重组萤火虫荧光素酶酶活的测定 对最终纯化产物进行酶活测定，取3次重复实验值。酶活测定反应条件lug纯化产物，1Ommol/L荧光素，15mmol/L MgS04， 1Ommol/L DTT， 30mmol/L Tricine (pH7.8),力卩入不同浓度ATP,在25'C下 反应10秒钟，用Hipro AML-618发光检测仪记录10秒内输出的发光读数即发光量RLU，以此来表示酶活，结果如图3所示，本发明的重组萤火虫荧光素酶(图中标记为pAGG-Luc)的酶活性和稳定性比野生型的萤火虫荧光素酶(图 中标记为wide type Luc)高，酶活可达2.2 X 101QRLU/mg纯化重组蛋白。SEQUENCE LISTING<110> 苏州浦隆生物有限公司<120> —种萤火虫荧光素酶及制备方法<160> 2<170>Patentln version 3.3<210> 1<211> 1632<212> DNA<213> 人工序列<400> 1atggcagata agaatatttt atatgggccc gaaccatttt atcccttgga agatgggacg 60gctggagaac agatgtttga cgcattatct cgttatgcag atattccggg ctgcatagca 120ttgacaaatg ctcatacaaa aga^aatgtt ttatatgaag agtttctgaa actgtcgtgt 180cgtttagcgg ssagttttaa aaagtatgga ttaaaacaaa acgacacaat agcggtgtgt 240agcgaaaata gtctgcaatt tttccttcct gtaattgcat cattgtatct tggaataatt 300gtggcacctg ttaacgataa atacattgaa cgtgaattaa tacacagtct tggt已ttgta 360aaaccacgca tagttttttg ctccaagaat acttttxaaa aagtactgaa tgtaaaatct 420犯attaaaat ctattgaaac t已ttattata ttagacttaa atgatgactt aggaggttat 480caatgcctca acaactttat ttctcaaaat tccgatagta atctggacgt aaaaaaattt 540aaaccstatt cttttaatcg agacgatcag gttgcgttga ttatgttttc ttctggtaca 600actggtctgc cgaagggagt catgct犯ct cacaagaata ttgttgcacg attttctatt 660gcaaaagatc ctacttttgg taacgcaatt已atcccacgt cagcaatttt aacggtaata 720cctttccacc atggttttgg tatgatgacc acattaggat actttacttg tggattccga 780gttgttctaa tgcacacgtt tgaagaaaaa ctatttctac aatcattaca agattataaa 840gtggaaagta ctttacttgt accaacatta atggcatttc ttgcaaaaag tgcattagtt 900gaaaagtacg atttatcgca cttaaaagaa attgcatctg gtggcgcacc tttatcaaaa %0ga犯ttgggg agatggtgaa aa犯cggttt aaattaaact ttgtcaggca agggtatgga 1020ttaacagaaa ccacttxggc tgttttaatt acaccgaaag gtgacgccaa accgggatca 1080actggtaaaa tagtaccatt tcacgctgtt aaagttgtcg atcctacaac aggaaaaatt 1140ttggggccaa atgaacctgg agaattgtat ttta犯ggcc cgatgataat gaagggttat 1200tataataatg aagaagctac taaagcaatt attgataatg acggatggtt gcgctctggt 1260gatattgctt attatgacaa tgatggccat ttttatattg tggscaggct gaagtxactg 1320ggttgcacct gctgaaattg agggaataet cttacaacat 1380ccgtatattg ttgatgccgg cgttactggt ataccggatg aagccgcggg cgagcttcca 1440gctgcaggtg ttgtagtaca gactggaaaa tatctaaacg aacaaatcgt acaagattat 1500gttgccagtc aagtttcaac agccaaatgg ctacgtggtg gggtgatatt tttggatgaa 1560attcccasag gatcaactgg aaaaattgac agaaaagtgt taagacaaat gttagaaaaa 1620cacaccaatg gg 1632<210> 2<211> 544<212> PRT<213> 人工序列<400> 2Met Ala Asp Lys Asn lie Leu Tyr Gly Pro Glu Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp 15 10 15Gly Thr Ala Gly Glu Gin Met Phe Asp Ala Leu Ser Arg Tyr Ala Asp lie Pro 20 25 30 35Gly Cys lie Ala Leu Thr Asn Ala His Thr Lys Glu Asn Val Leu Tyr Glu Glu 40 45 50Phe Leu Lys Leu Ser Cys Arg Leu Ala Glu Ser Phe Lys Lys Tyr Gly Leu Lys 55 60 65 70Gin Asn Asp Thr lie Ala Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe Leu Pro 75 80 85 90Val lie Ala Ser Leu Tyr Leu Gly lie lie Val Ala Pro Val Asn Asp Lys Tyr 95 100 105lie Glu Arg Glu Leu lie His Ser Leu Gly lie Val Lys Pro Arg lie Val Phe 110 115 120 125Cys Ser Lys Asn Thr Phe Gin Lys Val Leu Asn Val Lys Ser Lys Leu Lys Ser 130 135 140lie Glu Thr lie lie lie Leu Asp Leu Asn Asp Asp Leu Gly Gly Tyr Gin Cys 145 150 155 160Leu Asn Asn Phe lie Ser Gin Asn Ser Asp Ser Asn Leu Asp Val Lys Lys Phe 165 170 175 180Lys Pro Tyr Ser Phe Asn Arg Asp Asp Gin Val Ala Leu lie Met Phe Ser Ser 185 190 195Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His Lys Asn lie Val Ala 200 205 210 215Arg Phe Ser lie Ala Lys Asp Pro Thr Phe Gly Asn Ala lie Asn Pro Thr Ser 220 225 230Ala lie Leu Thr Val lie Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Met Thr Thr Leu 235 240 245 250Gly Tyr Phe Thr Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met His Thr Phe Glu Glu Lys 255 260 265 270Leu Phe Leu Gin Ser Leu Gin Asp Tyr Lys Val Glu Ser Thr Leu Leu Val Pro 275 280 285Thr Leu Met Ala Phe Leu Ala Lys Ser Ala Leu Val Glu Lys Tyr Asp Leu Ser 290 295 300 305His Leu Lys Glu lie Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu lie Gly Glu 310 315 320Met Val Lys Lys Arg Phe Lys Leu Asn Phe Val Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr 325 330 335 340Glu Thr Thr Ser Ala Val Leu lie Thr Pro Lys Gly Asp Ala Lys Pro Gly Ser 345 350 355 360Thr Gly Lys lie Val Pro Phe His Ala Val Lys Val Val A印Pro Thr Thr Gly 365 370 375Lys lie Leu Gly Pro Asn Glu Pro Gly Glu Leu Tyr Phe Lys Gly Pro Met lie 380 385 390 395Met Lys Gly Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Ala Thr Lys Ala lie lie Asp Asn Asp 400 405 410Gly Trp Leu Arg Ser Gly Asp lie Ala Tyr Tyr Asp Asn Asp Gly His Phe Tyr 415 420 425 430lie Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu lie Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin Val Ala Pro 435 440 445 450Ala Glu lie Glu Gly lie Leu Leu Gin His Pro Tyr lie Val Asp Ala Gly Val 455 460 465Thr Gly lie Pro Asp Glu Ala Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Gly Val Val Val 470 475 480 485Gin Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Glu Gin lie Val Gin Asp Tyr Val Ala Ser Gin 490 495 500Val Ser Thr Ala Lys Trp Leu Arg Gly Gly Val lie Phe Leu Asp Glu lie Pro 505 510 515 520Lys Gly Ser Thr Gly Lys lie Asp Arg Lys Val Leu Arg Gin Met Leu Glu Lys 525 530 535 540His Thr Asn Gly
权利要求
1、一种萤火虫荧光素酶，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
2、 一种编码权利要求1所述萤火虫荧光素酶的DNA分子，其核苷酸序列 如序列表中的序列l所示。
3、 包括权利要求2所述DNA分子的重组表达载体。
4、 包括权利要求2所述DNA分子的重组表达载体pPLagg-1-Luc。
5、 包括权利要求3所述重组表达载体的转化体。
6、 包括权利要求3所述重组表达载体的大肠杆菌BL21 (DE3) -pPLagg-Luc。
7、 一种制备如权利要求1所述萤火虫荧光素酶的方法，包括将权利要求3 所述重组表达载体转化入寄主细胞，得到如权利要求5所述的转化体，培养转 化体，诱导表达重组的萤火虫荧光素酶后，在高盐条件下沉淀该萤火虫荧光素 酶，即得纯化的萤火虫荧光素酶。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的寄主细胞为大肠杆菌 BL21 (DE3),在上述的分离和纯化步骤，包括(1) 在菌株裂解得到的粗提物中加入buffer AGG-C,充分混匀后置37度5 分钟，15, 000g室温离心15分钟，弃去上清；(2) 沉淀用buffer AGG-D充分重悬后，15, 000g室温离心15分钟，弃去 上清；(3) 沉淀以buffer AGG-E充分重悬，15， 000g离心15分钟，弃去沉淀； 收集上清液，即得到纯化的萤火虫荧光素酶；上述的buffer AGG-C包括5M NaCI; buffer AGG-D包括1.6 M NaCI; buffer AGG-E包括50mM Tris-Cl， pH8.0, 50mM NaCI ， 10%甘油。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于菌株裂解得到粗提物的步骤， 包括(1) 收集诱导表达的培养菌液，8000g室温离心5分钟，弃去上清；(2) 菌体沉淀用buffer AGG-A重悬，悬浮液以8000g室温离心5分钟， 弃去上清；(3) 沉淀用buffer AGG-B重悬，悬浮液进行超声破碎，然后16, OOOg 4 度离心20分钟，弃去沉淀，上清液至冰上备用，该上清夜即为粗提物；上述的buffer AGG-A包括20mM THs-HCl， pH8.0， 2mM EDTA; buffer AGG-B包括50mM Tris-HCl， pH8.0, 50mM NaCI, 5%甘油。
10、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于在得到纯化的萤火虫荧光素酶后，保存该萤火虫荧光素酶，在保存步骤中，将该纯化产物转移至透析袋中，在buffer AGG-F中透析24h，透析后经离心浓缩管浓縮后，加入甘油至终 浓度为50%， -20度避光储存，上述的buffer AGG-F包括20mM Tris-acetate, pH7.4， ImMDTT, ImM EDTA。
11、 一种包含有如权利要求l所述萤火虫荧光素酶的荧光试剂。
12、 一种通过测量ATP来进行检测的测试试剂盒，其特征在于该试剂盒 中包含如权利要求IO所述的荧光试剂。
13、 一种检测方法，是通过测量ATP进行的，其中ATP的测量是通过萤火 虫荧光素和萤火虫荧光素酶反应发光进行的，反应产生的光的量与ATP的量有 关，其特征在于该检测方法中，萤火虫荧光素酶为权利要求1所述的萤火虫 荧光素酶蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种新的萤火虫荧光素酶，该酶是通过在自然的荧光素酶蛋白的N端加了一段氨基酸片断形成的，这样该酶比自然提取到的荧光素酶或者重组的自然荧光素酶具有更高的酶活性稳定性，本发明还公开了一种编码萤火虫荧光素酶的DNA分子以及该荧光素酶的制备方法，利用荧光素酶DNA分子构建重组表达载体，将表达载体转化入宿主细胞，形成转化体，在转化体中诱导表达得到重组荧光素酶，然后通过高盐沉淀进行分离纯化。在高盐条件下沉淀出重组荧光素酶后，通过离心即可分离纯化出该荧光素酶，则该酶的制备方法操作简单，省时，效率高。
文档编号C12N9/02GK101633917SQ20091011594
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者吴一凡, 滨 王 申请人:苏州浦隆生物有限公司