专利名称：一种重组质粒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种重组质料及其构建方法，特别是双启动子双原核表达的重 组质料及其构建方法。
背景技术：
龋病是人类最普遍的感染性疾病之一，其中变形链球菌(6"&印"""^
历"^T^)被认为是主要的致龋菌，国内外的学者一直将变形链球菌作为口腔医
学的一大研究热点，异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)是一 种氧化还原酶，在变形链球菌的三羧酸循环和乙醛酸旁路的碳通量分配中起关 键性调节作用，但通常的质粒存在着对异柠檬酸脱氢酶的表达量低并且可溶性 不高的缺点。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种提高表达蛋白的产量和可溶 性的重组质粒。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述重组质粒的构建方法。 本发明解决技术问题的技术方案为 一种重组质粒，包括载体及基因片断， 所述的基因片断包括含有启动子的吡啶核苷酸转氢酶(UdhA)基因和含有启 动子的异柠檬酸脱氢酶(SmIDH)基因。
所述的载体型号为pBluescript II SK(+); 所述的启动子为lac启动子。
所述的吡啶核苷酸转氢酶(UdhA)基因的登录号为gi:48994873。 所述的异柠檬酸脱氢酶(SmlDH)基因的登录号为gi:1421814。 所述的重组质粒的构建方法，包括以下工序-1、 pUX质粒构建以Ecoh' MG1655的基因组(NC—000913)为模板，进行常规PCR扩增，回 收1.4 kb的PCR产物，插入用双酶切的质粒pBluescriptlISK(+)中，大肠杆
菌，用氨苄青霉素筛选单克隆，即可；
2、 pSX质粒构建
以现有的链球菌异柠檬酸脱氢酶(5izzIDH蛋白质氨基酸序列登录号 AAC44826;基因序列登录号GI:1421814)基因序列为模板，进行常规PCR扩 增，双酶切PCR产物，回收SmIDH基因片段，与双酶切的质粒pBluescriptII SK(+)连接，转化大肠杆菌，用氨苄青霉素筛选单克隆，即可；
3、 pUS质粒构建
用PCR方法扩增hdHJdhA基因片段，以质粒pUX为模板，进行PCR扩增， 双酶切PCR产物，与双酶切的质粒载体pSX连接，转化大肠杆菌，用氨苄青霉
素筛选单克隆，即可。
本发明将Scoh'可溶性吡啶核苷酸转氢酶(UdhA)基因插入载体 pBluescript II SK(+)构建载体pUX ，再将SmIDH蛋白质的基因插入载体 pBluescript II SK(+)构建载体pSX;然后将载体pUX的lac启动子序列和UdhA编 码基因插入pSX载体中，得到双启动子表达载体pUS;再通过SDS-PAGE、 SmIDH的 酶活测定、定量RT-PCR的测定，重组质粒中UdhA的表达促进了SmIDH的表达的表 达量。构建流程简单易行，在此双启动子表达载体系统中，2个外源基因并不 是以融合蛋白形式表达的，而是分别单独表达，因此纯化后的蛋白质不需要任 何处理就能直接用于功能研究和应用，并且2个启动子相同，诱导条件一致， 相同的诱导剂即能同时表达。
本发明与现有技术相比，表达及纯化工艺简便，双启动子表达载体不仅将 为更多难表达的蛋白质提供正确表达的可能性，而且可以提高已经获得表达的 有经济价值的蛋白质的产量，包括药用蛋白及工业用酶，从而降低生产成本， 节约资源。
图l为pUS质粒构建流程图。
图2为Xba I / Xho i双酶切鉴定重组质粒pl)X。
图3为历'/ d III酶切鉴定重组质粒pSX。
图4为尸"I /屈o I双酶切鉴定重组质粒pUS
在图1、图2、图3、图4中Ml为DNA /历/K/ III Marker; 1为经必a I / Z力o I双酶切的质粒pUX， M2为1 kb DNA Marker; 2为经历'/7d III酶切的pSX 质粒，M3为DL 1000 Marker, 4为经尸W I / I双酶切的pUS质粒，11为分 子量为4323 bp的pUX质粒、21为分子量为4143 bp的pSX质粒、31为分子量 为5739 bp的pUS质粒；12为氨苄青霉素(AMP)、 13为lac启动子、14为内切 酶J&I位点2093bp处、15为"G^基因片断、16为内切酶Z力o1位点668 bp， 17为SmlDH基因片断。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
质粒pBluescript II SK(+)来源于Stratagene公司。
￡coh' MG1655 (CGSC弁6300)由美国耶鲁大学的大肠杆菌菌种资源中心提供。
6izzIDH基因来源于美国明尼苏达大学Antony M. Dean教授实验室。
实施例l:
1、 pUX质粒构建
以￡ 力'MG1655的基因组为模板，设计上下游引物 上游引物5' - CGCAGCACTCTAGA CATGCCACATTCCTACGATT - 3'; 下游引物5' - GCCAAACACTCGAG TTAAAACAGGCGGTTTMACCGTTTAAC - 3 进行PCR扩增，反应条件为94 °C 3 min; 94 °C 30 s; 55 °C 40 s; 72 °C 1.5 min; 35次循环；72 °C 10min。分别用Xba I和Xho I双酶切PCR产物，回收约1.4 kb的线性片段，插入用Xbal和Xhol酶切的质粒 pBluescriptlISK(+)中，转化DH5 a ， Amp筛选单克隆，进行酶切鉴定和测序鉴 定，获得pUX。
如图2所示重组质粒大小约为4. 3 kb,由于基因是由Xba I和Xho I双酶切后插入质粒pBluescript II SK(+)的，故用Xba I和Xho I双酶切pUX 后，可以看见两条条带，大小约为1.4 kb的"必^基因片断和2.9 kb的载体 片断。
2、 pSX质粒构建
根据已发表的5MDH基因序列设计引物(5felDH蛋白质氨基酸序列登录号 AAC44826;基因序列登录号GI:1421814)，设计上下游引物
上游引物5' - GCGGCATCTCTAGMTGGCAGAAAAAGTMGTT - 3';
下游引物5' -TATATGTCTCTGCAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTAAATAAGTCAAT AGAAC _ 3;
上游引物加X&I位点，下游引物加尸WI位点，在终止密码子前加了 6-His标签。以质粒pZGP4-SmIDH为模板，进行常规PCR扩增。反应条件为 94 。C 3min; 94 。C 45 s; 57 。C 45 s; 72 。C 1. 5min; 35次循环；72 。C 10min， 用屈a I和Pst I双酶切PCR产物，回收约1. 1 kb的SmIDH基因片段，与屈a I和尸WI酶切的质粒pBluescriptlISK(+)连接，转化DH5 a ， Amp筛选单克 隆，进行酶切鉴定和测序鉴定，获得pSX。
如图3所示，重组质粒大小约为4.1 kb，由于SmIDH基因内部和质粒 pBluescript II SK(+)的MCS各有一个历/ d III酶切位点，故用历7 d III酶 切pSX后，可以看见两条条带，大小约为1.0 kb和3.1 kb。
3、 pUS质粒构建
如图1所示设计一对引物，上游引物加Pstl位点，下游引物加Xhol 位点，PCR扩增lac-UdhA基因片段。上游引物5' - GAGACCTTCTGCAGGAGCGCAACGCAATTAATG - 3';
下游引物5, - CCGGGGGGCTCGAGTTAATGATGATGAT - 3,
以质粒pUX为模板，进行PCR扩增。反应条件为94 。C 3min; 94 °C 30 s; 55 °C 30 s; 72 °C 2 min; 30次循环；72 °C 10min。
用Pst I和Xho I 双酶切PCR产物，与Pst I和Xho I双酶切的质粒载体pSX连接，转化DH5 a ， Amp筛选单克隆，进行酶切鉴定和测序鉴定，获得双启动子双基因表达载体pUS。 重组质粒大小约为5.7 kb，用A"和屈ol双酶切pUS，结果如图4所示， 现2条带，大小约为4.1 kb和1.6 kb，测序结果表明插入的w/W基因与 Genbank公布的序列一致。
实施例2: SmIDH的表达
将实施例1中所制备的的PSX、 pUS菌株进行异丙基-P -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)显示作为对照的含 质粒pSX的重组菌所表达的SmIDH (约44 ku)特异性条带不明显，与含 pBluescript II SK(+)空白质粒的菌株表达相差无几；含质粒pUS的重组菌可 以表达出明显的2条特异性条带，与UdhA (约53 ku)和SmIDH (约44 ku)的 分子量基本一致，表明在双启动子双基因的表达载体系统中，UdhA基因和SmIDH 基因均获得了有效的表达。
实施例3: SmIDH活性染色
将实施例l中所制备的的pSX、 pUS转化大肠杆菌进行表达，制备的粗酶液 进行非变性凝胶电泳，在含有异柠檬酸及NAD+或NADP+的染色缓冲液中进行异 柠檬酸脱氢酶的催化反应，于37 °C温箱显色l-2 h。 IDH活性染色实验显示: pUS和pSX表达的SmIDH能以贴0+为辅酶进行催化反应，但是不能以NADP+为 辅酶进行催化反应，并且相同条件下pUS表达的SmIDH粗酶液表现出更浓厚的 染色条带，反应了pUS更高的表达水平。
实施例4: SmIDH酶活鉴定以异柠檬酸盐(D，L-isocitrate) 为反应底物，NAD+或NADP+为辅酶进行 SmIDH的酶促反应，实施例1中所制备的pSX、 pUS表达的SmIDH在NADP+为 辅酶进行催化反应均没有任何反应，表明SmIDH不能以NADP+为辅酶进行催化 反应。以NAD+为辅酶进行催化反应，pUS表达的SmIDH比pSX表达的活力提 高了5倍。
实施例5: Real-time RT-PCR实验
以16 s RNA为内参，以A co^i和5". M/te"s的IDH基因为对照基因， 将实施例1中所制备的的pSX、 pUS转化大肠杆菌进行表达，RT-PCR的结果显 示，SmIDH的相对mRNA水平是含有pSX质粒的菌株中SmIDH相对mRNA水平的 1.8倍。
权利要求
1、一种重组质粒，包括载体及基因片断，其特征在于所述的基因片断包括含有启动子的吡啶核苷酸转氢酶基因和含有启动子的异柠檬酸脱氢酶基因。
2、 根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于所述的载体型号为 pBluescript II SK(+)。
3、 根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于所述的启动子为lac 启动子。
4、 根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于所述的吡啶核苷酸 转氢酶基因的登录号为gi48994873。
5、 根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于所述的异拧檬酸脱 氢酶基因的登录号为gi24378532。
6、 权利要求1所述的重组质粒的构建方法，包括以下工序(1) 、 pUX质粒构建以￡ co乃'MG1655的基因组为模板，进行常规PCR扩增，回收1.4kb的PCR产 物，插入用双酶切的质粒pBluescriptlISK(+)中，大肠杆菌，用氨节青霉素 筛选单克隆，即可；(2) 、 pSX质粒构建以现有的链球菌异柠檬酸脱氢酶基因序列为模板，进行常规PCR扩增，双 酶切PCR产物，回收SmIDH基因片段，与双酶切的质粒pBluescriptllSK(+)连 接，转化大肠杆菌，用氨苄青霉素筛选单克隆，即可；(3) 、 pUS质粒构建用PCR方法扩增7ac"UdhA基因片段，以质粒pUX为模板，进行PCR扩增， 双酶切PCR产物，与双酶切的质粒载体pSX连接，转化大肠杆菌，用氨节青霉 素筛选单克隆，即可。
全文摘要
本发明公开了一种重组质粒，包括载体及基因片断，所述的基因片断包括含有启动子的吡啶核苷酸转氢酶基因，及含有启动子的异柠檬酸脱氢酶基因。本发明与现有技术相比，表达及纯化工艺简便，双启动子表达载体不仅将为更多难表达的蛋白质提供正确表达的可能性，而且可以提高已经获得表达的有经济价值的蛋白质的产量，包括药用蛋白及工业用酶，从而降低生产成本，节约资源。
文档编号C12N15/63GK101475957SQ20091011609
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者琴 徐, 朱友明, 朱国萍, 鹏 王, 王宝娟, 葛亚东, 许希晨, 赵旵军, 郑恩霞 申请人:安徽师范大学