专利名称：用于增加生物量水解的富含半纤维素酶的组合物的制作方法
技术领域：
本组合物和方法涉及用于改善纤维素材料酶促水解的纤维素酶/半纤维素酶的 酶混合物。背景生物量的主要组分是纤维素和半纤维素。纤维素由β-1，4-连接的葡萄糖残基的 聚合物组成，这些残基装配成更高级的纤维状结构。半纤维素是杂多糖，包括除葡萄糖以外 的单糖，例如D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和4-0-甲基-D-葡糖 醛酸，不仅通过糖苷键而且还通过酯键相连接。半纤维素的组成和结构比纤维素更复杂，在 多种木本植物物种、草本植物和谷类中可以定量且定性的改变。纤维素可以转化为糖，例如葡萄糖，并被多数微生物用作能源，所述微生物包括用 于工业目的的细菌、酵母和真菌。纤维素材料还可由可商购的酶转化为糖，所获得的糖可用 作工业微生物的原料，来生产产品例如塑料和乙醇。然而，目前的纤维素酶产品通常缺少水 解半纤维素材料的能力，半纤维素仍未消耗地保留在生物量组合物中，可以干扰生物量的 处理和处置。因此，仍然需要开发用于同时水解纤维素和半纤维素的有效的酶系统，包括优化 的酶组合的共同产生或混合物，所述酶组合用于将半纤维素寡聚物和聚合物转化为游离戊 糖用于发酵。此类优化的酶系统对提高生物量的效率和经济是理想的。概述本教导内容提供了优化的生物转化酶混合物，生产所述酶混合物的方法，以及使 用优化的生物转化酶混合物将生物量转化为糖的方法。生物转化酶混合物包括完整的纤维 素酶和一种或多种半纤维素酶的混合物，所述酶的选择由预期的生物量底物和处理条件决定。在一个方面，提供了用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的酶混合组合物， 包含(a)第一种酶组合物，包含纤维素酶；(b)第二种酶组合物，包含至少一种选自GHlO或GHll木聚糖酶的木聚糖酶，和(c)第三种酶组合物，包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是 GHlO或GHll木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GHlO或GHll木聚糖酶，其中，与缺少至少一种其它的半纤维素酶的等同的酶混合组合物相比，上述酶混 合组合物提供至少一种的(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。在一些实施方案中，第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。在一 些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN2。在一些 实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶XYN3。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有 与选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %，或甚至至少99 %氨 基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种木聚糖酶具有选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是选自GH54半纤维素酶、GH62半 纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半 纤维素酶、GH28半纤维素酶、GHll半纤维素酶、GHlO半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5半 纤维素酶。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖 苷酶。在特定的实施方案中，木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，阿拉伯呋喃糖苷酶是来 自里氏木霉的ABFl、ABF2或ABF3。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β _木 糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自丝状 真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种其它的半纤维素酶 是木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉半纤维素酶，其选 自α-阿拉伯呋喃糖苷酶I (ABFl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α -阿拉伯呋喃糖 苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I (AGLl)、α -半乳糖苷酶II (AGL2)、α-半乳糖苷酶 III (AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I (AXEl)、乙酰木聚糖酯酶III (ΑΧΕ3)、内切葡聚糖酶VI (EG6)、 内切葡聚糖酶VIII (EG8)、α -葡糖醛酸糖苷酶I (GLRl)、β -甘露聚糖酶(MANl)、多聚半乳 糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I (XYNl)、木聚糖酶II (ΧΥΝ2)、木聚糖酶III (ΧΥΝ3)，和β -木糖 苷酶(BXLl)。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有与选自SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQID NO 17的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中， 至少一种其他的半纤维素酶具有与上述氨基酸序列之一至少85%、至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或甚至至少 99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种其他的半纤维素酶 具有对应上述氨基酸序列之一的氨基酸序列。在另一个方面，提供了用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的方法，包括将 纤维素和半纤维素材料的混合物与下列物质接触(a)第一种酶组合物，包含纤维素酶；(b)第二种酶组合物，包含至少一种选自GHlO或GHll木聚糖酶的木聚糖酶，和
(c)第三种酶组合物，包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是 GHlO或GHll木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GHlO或GHll木聚糖酶，从而水解纤维素和半纤维素材料的混合物，其中，与在缺少至少一种其它的半纤维素酶的条件下等同的接触相比，上述接触 导致至少一种的(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。在一些实施方案中，第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。在一 些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维 素酶混合物。在一些实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶ΧΥΝ2。在一些 实施方案中，第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶ΧΥΝ3。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有与选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种木聚糖酶具有 与选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %，或甚至至少99 %氨 基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种木聚糖酶具有选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维素酶、GH62半纤 维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半纤 维素酶、GH28半纤维素酶、GHll半纤维素酶、GHlO半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5半纤 维素酶。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖 苷酶。在特定的实施方案中，木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，阿拉伯呋喃糖苷酶是来 自里氏木霉的ABFl、ABF2或ABF3。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是β _木 糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。在一些实施方案中，第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自丝状 真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种其它的半纤维素酶 是木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉半纤维素酶，选自 α-阿拉伯呋喃糖苷酶I (ABFl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α-阿拉伯呋喃糖 苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I (AGLl)、α -半乳糖苷酶II (AGL2)、α-半乳糖苷酶 III (AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I (AXEl)、乙酰木聚糖酯酶III (ΑΧΕ3)、内切葡聚糖酶VI (EG6)、 内切葡聚糖酶VIII (EG8)、α -葡糖醛酸糖苷酶I (GLRl)、β -甘露聚糖酶(MANl)、多聚半乳 糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I (XYNl)、木聚糖酶II (ΧΥΝ2)、木聚糖酶III (ΧΥΝ3)，和β -木糖 苷酶(BXLl)。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有与选自SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQID NO 17的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中， 至少一种其它的半纤维素酶具有与上述氨基酸序列之一至少85%、至少90%、至少91%、
7至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或甚至至少
99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶 具有对应于上述氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，纤维素和半纤维素材料的混合物与第一种酶组合物、第二种 酶组合物和第三种酶组合物的接触同时进行。在一些实施方案中，以单一组合物酶混合物提供第一种酶组合物、第二种酶组合 物和第三种酶组合物。根据下列说明，本组合物和方法的这些和其他方面和实施方案是显而易见的。详细说明I.定义除非在本文中另外定义，本文使用的所有的技术和科学术语都具有本领域普通技 术人员通常理解的相同含义。本文提供的小标题不是对发明的各个方面的限制，在一处小 标题下的实施方案可以作为整体用于组合物和方法。前文的概括描述和后文的详细描述都 是示例性的和解释性的，而不是对本文所述组合物和方法的限制。除非另外特定地说明，使 用的单数包括了复数，除非另外特定地说明，使用“或”意指“和/或”。术语“包括”、“包括 的”、“包含了”、“包含”、“包含的”和“包含了”并非意在限制。本文提及的所有专利和出版 物，包括此类专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列，都通过引用清楚地并入本 文中。出于澄清，定义下列术语如本文中使用的，术语“纤维素”指由β (1 — 4)连接的D-葡萄糖单位组成的多 糖，具有通式(C6HltlO5)n。纤维素是绿色植物、多种类型的藻类和卵菌的初生细胞壁的主要组 分。如本文中使用的，术语“纤维素酶”指能够将纤维素聚合物水解成较短的寡聚物和 /或葡萄糖的酶。如本文中使用的，术语“全纤维素酶组合物/制剂/混合物”或类似说法指天然 存在的和非天然存在的组合物，所述组合物包括由生物体(例如丝状真菌)生产的多种纤 维素酶。全纤维素酶组合物的一个实例是培养丝状真菌的培养基，其包括分泌的纤维素 酶，例如预定比例的一种或多种纤维二糖水解酶，一种或多种内切葡聚糖酶，和一种或多种 β-葡糖苷酶。如本文中使用的，“半纤维素”是植物材料的聚合物组分，含有葡萄糖以外的糖单 体，与只含葡萄糖的纤维素不同。除葡萄糖以外，半纤维素可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、 鼠李糖和阿拉伯糖，而木糖是最常见的糖单体。半纤维素含有大量的D-戊糖，偶尔含少量 的L-糖。半纤维素中的糖可以通过酯键和糖苷键连接。半纤维素的示例性形式包括但不限 于半乳聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等。如本文中使用的，术语“半纤维素酶”指能够将半纤维素分裂成其组分糖或较短聚 合物的一类酶，包括内切作用的水解酶、外切作用的水解酶和各种酯酶。如本文中使用的，术语“木聚糖酶”指源自微生物(例如，真菌、细菌)或来自植物 或动物的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽结构域，并具有催化在木聚糖的碳水化合物骨架的 一个或多个不同位置切割木聚糖的能力，包括分枝的木聚糖和低聚木糖。注意木聚糖酶是 一类半纤维素酶。
如本文中使用的，“生物量底物”是既含纤维素又含半纤维素的材料。如本文中使用的，“天然存在的”组合物是自然产生的，或由自然界存在的生物产 生的组合物。如本文中使用的，“变体”蛋白质不同于“亲本”蛋白质，其源自少数氨基酸残基， 例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多个氨基酸残基的 取代、缺失或添加。在一些情况下，亲本蛋白质是“野生型”、“天然的”或“天然存在的”多 肽。变体蛋白质可以描述为与亲本蛋白质具有一定百分比序列同一性，例如至少80%、至 少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97 %、至少98 %，甚至至少99 %同一性，其可以使用本领域已知的任何合适的软件程序确 定，例如在 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. Μ. Ausubel 等人，(编著)1987， Supplement 30，section 7. 7. 18)中描述的。优选的程序包括Vector NTI Advance 9. 0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), GCG Pileup 程序，FASTA (Pearson 等人，(1988) Proc. Natl，Acad. Sci USA 85:2444-2448) 和 BLAST(BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.，和 Altschul 等人，(1997)NAR 25:3389-3402)。另一个 优选的比对程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，优选使用缺 省参数。另一种可使用的序列软件程序是可从Sequence Software Package Version 6.0 中获得的 TFASTA Data Searching Program (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。II.生物转化酶混合物组合物及其使用方法纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性的i3-(l，4)_D-葡聚糖。相反，半纤 维素包括复杂分枝结构的多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖， 并具有多种取代基。由于半纤维素，特别是阿拉伯木聚糖的复杂分枝和异源组成的结果，植 物材料的酶促降解需要一组脱枝和解聚活性的作用。此外，植物材料的降解需要作用于半 纤维素的酶，所述半纤维素同时含有五碳糖(戊糖)，例如木糖和阿拉伯糖，和六碳糖(己 糖)，例如甘露糖和葡萄糖。半纤维素酶促水解为其单体需要具有不同功能的若干半纤维素酶的参与。半纤维 素酶可分为三类一般类别攻击多糖内部键的内切作用酶，从多糖链的还原端或非还原端 持续作用的外切作用酶，以及附属的酶，水解木质素糖苷键的乙酰酯酶和酯酶，例如香豆酸 酯酶和阿魏酸酯酶。尽管一些真菌产生完整的纤维素酶系统，包括外切纤维二糖水解酶(或CBH-型纤 维素酶)、内切葡聚糖酶(或EG-型纤维素酶)和β -葡糖苷酶(或BG-型纤维素酶)，已 知的纤维素酶及其混合物通常对半纤维素具有有限的活性，在水解植物材料中具有有限的 价值。本生物转化酶混合组合物和方法是部分基于这样的观察结果，即纤维素酶和半纤维 素酶的一些组合显著地提高了植物材料水解的效率，主要通过监测葡聚糖和木聚糖的转化 而确定。用于鉴别增加葡聚糖和/或木聚糖水解的纤维素酶/半纤维素酶组合物的示例性 纤维素酶组合物是由丝状真菌(如，里氏木霉)生产的全纤维素酶组合物。组合物包括一些外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶，并补充了其它的葡糖苷酶来增加葡萄糖的释 放。该组合物是可商购的，如 ACCELLERASE 1000 (Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA) oACCELLERASE 1000 包括外切纤维二糖水解酶(S卩，约 50% (wt/wt) CBHI (CEL7A) 和约 14% CBHII (CEL6A))、内切葡聚糖酶(S卩，约 12% EGI (CEL7B)和约 10% EGII (CEL5A)), 和β-葡糖苷酶(即，约5%BGLI(CEL3A))。还可以存在少量的XYN2 (即，少于约1%)。其 他未鉴别的组分也以少于约的量存在。可以使用其它的纤维素酶组合物，包括其它的全纤维素酶混合物和由多种分别分 离的纤维素酶组合成的纤维素酶混合物。优选的纤维素酶组合物包括各至少一种的外切 纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在一些实施方案中，从生物制备包括多 种纤维素酶的完整培养液，所述生物为例如支顶孢(Acremonium)、曲霉(Aspergillus)、 裸孢壳(Emericella)、镰孢(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、毛霉(Mucor)、毁丝霉 (Myceliophthora) >(Neurospora) > /hftife (Scytalidium) >(Thielavia) > Tolypocladium、青霉(Penicillium)或木霉(Trichoderma)，或源自它们的种。组合物还包括至少一种，在一些情况下至少2、3或更多种半纤维素酶。合适的其 它半纤维素酶的实例包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷 酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯聚糖酶、外切半乳聚糖酶，及其混合 物。合适的内切作用的半纤维素酶的实例包括内切阿拉伯聚糖酶、内切阿拉伯半乳聚糖酶、 内切葡聚糖酶、内切甘露聚糖酶、内切木聚糖酶和feraxan内切木聚糖酶。合适的外切作用 的半纤维素酶的实例包括α-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、a-l，2_L-岩藻糖苷 酶、α -D-半乳糖苷酶、β -D-半乳糖苷酶、β -D-葡糖苷酶、β -D-葡糖醛酸糖苷酶、β -D-甘 露糖苷酶、β -D-木糖苷酶、外切葡糖苷酶、外切纤维二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外 切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶，和coniferin β-葡糖苷酶。合 适的酯酶的实例包括乙酰酯酶(乙酰木聚糖酯酶、乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶 和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。优选的，本组合物和方法包括至少一种木聚糖酶，木聚糖酶是特定类型的半 纤维素酶，其切割半纤维素的木聚糖主链。优选的，木聚糖酶是内切-1，4-木聚糖酶 (Ε. C. 3. 2. 1. 8)。已经鉴别和表征了来自真菌和细菌微生物的多种木聚糖酶(参见例 如，美国专利号 5,437,992 ;Coughlin，Μ. P.见上文；Biely，P.等人，(1993)Proceedings of the second TRICEL symposium onTrichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo 1993 ；Souminen, P.禾口 Reinikainen, Τ.(编著),in Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8 :125_135)。在里氏木霉中已经 鉴别了三种特定的木聚糖酶(XYN1、XYN2 和 XYN3) (Tenkanen 等人，(1992)Enzyme Microb. Technol. 14 566 ；Torronen 等人，(1992)Bio/Technology 10 1461 ；和 Xu 等人，(1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 :718)。在标题为"Xylanase fromTrichoderma reesei (来 自里氏木霉的木聚糖酶)”的Saloheimo等人的美国专利号6，555，335和6，768，001中，描 述了分离自里氏木霉的第四种木聚糖酶(XYN4)，以及使用该酶的方法，其通过引用全文并 入到本文中。用于本组合物和方法的示例性木聚糖酶是XYN2和XYN3。XYN2和XYN3的合适的 变体，以及来自其它生物的合适的相关酶，与XYN2或XYN3(即分别是SEQ ID N0:1和2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96 %、至少97 %、至少98 %，或甚至至少99 %的氨基酸序列同一性。除纤维素酶组合物和木聚糖酶外，组合物和方法可以包括一种或多种其它的半纤 维素酶，例如内切作用的半纤维素酶、外切作用的半纤维素酶，和/或酯酶。合适的内切作用的半纤维素酶包括但不限于甘露聚糖-内切-1，4-β _甘露糖苷 酶(Ε. C. 3. 2. 1. 78，也称为β -甘露聚糖酶(mannase)和β -甘露聚糖酶(mannanase))， 其催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖中的1，4，-β-D-甘露糖苷键的随机内切 水解；α-淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 1)，其催化含有三个或多个1，4_ α -连接的D-葡萄糖 单位的多糖中的1，4_ α-D-葡萄糖苷键的内切水解；木聚糖α-1，2-葡糖醛酸糖苷 酶(E.C.3.2. 1. 131，也称为α-葡糖醛酸糖苷酶)，其催化硬木木聚糖主链中的a-D-l， 2-(4-0-甲基)葡糖醛酸基连接的水解；和内切葡聚糖酶(E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、木 质素和谷类的β-D-葡聚糖中的l，4-i3-D-葡糖苷键的内切水解。已经鉴别了适合用于组 合物和方法的多种亚型的内切葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚 糖酶III、内切葡聚糖酶V和内切葡聚糖酶VI。合适的外切作用的半纤维素酶包括但不限于α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半 乳糖苷酶和β-木糖苷酶。α-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为a-N-阿拉伯呋喃糖苷酶 (E. C. 3. 2. 1. 55)，催化末端非还原的α _L_阿拉伯呋喃糖苷残基水解为α _L_阿拉伯糖苷。 可以使用至少三种已知的α “阿拉伯呋喃糖苷酶亚型(即，abfl、abf2和abf3)中的任一 种。α -半乳糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1. 22)催化α _D_半乳糖苷(包括半乳糖寡糖和半乳甘露聚 糖)中末端非还原的α-D-半乳糖残基水解。可以使用三种已知亚型中的任一种，S卩，α-半 乳糖苷酶I(agll)、α-半乳糖苷酶II(ag12)和α -半乳糖苷酶III (ag13)。葡糖淀粉酶 也称为葡聚糖1，4- α -葡糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1. 3)，催化末端1，4_连接的α -D-葡萄糖残基 从链的非还原端连续水解，释放β -D-葡萄糖。β -葡糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1. 21)催化末端非 还原的β -D-葡萄糖残基水解释放β -D-葡萄糖。β -木糖苷酶也称为木聚糖1，4-β -木 糖苷酶(Ε. C. 3. 2. 1. 37)，催化1，4-β -D-木聚糖水解，从非还原末端依次去除D-木糖残基。 包括全纤维素酶混合物，以及木聚糖酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶或者β-木糖苷酶的组合 物对葡聚糖和/或木聚糖转化是特别有效的。合适的酯酶包括但不限于阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶。阿魏酸酯酶也称为阿 魏酸盐酯酶(Ε. C. 3. 1.1. 73)，催化从酯化的糖水解4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酸) 基团，所述糖在“天然”底物中通常是阿拉伯糖。已知的微生物阿魏酸酯酶分泌到培养基 中。在本组合物和方法中可以使用阿魏酸酯酶的三种已知亚型(fael、fae2和fae3)的任 一种。乙酰木聚糖酯酶I (E. C. 3. 1.1.72)催化木聚糖和木-寡糖的去乙酰化，也可用于组 合物和方法。DeGraaff等人的美国专利号5，426，043和5，681，732描述了从真菌来源克 隆和表达乙酰木聚糖酯酶。EP 507 369公开了编码分离自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶的DNA 序列。Christgau 等人的美国专利号 5，830，734，名称为 “Enzyme with acetyl esterase activity (具有乙酰酯酶活性的酶)”，描述了分离多种酯酶用于食品工业。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维素酶、GH62半纤 维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维素酶、GH67半 纤维素酶、GH28半纤维素酶、GHll半纤维素酶、GHlO半纤维素酶、GH3半纤维素酶和CE5
11半纤维素酶。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶选自α-阿拉伯呋喃糖苷酶 I (ABFl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、α -阿拉伯呋喃糖苷酶III (ABF3)、α -半乳 糖苷酶I (AGLl)、α-半乳糖苷酶II(AGL2)、α -半乳糖苷酶III (AGL3)、乙酰木聚糖酯酶 I (AXEl)、乙酰木聚糖酯酶III (ΑΧΕ3)、内切葡聚糖酶VI (EG6)、内切葡聚糖酶VIII (EG8)、 α -葡糖醛酸糖苷酶I (GLRl)、β -甘露聚糖酶(MANl)、多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶 1(父￥附)、木聚糖酶11(1￥拟)、木聚糖酶111(1￥吧)，和β -木糖苷酶(BXLl)，其可来自丝状 真菌，例如里氏木霉。在一些实施方案中，至少一种其它的半纤维素酶具有的氨基酸序列与 选自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID N0:16 禾口 SEQ ID NO :17 的氨基酸序列有至少 80%、至少 85%、 至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%，或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。半纤维素酶(包括木聚糖酶)的变体可包括基本不影响功能，或者给酶增加了有 利特征的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失不在保守基序中，而是限 于保守基序以外的氨基酸序列。示例性取代是保守取代，其保留了相对于亲本氨基酸序列 的电荷、疏水性或侧基大小。保守取代的实例提供在下表中
1权利要求
用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的酶混合组合物，包含(a)第一种酶组合物，其包含纤维素酶；(b)第二种酶组合物，其包含至少一种选自GH10或GH11木聚糖酶的木聚糖酶，和(c)第三种酶组合物，其包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是GH10或GH11木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GH10或GH11木聚糖酶，其中与缺少至少一种其它的半纤维素酶等同的酶混合组合物相比，上述酶混合组合物提供了至少一种(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。
2.权利要求1的组合物，其中第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。
3.权利要求1的组合物，其中第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自 丝状真菌的全纤维素酶混合物。
4.前述权利要求任一项的组合物，其中第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶 ΧΥΝ2。
5.前述权利要求任一项的组合物，其中第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖酶 ΧΥΝ3。
6.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种木聚糖酶具有与选自SEQID Ν0:1或 SEQ ID NO :2的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列。
7.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维 素酶、GH62半纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维 素酶、GH67半纤维素酶、GH28半纤维素酶、GHll半纤维素酶、GHlO半纤维素酶、GH3半纤维 素酶和CE5半纤维素酶。
8.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种其它的半纤维素酶是木糖苷酶或 阿拉伯呋喃糖苷酶。
9.权利要求8的组合物，其中木糖苷酶是来自里氏木霉的BXLl并且阿拉伯呋喃糖 苷酶是来自里氏木霉的ABF1、ABF2或ABF3。
10.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种其它的半纤维素酶是木糖苷酶 和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
11.权利要求10的组合物，其中β-木糖苷酶是来自里氏木霉的BXLl并且阿拉伯呋喃 糖苷酶是来自里氏木霉的ABFl、ABF2或ABF3。
12.前述权利要求任一项的组合物，其中第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖 苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种其 它的半纤维素酶是β“木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
13.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉半纤 维素酶，其选自α -阿拉伯呋喃糖苷酶I (ABFl)、α -阿拉伯呋喃糖苷酶II (ABF2)、α -阿 拉伯呋喃糖苷酶III(ABF3)、α-半乳糖苷酶I (AGLl)、α -半乳糖苷酶II (AGL2)、α-半 乳糖苷酶III (AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I (AXEl)、乙酰木聚糖酯酶III (ΑΧΕ3)、内切葡聚糖酶 VI (EG6)、内切葡聚糖酶VIII (EG8)、α -葡糖醛酸糖苷酶I (GLRl)、β -甘露聚糖酶(MANl)、 多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I (XYNl)、木聚糖酶II (ΧΥΝ2)、木聚糖酶III (ΧΥΝ3)，和 β -木糖苷酶(BXLl)。
14.前述权利要求任一项的组合物，其中至少一种其它的半纤维素酶具有与选自SEQ2ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
15.用于水解纤维素和半纤维素材料的混合物的方法，包括将纤维素和半纤维素材料 的混合物与下列物质接触(a)第一种酶组合物，其包含纤维素酶；(b)第二种酶组合物，其包含至少一种选自GHlO或GHll木聚糖酶的木聚糖酶，和(c)第三种酶组合物，其包含至少一种其它的半纤维素酶，所述半纤维素酶不是GHlO 或GHll木聚糖酶，或者不是与(b)中相同的GHlO或GHll木聚糖酶，从而水解纤维素和半纤维素材料的混合物，其中，与在缺少至少一种其它的半纤维素酶的条件下等同的接触相比，所述接触导致 至少一种(i)增加的葡聚糖转化或(ii)增加的木聚糖转化。
16.权利要求15的方法，其中第一种酶组合物是来自丝状真菌的全纤维素酶混合物。
17.权利要求15的方法，其中第一种酶组合物是补充了额外量的葡糖苷酶的来自 丝状真菌的全纤维素酶混合物。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖 酶 ΧΥΝ2。
19.权利要求15-17任一项的方法，其中第二种酶组合物包含来自里氏木霉的木聚糖 酶 ΧΥΝ3。
20.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种木聚糖酶具有与选自SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
21.权利要求15-17任一项的方法，其中至少一种其它的半纤维素酶选自GH54半纤维 素酶、GH62半纤维素酶、GH27半纤维素酶、GH36半纤维素酶、GH5半纤维素酶、GH74半纤维 素酶、GH67半纤维素酶、GH28半纤维素酶、GHll半纤维素酶、GHlO半纤维素酶、GH3半纤维 素酶和CE5半纤维素酶。
22.权利要求15-17任一项的方法，其中至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷酶或 阿拉伯呋喃糖苷酶。
23.权利要求22的方法，其中所述木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，并且阿拉伯 呋喃糖苷酶是来自里氏木霉的ABFl、ABF2或ABF3。
24.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种其它的半纤维素酶是β-木糖苷 酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
25.权利要求24的方法，其中所述木糖苷酶是来自里氏木霉的BXL1，并且阿拉伯 呋喃糖苷酶是来自里氏木霉的ABFl、ABF2或ABF3。
26.权利要求15-25任一项的方法，其中所述第一种酶组合物是补充了额外量的β-葡 糖苷酶的来自丝状真菌的全纤维素酶混合物，第二种酶组合物包含木聚糖酶，且至少一种 其它的半纤维素酶是β“木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的组合。
27.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种其它的半纤维素酶是里氏木霉 半纤维素酶，其选自α-阿拉伯呋喃糖苷酶I (ABFl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶II(ABF2)、 α -阿拉伯呋喃糖苷酶III (ABF3)、α -半乳糖苷酶I (AGLl)、α -半乳糖苷酶II (AGL2)、α -半乳糖苷酶III (AGL3)、乙酰木聚糖酯酶I (AXEl)、乙酰木聚糖酯酶III (ΑΧΕ3)、内切葡 聚糖酶VI (EG6)、内切葡聚糖酶VIII(EGS)、α -葡糖醛酸糖苷酶I (GLRl)、β -甘露聚糖 酶(MANl)、多聚半乳糖醛酸酶(PEC2)、木聚糖酶I(XYN1)、木聚糖酶II(XYN2)、木聚糖酶 III (ΧΥΝ3)，和 β -木糖苷酶(BXLl)。
28.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种其它的半纤维素酶具有与选自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ IDNO 15, SEQ ID N0:16禾口 SEQ ID NO :17的氨基酸序列至少80%同一性的氨基酸序列。
29.权利要求15-28任一项的方法，其中纤维素和半纤维素材料的混合物与第一种酶 组合物、第二种酶组合物和第三种酶组合物的接触同时进行。
30.权利要求15-28任一项的方法，其中在单一组合物酶混合物中提供第一种酶组合 物、第二种酶组合物和第三种酶组合物。
全文摘要
描述了涉及纤维素酶/半纤维素酶的酶混合物的组合物和方法，用于提高常见于生物量中的纤维素和半纤维素材料的酶促水解。
文档编号C12N9/24GK101978050SQ200980109654
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月21日
发明者E·A·拉雷纳斯, R·M·考德威尔, S·D·鲍尔, S·E·兰兹 申请人:丹尼斯科美国公司