专利名称：酶促过酸制备的控制的制作方法
技术领域：
本发明涉及过酸生物合成和原位酶催化领域。具体而言，本发明提供了使用酶的过氧化物解(perhydrolysis)活性产生过酸的制备控制方法，所述酶在结构上被鉴定为属于糖酯酶的CE-7家族，包括先锋霉素乙酰水解酶(CAH ；E. C. 3. 1. 1. 41)和乙酰木聚糖酯酶 (ΑΧΕ ;E. C. 3. 1. 1. 72)。该酶促方法由羧酸酯底物产生过羧酸。阐明反应pH特征对比活性的影响使得人们能够通过改变包括缓冲液浓度和PH在内的不同参数控制反应。本发明提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂。
背景技术：
过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。已经描述了清洁、灭菌和/或消毒硬质表面、肉产品、活植物组织和医疗设备以杜绝有害微生物生长的方法(美国专利 6，545，047 ；美国专利6，183，807 ；美国专利6，518，307 ；美国专利申请公开20030026846 ； 和美国专利5，683，724)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3，974，082、美国专利5，296，161和美国专利5，364，554)。过酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见Organic Peroxides, Daniel Swern，编辑，第 1 卷，第 313-516 页；Wiley Interscience, New York, 1971) 该反应通常由强无机酸例如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。酶催化剂在使用和/或应用时也能够催化过酸的快速制备，不需要贮藏其浓度可能随时间降低的过酸溶液。一般用于经由与过氧化氢的直接化学反应来产生过酸的高浓度的羧酸不是过酸的酶促制备所需的，其中酶催化的反应可以使用浓度比化学反应中一般使用的浓度低得多的羧酸酯作为底物。酶催化反应可以跨越广泛范围的PH来进行，取决于在给定PH下的酶活性和稳定性，并且取决于在给定pH下对于过氧化物解的底物特异性。酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相应的羧酸的能力(式 1)式1脂肪酶、酯酶或蛋白酶R1COOR^H2O—RfOOH+HOI^。某些酯酶、脂肪酶和蛋白酶还显示出过氧化物解活性，催化来自烷基酯的过酸合成(式2)式2脂肪酶、酯酶或蛋白酶
R1COOR^H2O2 — I^C000H+H( 2。已经发现CE-7类糖酯酶对酯的过氧化物解具有高比活性，尤其是醇、二醇和甘油的乙酰基酯。授予DiCosimo等人的美国专利公开申请11/638,635 ；11/743, 354 ； 11/943，872;和12/143，375公开了结构上归类为糖酯酶CE-7家族成员的酶(例如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[ΑΧΕ])，它们特征在于显著的过氧化物解活性， 将羧酸酯(在存在合适的过氧源如过氧化氢的情况下)转化成过氧羧酸，其浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。在某些反应条件下，CE-7酯酶能够在1分钟内催化制备浓度高达 4000-5000ppm、在5分钟至30分钟内催化制备浓度高达至少9000ppm的过酸(美国专利申请12/143，375，授予DiCosimo等人)。过氧羧酸可能腐蚀某些金属表面，然而，可期望限制在反应期间产生的过酸总量以防止或最小化所得溶液的腐蚀效应。例如，需要在1分钟内制备不超过200ppm至IOOOppm过酸的专利申请常常使用产生的过酸终浓度正好高于这些限制的反应条件。在一个原位制备过酸用于硬质表面消毒的专利申请中，希望具有快速生成期望浓度过酸的能力，其浓度不显著超过有效消毒浓度的上限，从而限制或防止腐蚀该表面的某些组件。在一个原位制备过酸用于漂白衣物或纺织物的专利申请中，也期望对上文生成漂白所需过酸的浓度进行类似的限制。除了催化过酸制备外，CE-7酯酶还能够催化过酸水解以制备羧酸和过氧化氢。因此，在反应条件下所述酶保持其活性较长时间，它可以破坏在酯和过氧化物的第一酶催化反应中生成的过酸，生成羧酸(例如乙酸)作为副产物，该羧酸能赋予消毒溶液难闻的气味。所述酶的这种过酸水解活性也能够损害由CE-7酯酶制备的含过酸制剂经若干个小时或甚至若干天或若干周的长期稳定性，这取决于消毒剂配方中的过酸稳定性。过酸溶液具有广泛应用。尽管在设计高效的和有效的方法制备过酸溶液方面已经取得了进展，仍需要改善的方法。用于制备过酸的原位方法以过酸浓度依赖型方式限制过酸的酶催化制备，该方法将允许以与任务相适应的方式制备目标浓度的过酸。发明概述本文所公开的是制备目标浓度过酸的酶催化方法。酶催化的过酸制备以过酸浓度依赖型方式受到限制。本文还公开了使用包含过酸的溶液消毒表面或无生命物体以及漂白纺织物或衣物的方法，所述溶液递送目标浓度的过酸。以下发现使得所述方法变得可行第一个发现是属于CE-7酯酶结构家族的酶(例如先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[ΑΧΕ])表现出显著的过氧化物解活性，该活性用于将羧酸酯转化成过酸，第二个发现是所述酶具有过氧化物解酯以制备过酸和水解过酸以制备羧酸和过氧化氢的活性，当产生过酸和/或羧酸的反应经过一段时间后PH降低，所述活性显著降低或被钝化。制备过酸并任选地水解过酸的CE-7酯酶的活性可通过多种方法进行控制，包括但不限于选择反应的初始ΡΗ、或者选择过氧化物解反应中的缓冲液和缓冲液浓度、或者组合选择初始ρΗ和缓冲液以及缓冲液浓度，使得实现过酸的目标浓度或目标浓度范围。在一个实施方案中，该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液具有的过酸浓度足以消毒表面或无生命物体，并且还减少或防止与溶液中较高浓度过酸相关联的腐蚀效应。在第二实施方案中，该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液具有的过酸浓度足以消毒纺织物或衣物或者从其上移除污渍，并且还减少或防止与溶液中较高过酸浓度过酸相关联的对染色纺织物或衣服的损害效应，或者与织物完整相关联的损害效应。在一些实施方案中该方法提供制备酶催化的过酸溶液的方法，所述过酸溶液适于消毒表面或无生命物体，其中酶活性的持续时间不足以介导基本的第二酶催化水解过酸反应，所述过酸是在初始酶催化反应中产生的过酸，其中第二酶催化水解过酸反应生成羧酸(例如乙酸)。控制酶催化反应生成过酸的量的方法是使用选择性降低或钝化酶催化功能的反应条件。过氧化物解酶的催化活性能通过多种方法进行控制，例如改变反应混合物的PH。 因此，可调节反应混合物的初始PH使得反应pH随着过酸生成而降低，最终导致反应混合物的PH使得酶活性显著降低或失活。作为另外一种选择，当仅期望低浓度过酸时，反应的初始PH可低至大幅降低酶活性，导致酶催化的过酸制备仅仅持续非常短的时间。另一个控制酶催化反应产生的过酸的量的方法是使用在反应混合物中的浓度使得其缓冲能力受限的缓冲液，导致当过酸和其他反应产物(例如羧酸)被制备出来时缓冲液被迅速耗尽，从而降低反应混合物的pH并降低或钝化酶活性。控制酶催化反应产生的过酸的量的一个方法是选择反应混合物初始PH和具有pKa的缓冲液，它们将导致反应混合物的pH降低，使得当制备出所需量的过酸时，反应的酶活性被降低或钝化。另一个方法是使用PH敏感型酶，该酶具有高催化速率以产生具有高初始过酸输出的反应，导致反应混合物PH降低至使得催化活性显著降低或钝化的点。然而，这些方法中的每一个需要选择一种酶用于具有PH敏感型催化活性的反应，当反应混合物实现期望PH时使得酶催化过酸制备的能力被消除或大幅降低。此外，必须理解酶的比活性对反应PH设计用于制备指定量过酸的过氧化物解反应。 本文所述的是PH敏感型过氧化物解酶和在固定时间内制备目标浓度过酸的方法。所述的是在pH介导的降低或钝化酶催化活性后，保持相对稳定浓度过酸的过酸水溶液，即，在约20%指定过酸浓度范围内的过酸水溶液。在一些优选实施方案中，提供了过酸水溶液，在PH介导的降低或钝化酶催化活性后，其过酸浓度保持在约15%指定过酸浓度范围内，更优选地保持在约10%指定过酸浓度范围内。在降低或钝化酶催化的过酸制备后，过酸浓度稳定性能够持续数小时。在一个实施方案中，在已经终止酶催化的过酸制备后，过酸浓度稳定约3小时，约6小时，约9小时，约12小时，约15小时，约18小时，约21 小时，约24小时，约30小时，约36小时，约42小时，或约48小时。过氧化物解酶的具体实例例示于枯草芽孢杆菌(ATCC 31%4 )、枯草芽孢杆菌 BE1010(Payne 和 Jackson, J. Bacteriol. 173 :2278-2282(1991)),枯草芽孢杆菌ATCC 6633 (美国专利6，465，23 、枯草芽孢杆菌ATCC 29233 ；地衣芽孢杆菌 ATCO 14580 (Rey 等人，Genome Biol. ,5(10) article 77(2004)),热纤梭菌 (Clostrdium Thermocellum) ATCC 27405 (Copeland 等人，GENBANK ZP_00504991、 短小芽孢杆菌 PS213 (Degrassi 等人，Microbiology, 146 1585-1591 (2000))、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana) (GENBANK AAB70869. 1)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus c 1 ausii) KSM-K16 (GENBANK YP_175265)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NRRL B-14911 (GENBANK ZP_01168674)、喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans) C-125(GENBANK NP_244192)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)Jff/ SL YS485 (GENBANK AAB68821)、枯草芽孢杆菌亚种枯草芽孢杆菌str. 168 (GENBANK
NP_388200)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8 (GENBANK NP_227893. 1)、高温
产 S 菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)(GENBANK S41858)、Thermotogalettingae (GENBANK CP000812)、Thermotoga petrophila (GENBANK CP000702)和栖热袍菌属(Thermotoga sp. )RQ2 (GENBANK CP000969)。本文所述的每种过氧化物解酶具有保守结构特征(即，保守特征基序)以及相对于其他α / β -水解酶优异的过氧化物解活性，这使得该酶家族尤其适用于原位制备过酸， 其浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂。适用于本发明方法的过氧化物解酶可通过在糖酯酶 CE-7家族内发现的保守特征基序来鉴定。本文提供了制备目标浓度的过氧羧酸的方法，所述方法包括a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含1)至少一个i)具有以下结构的酯[XlmR5其中X为式Ii6C(O)O的酯基&为Cl至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或Cl至C4烷氧基取代， 其中当&为C2至C7时，R6任选地包含一个或多个醚键；&为Cl至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中&中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中&任选地包含一个或多个醚键；m为1至&中的碳原子数目的整数；所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或者ii)具有以下结构的甘油酯
权利要求
1.制备目标浓度的过氧羧酸的方法，所述方法包括a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含 1)至少一种1)具有以下结构的酯 [X] mR5其中X为式I^6C(O)O的酯基&为Cl至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或Cl至C4烷氧基取代，其中当R6为C2至C7时，&任选地包含一个或多个醚键；&为Cl至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中&中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中&任选地包含一个或多个醚键；m为1至&中的碳原子数目的整数；所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或 )具有以下结构的甘油酯
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种缓冲液以介于约0.OlmM至约200mM范围内的浓度存在。
3.权利要求1的方法，其中所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的PH降低至约5. 0。
4.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约200ppm至约2500ppm。
5.权利要求4的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约1200ppm。
6.权利要求5的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约600ppm。
7.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内实现。
8.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的至少约5 分钟内实现。
9.权利要求8的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟内实现。
10.权利要求1的方法，其中一旦实现了过氧羧酸的目标浓度，所述过氧羧酸的浓度改变小于约20%的所述目标浓度。
11.权利要求1的方法，其中所述缓冲液具有约8.0至约6. 0的pKa。
12.权利要求1的方法，其中所述初始反应混合物的初始pH选自6.5,7. 2,7. 5,8. 1和8. 5。
13.权利要求1的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于那不勒斯栖热袍胃(Thermotoga neapolitana)0
14.权利要求1的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于海栖热袍菌 (Thermotoga maritima)MSB8。
15.权利要求1的方法，其中在混合所述反应组分10分钟或更短时间内，所述pH的降低减少过氧化物解酶活性约80%或更多。
16.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂为以下形式微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分地纯化的酶、纯化的酶、或部分地纯化的酶或纯化的酶的固定形式。
17.权利要求1的方法，其中所述过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β -羟基丁酸、以及它们的混合物。
18.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。
19.通过制备目标浓度的过氧羧酸对硬质表面或无生命物体进行消毒的方法，所述方法包括a.选择一组反应组分以制备目标浓度的过氧羧酸，所述反应组分包含 1)至少一种 i)具有以下结构的酯 [X] mR5其中X为式I^6C(O)O的酯基&为Cl至C7直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基或Cl至C4烷氧基取代，其中当R6为C2至C7时，&任选地包含一个或多个醚键；&为Cl至C6直链、支链或环状烃基部分，其任选地用羟基取代；其中&中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中&任选地包含一个或多个醚键； m为1至&中的碳原子数目的整数； 所述酯在25 °C具有至少5ppm的水中溶解度；或 )具有以下结构的甘油酯
20.权利要求19的方法，其中所述至少一种缓冲液以介于约0.OlmM至约200mM范围内的浓度存在。
21.权利要求19的方法，其中所述反应产物在混合所述反应组分的约1分钟至约10分钟内将所述反应混合物的PH降低至约5. 0。
22.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约200ppm至约2500ppm。
23.权利要求22的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约1200ppm。
24.权利要求23的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度为约400ppm至约600ppm。
25.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1至约10分钟内实现。
26.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的至少约 5分钟内实现。
27.权利要求沈的方法，其中所述过氧羧酸的目标浓度在混合所述反应组分的约1分钟内实现。
28.权利要求19的方法，其中一旦实现了过氧羧酸的目标浓度，所述过氧羧酸的浓度改变小于约20%的所述目标浓度。
29.权利要求19的方法，其中所述缓冲液具有约8.0至约6. 0的pKa。
30.权利要求1的方法，其中所述初始反应混合物的初始pH选自6.5,7. 2,7. 5,8. 1和8.5。
31.权利要求19的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于那不勒斯栖热袍胃(Thermotoga neapolitana)。
32.权利要求19的方法，其中具有过氧化物解活性的酶催化剂来源于海栖热袍菌 (THermotoga maritima)MSB8。
33.权利要求19的方法，其中在混合所述反应组分10分钟或更短时间内，所述pH的降低减少过氧化物解酶活性约80%或更多。
34.权利要求1的方法，其中所述酶催化剂为以下形式微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分地纯化的酶、纯化的酶、或部分地纯化的酶或纯化的酶的固定形式。
35.权利要求19的方法，其中所述过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β -羟基丁酸、以及它们的混合物。
36.权利要求19的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。
全文摘要
提供了从羧酸酯中制备目标浓度的过氧羧酸的方法。更具体地讲，羧酸酯在存在具有过氧化物解活性的酶催化剂的条件下与无机过氧化物如过氧化氢反应，其中通过选择缓冲液浓度和过氧化物解酶浓度以及反应物控制反应pH来制备目标浓度的过氧羧酸。基于保守结构特征将本发明的过氧化物解酶催化剂归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员。此外，提供了包含通过本文所述方法制备的过酸的消毒剂制剂以及相应的使用方法。
文档编号C12P7/40GK102177234SQ200980140542
公开日2011年9月7日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月13日
发明者E·C·汉, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司