专利名称：鳗利斯顿氏菌的lamp-lfd检测方法
技术领域：
本发明涉及鳗利斯顿氏菌的检测方法，尤其是涉及鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法。
背景技术：
弧菌病是淡、海水鱼类危害最大的细菌性疾病之一，给水产养殖业造成巨大损失。鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是鱼类弧菌病的最主要病原之一，其寄主范围广，感染香鱼、鳗鲡、大菱鲆、大黄鱼、牙鲆、鲈鱼等约50种不同鱼类，同时还感染海湾扇贝、对虾等其他水产养殖动物。由鳗利斯顿氏菌爆发所引起的水产动物死亡率高，损失巨大，因此水产养殖动物病原菌快速、准确地诊断在病害防治中显得越来越重要，但是传统的细菌鉴定，即生理生化特征的试验分析费时长，工作量大，已经不能满足病害防治的要求，因此建立更为快速、灵敏、准确的鳗利斯顿氏菌检测技术具有十分重要的意义。
目前公开的鳗利斯顿氏菌检测方法主要是采用PCR检测，如中国科学院海洋研究所莫照兰等发明的鳗利斯顿氏菌的PCR检测方法(授权公告号为CN1279180C，公告日为2006年10月11日)，就公开了含有一对引物的PCR反应液体系及二次PCR扩增法，实现了实验室条件下对鳗利斯顿氏菌简便、敏感、特异检测，但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等贵重仪器以及分子生物学专业实验人员操作，在适用性上局限性较大。
环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)由日本学者Notomi(2000年)发明，其反应依赖于具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，通过4个特异引物，在恒温条件下(65℃左右)高效(30min～1h)扩增目标DNA。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料目测观察等方法。
横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测不需特殊设备以及EB等有毒试剂，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液即可，操作简便、安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，LFD试纸条上有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色、检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。
目前，该技术已成功运用于桃拉病毒(Taura syndrome virus，TSV)、对虾白斑症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosisvirus，IMNV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)等养殖动物病毒性病原的检测，而用于鳗利斯顿氏菌的检测未见报道。本发明第一次将LAMP技术和LFD结合用于鳗利斯顿氏菌的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱横向流动试纸条检测鳗利斯顿氏菌的方法，以实现对鳗利斯顿氏菌进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用PCR检测鳗利斯顿氏菌对仪器设备及操作技术要求高的问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括三个部分1、提供3对用于检测鳗利斯顿氏菌的LAMP引物序列，即长度分别为44bp、44bp、20bp、21bp、19bp和18bp的寡核苷酸序列，依次命名为Van-FIP、Van-BIP、Van-LF、Van-LB、Van-F3和Van-B3；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件；3、提供1条DNA探针序列Van-HP，长度为21bp，结合LFD技术对LAMP扩增结果进行分析。具体包括如下步骤 1、鳗利斯顿氏菌empA基因克隆和测序根据基因库中金属蛋白酶的序列，设计一对扩增引物Van-MPf5’-ATGAAAAAAGTACAACGTCAAA-3’和Van-MPr5’-TTAATCCAGTCTTAACGTTACA-3’，PCR扩增获得鳗利斯顿氏菌empA基因的完整编码基因至pMD19-T得到重组质粒并测序分析，测序结果登录号为FM86624； 2、设计LAMP的引物和探针根据上述鳗利斯顿氏菌empA基因序列设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列 FIP引物Van-FIP 5’-GCTGGTTGAGCTTGCGACCGTTTTGGGTTACAAGGTACGCGAA-3’ 44 BIP引物Van-BIP 5’-TCGATCAGTTTGGGCTCAGGTGTTTTAAGTGGTTGGTTTGCTGC-3’44 LF引物Van-LF5’-AGGTATAGAAGGCTTCGGAG-3’ 20 LB引物Van-LB5’-GCTGATTTGTATGTCAAAGCC-3’ 21 F3引物Van-F35’-CCAACGGGGAATGTGCTAG-3’ 19 B3引物Van-B35’-GGCGACAATCCCACGAAG-3’18 探针Van-HP5’-ACCAGCGCTAAAGTTTCGATC-3’ 21 其中Van-FIP为5’端生物素标记引物，探针Van-HP为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针；引物序列和探针序列分别与鳗利斯顿氏菌的empA基因上相应位置核苷酸序列相同或者互补。
3、配制LAMP反应体系反应体系的终浓度分别为外引物Van-F3和Van-B3各0.2μmol/L，内引物Van-FIP和Van-BIP各1.6μmol/L，环引物Van-LF和Van-LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL。
4、LAMP反应体系扩增将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-90min。
5、探针杂交和LFD检测扩增后将20pmol的Van-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μLbuffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。
步骤4中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为20min。
本发明所提供的鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法具有如下优点 一、灵敏度高，对鳗利斯顿氏菌的检测极限可低至7.7CFU/mL，其检测灵敏度比常规PCR和LAMP-AGE的检测高10倍。
二、特异性强，所用的特异引物根据鳗利斯顿氏菌的empA基因中的六个不同区域设计，并且还有DNA的特异性探针，特异性比常规PCR要强。
三、检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规PCR检测节省2-4h。
四、仪器设备要求低，不需PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需一个水浴锅即可完成检测。
五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，直接肉睛观察即可判断。
六、对人身和环境更安全，检测过程中不使用EB等有毒试剂。
综上所述，本发明具有比现有技术的用PCR检测鳗利斯顿氏菌的方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制水产动物养殖中鳗利斯顿氏菌的感染和暴发。
图1为鳗利斯顿氏菌(ayu-H080701)empA基因的LAMP-LFD引物和探针设计示意图；(a)为LAMP-LFD引物示意，(b)为用于引物设计的empA基因(FM866242)的核酸序列，引物和探针由方框和直线表示； 图2为扩增反应温度对LAMP扩增的影响图；M1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；1、2泳道为61℃恒温条件下扩增结果；3、4泳道为63℃恒温条件下扩增结果；5、6泳道为65℃恒温条件下扩增结果；2、4、6泳道的模板菌浓度为7.7×105CFU/mL；1、3、5泳道为无模板； 图3为反应时间对LAMP扩增的影响图(a)模板菌浓度为7.7×105CFU/mL，(b)模板菌浓度为7.7×102CFU/mL；M1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；1、2泳道为10min扩增结果；3、4泳道为20min扩增结果；5、6泳道为40min扩增结果；7、8泳道为60min扩增结果；9、10泳道为90min扩增结果；2、4、6、8、10泳道为以L.Anguillarum基因组DNA做模板；1、3、5、7、9泳道为无模板； 图4为PCR-AGE(a)、LAMP-AGE(b)和LAMP-LFD(c)检测鳗利斯顿氏菌的灵敏度比较；M(a)1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；M(b)PUC19/MSP/23DNA标准分子量(Fermentas公司)；1泳道为无模板；2泳道为100(菌浓度为7.7×105CFU/mL)；3-8泳道依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释的基因组DNA； 图5为LAMP-AGE(a)和LAMP-LFD(b)的特异性试验结果图；M(a)1kb DNA标准分子量(Fermentas公司)；1泳道为无模板；2-5泳道依次为鳗利斯顿氏菌的ayu-H080701、NB14、TM01和E3-11菌株；6-11泳道依次为溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌。
具体实施例方式 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1 1、鳗利斯顿氏菌empA基因的克隆及序列分析 1.1材料与方法 1.1.1材料 2008年在浙江省宁海地区爆发了弧菌病的香鱼中分离得到致病菌株ayu-H080701，经鉴定为鳗利斯顿氏菌(V.Anguillarum)(李长红等，2009)。大肠杆菌菌株TG1由本室保存，pMD19-T Vector、rTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，plasmid Mini kit购自OMEGA公司，QIAquick Gel Extraction试剂盒购自QIAGEN公司。
1.1.2方法 1.1.2.1细菌基因组DNA抽提 采用煮沸法，100μL菌液煮沸10min后12000g离心5min，取上清用作扩增模板，-30℃保存备用。
1.1.2.2鳗利斯顿氏菌empA基因的扩增及克隆测序 根据基因库中金属蛋白酶的已知序列(AY428808、AY091854、AY046320、L02528、EU360910)，设计一对特异扩增引物 Van-MPf 5’-ATGAAAAAAGTACAACGTCAAA-3’， Van-MPr5’-TTAATCCAGTCTTAACGTTACA-3’， 上述PCR特异扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR扩增反应为25μL体系，包含10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，0.8mmol/L dNTPs，0.2μmol/L引物Van-MPf，0.2μmol/L引物Van-MPr，模板DNA1.0μL，5U/μL rTaq DNA聚合酶；反应经94℃预变性2min后，循环扩增30次94℃变性30s，58℃复性30s，72℃反应1min，循环结束后72℃延伸反应10min；扩增产物经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，预期大小的扩增条带用QIAquickGel Extraction纯化克隆至pMD19-T载体；empA基因序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。
2、LAMP-LFD技术检测致病性鳗利斯顿氏菌的方法的建立 2.1材料与方法 2.1.1材料 Bst DNA聚合酶大片段(含10×缓冲液)购自New England Biolabs公司，dNTPs购自TaKaRa公司，LFD检测试纸条购自Milenia Biotec GmbH公司(Milenia
GenLineHybriDetect by Milenia Biotec GmbH，Germany)。
2.1.2方法 2.1.2.1LAMP引物的设计 根据如图1所示的empA基因测序结果(登录号为FM86624)，设计和筛选出下述LAMP的3对引物和一条探针，引物和探针的序列如下所示 Van-FIP 5’-GCTGGTTGAGCTTGCGACCGTTTTGGGTTACAAGGTACGCGAA-3’ 44 Van-BIP 5’-TCGATCAGTTTGGGCTCAGGTGTTTTAAGTGGTTGGTTTGCTGC-3’44 Van-LF5’-AGGTATAGAAGGCTTCGGAG-3’20 Van-LB5’-GCTGATTTGTATGTCAAAGCC-3’ 21 Van-F35’-CCAACGGGGAATGTGCTAG-3’ 19 Van-B35’-GGCGACAATCCCACGAAG-3’ 18 探针Van-HP5’-ACCAGCGCTAAAGTTTCGATC-3’ 21 在引物Van-FIP的5’端标记上生物素Biotin，在Van-HP的5’端标记上异硫氰酸荧光素FITC，鳗利斯顿氏菌的empA基因LAMP扩增引物序列位置如图1所示。按照上述引物序列进行LAMP引物的合成(可由商业的DNA合成公司合成，如上海生工生物工程技术服务有限公司)。
2.1.2.2LAMP扩增条件的优化 LAMP检测反应所用的DNA模板可以用常规的组织核酸提取方法制备，也可以用商品化的组织DNA提取试剂盒制备。首先要配制具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP的反应体系为20mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，6.5mmol/L MgSO4，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.96mmol/LdNTPs，1.6μmol/L Van-FIP，1.6μmol/L Van-BIP，0.2μmol/L Van-F3，0.2μmol/L Van-B3，0.4μmol/L Van-LF，0.4μmol/L Van-LB，8U Bst DNA聚合酶(New England BioLabs公司)，基因组DNA模板1μL。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌Eppendorf管中(规格为200μL)，反应总体积为25μL。
在反应程序中，扩增温度过高或过低均不利于LAMP反应。应用本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系，分别对比不同温度(61℃，63℃，65℃)条件下对LAMP反应的影响，结果3个温度梯度下均出现LAMP特异性扩增，其中63℃时条带最为清晰明亮，故确定63℃为适宜反应温度(如图2)。此外反应时间对反应产物的量也有较大的影响，分别选取两个浓度梯度(高浓度7.7×105CFU/mL和低浓度7.7×102CFU/mL)用于反应时间优化实验。高浓度基因组DNA作为模板时，反应10min即可检测到产物(见图3(a))；低浓度基因组DNA作为模板时，反应进行20min首次检出特异性条带(见图3(b))。反应90min时出现非特异性扩增，说明反应时间过长对扩增结果有影响。为确保LAMP反应的灵敏度，本发明中较佳反应时间确定为20min。LAMP检测时，需将上述含有反应体系的Eppendorf管放入水浴锅中63℃温育20min。
2.1.2.3探针杂交和LFD检测 LAMP扩增结束后，不经过终止反应，将20pmol的Van-HP探针序列加入反应体系中63℃温育5min杂交，取8μL杂交液加入100μL Buffer混匀，将LFD试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品的鳗利斯顿氏菌的检测结果为阳性，如果不显色表示该样品的鳗利斯顿氏菌的检测结果为阴性(如图4、图5所示)。
实施例2 用本发明的LAMP-LFD技术检测鳗利斯顿氏菌的灵敏度测定 1、参照1.1.2.1的煮沸法提取鳗利斯顿氏菌基因组DNA，鳗利斯顿氏菌基因组DNA模板原始浓度(相当于n(cell)＝7.7×105mL-1的菌浓度)10倍梯度稀释，分别作为模板。
2、用LAMP-AGE方法、LAMP-LFD方法和PCR方法进行鳗利斯顿氏菌检测比较灵敏度 2.1按照本发明提供的LAMP的三对引物和一条探针结合LFD技术将上述梯度稀释后的基因组DNA用作LAMP反应的模板进行扩增，用本发明提供的LFD方法分析LAMP的反应，结果见图4(c)。
2.2将上述梯度稀释的基因组DNA用作LAMP-AGE的模板进行琼脂糖凝胶电泳试验，结果见图4(a)。
2.3将上述梯度稀释的基因组DNA用作PCR反应的模板，利用上述DPOL基因的特异引物Van-F3和Van-B3进行扩增；反应体系为25μL10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.8mmol/L dNTPs，上下游引物各0.2μmol/L，5U/μL r Taq DNA聚合酶(Takara公司)1μL模板。94℃预变性2min后，循环扩增30次94℃变性30s，58℃复性30s，72℃反应30s。循环结束后72℃延伸反应10min，2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5(b)。
鳗利斯顿氏菌基因组DNA模板10倍梯度稀释试验表明，LAMP-LFD检测的最低模板浓度为7.7CFU/mL(表4(c))，而相应的LAMP-AGE和常规PCR检测的最低模板浓度为77CFU/mL(表4(a)和表4(b))，LAMP-LFD检测的灵敏度比LAMP-AGE和常规PCR方法高1个数量级。
实施例3 用本发明的LAMP-LFD技术检测鳗利斯顿氏菌的特异性测定 选取鳗利斯顿氏菌ayu-H080701菌株、NB14菌株、E3-11菌株、TM01菌株，溶藻弧菌ATCC17749菌株、副溶血弧菌ATCC33847、创伤弧菌ATCC27562菌株、河流弧菌ATCC33809菌株、哈维氏弧菌ATCC33866菌株和嗜水气单胞菌Ah0201菌株用于LAMP-LFD特异性验证实验，其中双蒸水作为阴性对照。DNA提取方法和LAMP反应体系和条件见前。扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳和LFD法检测。结果显示见图5，说明本发明提供的鳗利斯顿氏菌LAMP-LFD检测方法能保证对鳗利斯顿氏菌的特异性检测，并不与其他相关细菌发生交叉反应。
实施例4 用本发明LAMP-LFD技术具体检测人工感染香鱼组织中的鳗利斯顿氏菌 1、感染实验 实验用香鱼取自浙江宁波黄坛水库，体重20-25g，暂养于水族箱中，水温20-22℃。所有香鱼健康无病症，取15尾用于实验。将上述健康香鱼分为3组，每组5尾，放置于连续曝气的过滤水中，水温20-22℃。取3.8×105CFU/mL的鳗利斯顿氏菌(ayu-H080701)、1.5×106CFU/mL的嗜水气单胞菌(Ah0201)、无菌PBS缓冲液分别对三组鱼进行腹腔注射，注射剂量为0.1ml/尾，感染24h。
2、制备待检样品的LAMP反应模板 感染24h后，分别取肾、脾、肝、肌肉等组织，用QIAamp DNAMini kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取基因组DNA，制备成用于PCR和LAMP反应的DNA样品模板。
3、配制LAMP反应体系 取上述制备的DNA样品模板1μL，加入如下反应体系中外引物Van-F3和Van-B3各0.2μmol/L，内引物5’biotin-labeled Van-FIP和Van-BIP各1.6μmol/L，环引物Van-LF和Van-LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，加入双蒸水使反应总体积达25μL。
3、按照反应程序进行LAMP扩增反应，扩增反应温度为63℃扩增反应温育时间为20min。
4、判断LAMP检测结果 LAMP扩增结束后，将20pmol的Van-HP加入反应体系中63℃温育5min杂交，取8μL杂交液加入100μL Buffer混匀，将LFD试纸条浸入其中，观察检测带是否显色。如果检测带显色表示该样品的鳗利斯顿氏菌的检测结果为阳性，如果不显色表示该样品的鳗利斯顿氏菌的检测结果为阴性。
同时，上述检测结果PCR的检测结果进行比较，结果显示PCR-AGE和LAMP-LFD均可以从鳗利斯顿氏菌(ayu-H080701)感染过的香鱼组织中检测出鳗利斯顿氏菌，但是健康香鱼和嗜水气单胞菌(Ah0201)感染过的香鱼组织没有扩增结果(表1)，这说明本研究建立的LAMP-LFD方法可以用于生产单位的鳗利斯顿氏菌检测。
根据以上试验结果表明，LAMP-LFD结合技术能够为ISKNV提供简便、快速、灵敏的现场检测。
表1人工感染后香鱼组织中鳗利斯顿氏菌检测结果
第一组为鳗利斯顿氏菌ayu-H080701感染的香鱼，第二组为嗜水气单胞菌Ah0201感染的香鱼。
序列表
<110>宁波大学
<120>鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Van-FIP
<400>1
gctggttgagcttgcgaccgttttgggttacaaggtacgcgaa 44
<210>2
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Van-BIP
<400>2
tcgatcagtttgggctcaggtgttttaagtggttggtttgctgc 44
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Vav-LF
<400>3
aggtatagaaggcttcggag 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Van-LB
<400>4
gctgatttgtatgtcaaagcc21
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Van-F3
<400>5
ccaacggggaatgtgctag 19
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Van-B3
<400>6
ggcgacaatcccacgaag 18
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针Van-HP
<400>7
accagcgctaaagtttcgatc2权利要求
1.鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括下述步骤
(1)鳗利斯顿氏菌empA基因克隆和测序根据基因库中金属蛋白酶的序列，设计一对扩增引物Van-MPf5’-ATGAAAAAAGTACAACGTCAAA-3’和Van-MPr5’-TTAATCCAGTCTTAACGTTACA-3’，PCR扩增获得鳗利斯顿氏菌empA基因的完整编码基因至pMD19-T得到重组质粒并测序分析，测序结果登录号为FM86624；
(2)设计LAMP的引物和探针根据上述鳗利斯顿氏菌empA基因序列设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列
FIP引物Van-FIP
5’-GCTGGTTGAGCTTGCGACCGTTTTGGGTTACAAGGTACGCGAA-3’ 44
BIP引物Van-BIP
5’-TCGATCAGTTTGGGCTCAGGTGTTTTAAGTGGTTGGTTTGCTGC-3’44
LF引物Van-LF5’-AGGTATAGAAGGCTTCGGAG-3’ 20
LB引物Van-LB5’-GCTGATTTGTATGTCAAAGCC-3’ 21
F3引物Van-F35’-CCAACGGGGAATGTGCTAG-3’ 19
B3引物Van-B35’-GGCGACAATCCCACGAAG-3’18
探针Van-HP5’-ACCAGCGCTAAAGTTTCGATC-3’ 21
其中Van-FIP为5’端生物素标记引物，探针Van-HP为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针；引物序列和探针序列分别与鳗利斯顿氏菌的empA基因上相应位置核苷酸序列相同或者互补；
(3)配制LAMP反应体系反应体系的终浓度分别为外引物Van-F3和Van-B3各0.2μmol/L，内引物Van-FIP和Van-BIP各1.6μmol/L，环引物Van-LF和Van-LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；
(4)LAMP反应体系扩增将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-90min；
(5)探针杂交和LFD检测扩增后将20pmol的Van-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。
2.根据权利要求1所述的鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法，其特征在于步骤4中所述的最适反应温度为63℃，最适反应时间为20min。
全文摘要
本发明公开了鳗利斯顿氏菌的LAMP-LFD检测方法，包括鳗利斯顿氏菌empA基因克隆和测序步骤，设计三对LAMP的引物FIP、BIP、LF、LB、F3、B3和一条探针Van-HP步骤，其中Van-FIP为5’端生物素标记引物，探针Van-HP为5’端异硫氰酸荧光素FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系扩增步骤，用探针杂交然后用LFD检测步骤，本发明具有比现有技术的PCR检测鳗利斯顿氏菌的方法具有更高的灵敏度、特异性和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制水产动物养殖中鳗利斯顿氏菌的感染和暴发。
文档编号C12Q1/68GK101768641SQ20101003980
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者陈炯, 李明云, 史雨红, 陆新江, 李登峰, 史西志, 丁文超 申请人:宁波大学