专利名称：一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物柔红霉素的制备方法。
背景技术：
柔红霉素(Daunorubicin，DNR)，又称道诺霉素(Daunomycin)，是从波赛链霉 菌(Str印tomyces peucetius)培养物中分离得到的一种蒽环类抗生素。化学名为 10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧基-a-L来苏己吡喃基)-氧]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三 羟基-8-乙酰基-1-甲氧基-5，12萘二酮的盐酸盐，化学结构式如下
<formula>formula see original document page 3</formula>柔红霉素是上世纪八十年代意大利Farmitalia CarloErba公司上市的抗生素类 药物，DNR分子含多种功能基团，其糖苷配基(又称道诺霉酮Daimomycinone)是荧光发色 团，环A处于半椅式构象，C8原子几乎伸出环平面外。配基为脂溶性，通过环上羟基与水溶 性的氨基糖(道诺糖胺Daimosamine)相连接，氨基糖的氨基的碱性和配基上羧基的酸性使 DNR分子呈两性。此外，分子又同时具有氧化和还原基团。所有这些化学特征使DNR在体内 表现出复杂的生化效应，DNR广泛应用于癌症化疗，对多种实验肿瘤有显著疗效，如对小鼠 艾氏腹水癌、肝癌AH130、大鼠骨髓瘤(腹水型)均有抑制作用；对艾氏腺癌(实体型)、肉 瘤180、Walker 256瘤亦有抑制作用，临床上DNR主要用于治疗急性非淋巴细胞性白血病， 对儿童白血病有良好的缓解作用，DNR的作用对象包括DNA、膜磷脂及蛋白质，DNR嵌入DNA 分子，干扰复制与转录过程，并通过TopII媒介或氧自由基诱导DNA链断裂。DNR与膜磷脂 作用影响胞内信息通路，与多种蛋白质间也存在相互作用，并诱导细胞凋亡。随着时代的发展，人类对药品质量的要求越来越高，柔红霉素中杂质的毒性较强， 所以原料的纯化成为制备柔红霉素的关键，特别是杂质B和柔红霉素的分子结构比其他杂 质更接近，如下式II所示，当基团R为-CH0H-CH3时为杂质B，当基团R为-C0-CH3时为柔红 霉素，因此传统工艺中杂质B通常难以去除。根据欧洲药典EP6.0杂质B允许限度为1.5%， 而其他杂质的允许限度为0.5%。传统工艺仅能使杂质B< 1.5%，鉴于杂质B毒性较强， 其含量亦有待于降至0.5%以下。II国家食品药品质量监督管理局已经将炽灼残渣检验标准用于盐酸柔红霉素的GMP 认证中，炽灼残渣应低于0. 1%。由于柔红霉素分子本身有一定的络合金属离子的能力(参 考专利IE44689B1)，如式III所示，其中字母‘M’表示金属离子，可见有3个部位可以络合 金属离子，但至今尚没有文献报道去除被络合的金属离子的方法。传统工艺没有去除被络 合的金属离子的步骤，因此常导致炽灼残渣超标。
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目前国内外实现了柔红霉素的工业化生产，提取工艺多根据柔红霉素在碱性条件 下溶于有机溶剂，酸性条件下溶于水的特性进行萃取纯化。美国专利US3989598报道了一种柔红霉素的精制工艺，发酵液经过连续过滤处 理，用Amberlite IRC-50树脂纯化，用氯仿萃取，浓缩，酸化，最后从氯仿和甲醇混合液中结 晶。收率57%，纯度82%，总有关物质2.2%，水分2.6%，氯仿残留14%，。本方法的缺点 是收率低，杂质较高，特别是杂质B的含量较难达到药典标准，且氯仿残留太高。Drug Resarch, vol.58 No. 4 PP263-268.2001，THE METHOD OF DAUNOMYCIN PURIFICATION报道的工艺如下酸化发酵液pHl. 4，搅拌、过滤，滤液用10% NaC03溶液调 节pH4. 5，用AmberlitelRC树脂纯化，用水洗柱，再用水+甲醇+NaCL溶液洗脱，洗脱液减 压浓缩，调节PH7. 5，用氯仿分三次萃取，有机相在pH3. 5条件下用水萃取，调节水相PH7. 5， 用氯仿分十次萃取，氯仿相在30°C减压浓缩为油状物，用10%盐酸乙醇溶液调节pH2. 7， 20士2°C静置20h析晶，过滤，用纯乙醇二氯甲烷=1 4的混合液和正己烷洗涤，低于35°C减压干燥，收率60. 5%，纯度80. 3%，总有关物质1.9%，水分1.8%，溶剂残留0. 1%, 此工艺虽收率有所提高、杂质含量得到控制，产品符合药典要求，但杂质B的含量仍较高， 不能满足用于对原料要求较高的制剂的需要，且使用正己烷不符合药典要求，炽灼残渣超 标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的柔红霉素发酵液提取纯化方法。发明人经过大量实验研究发现，使用LX-20或LX-68M型大孔吸附树脂，并配合适 当的吸附和洗脱方法可以有效去除杂质B。发明人通过对金属离子络合剂的筛选，惊奇的发 现乙二胺四乙酸盐在一定PH范围内能够竞争被柔红霉素络合的金属离子，从而可以有效 降低炽灼残渣。本发明有针对性的去除杂质B，克服了炽灼残渣的残留。本发明提供的技术方案主要由以下步骤组成(1)发酵液用草酸液调节pH范围为1.0-4.0后添加助滤剂，用压滤机压滤，经过 0. lum钛棒过滤器过滤得澄清料液。(2)树脂装柱后用1.5倍于树脂体积的树脂预处理液进行冲洗预处理，控制流 速为500-3000L/h ；澄清料液用10 % NaOH溶液调节pH为2. 0-6. 0，上柱，控制流速为 100-800L/h，被吸附后用2倍于树脂体积的草酸水溶液冲洗，控制洗脱速度为500-3000L/ h ；再用30%乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为500-3000L/h，TLC监测杂质B点基本消 失，盐酸柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；最后用70%乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为 500-3000L/h, TLC监测盐酸柔红霉素点基本消失时停止洗脱，合并70%乙醇水溶液洗脱的 洗脱液进行下一步萃取。(3)用乙二胺四乙酸盐水溶液调节上步最后所得洗脱液pH至8. 0-10. 0，加入二氯 甲烷萃取，静置分液得有机相，将有机相合并后真空浓缩至原体积的1/4时停止浓缩进行 析晶，析晶、抽滤，干燥得粗品。步骤(1)中发酵液用草酸液调节pH范围为1.0-4.0，优选pH范围为1.5-2. 5;助 滤剂为硅藻土或珍珠岩粉，用量10-50kg/1000L发酵液，最佳用量20-30kg/1000L发酵液； 压滤机压滤压力0. 2-lMPa，最佳范围0. 4-0. 6MPa，钛棒过滤器过滤压力0. 2-0. 5MPa ；步骤(2)中大孔吸附树脂型号优选LX-20或LX-68M型；树脂预处理液是草酸 水溶液PH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3. 5-4. 5，使用量是树脂体积的1. 5倍，控制流速为 500-3000L/h ；其中料液吸附后冲洗用草酸水溶液pH为2. 0-4. 5 ；所用30%乙醇水溶液，洗 脱前用草酸调节PH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3-4. 5 ；所用70 %乙醇水溶液，洗脱前用草 酸调节pH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3-4. 5。步骤(3)中配制乙二胺四乙酸盐的水溶液，浓度范围0. _饱和，最佳浓度范 围10-30% ；乙二胺四乙酸盐包括乙二胺四乙酸四锂、乙二胺四乙酸二锂、乙二胺四乙酸 二钠、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二铵和乙 二胺四乙酸四铵中的一种或多种；真空浓缩中，控制浓缩温度为5-20°C，控制真空度，真空 度彡0. 09Mpa，控制析晶温度10-30°C。本发明的技术效果在于本工艺能够提高柔红霉素的收率，各项指标符合2010版 药典要求，有效将杂质B降至0. 5%以下，将炽灼残渣降至0. 1 %以下。
具体实施例方式现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，应理解为这些实施例仅用于 例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见 的改变和修饰也包含在本发明范围之内。实施例一1000L发酵液(效价1. 9g/L)用草酸液调节pH4. 0后添加10kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力IMPa)，经过0. 1 P m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 5MPa)得澄清液。用2000L LX-20大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为2. 0的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为100L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH2. 0，上柱，控 制流速为500L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH 2. 0的草酸水溶液洗柱子 一次，控制洗脱速度为3000L/h;用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH 2.0)洗脱杂质，控 制洗脱速度为3000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用 70%乙醇水溶液(用10%草酸调pH2. 0)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为3000L/h，TLC监 测柔红霉素点基本消失时停止洗脱，合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用1 %乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至9. 0，加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度5°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静置 析晶，控制析晶温度10°c，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0.09Mpa)干燥72h得粗品 1.64kg。含量81%，收率70%，粗品杂质B含量0. 4%，产品炽灼残渣量为0.03%。实施例二1000L发酵液(效价2. 2g/L)用草酸液调节pH3. 0后添加20kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 9MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 4MPa)得澄清 液。用2000L LX-20大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为3. 0的草酸水溶液对树 脂进行预处理，控制流速为3000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH3. 0，上柱，控 制流速为800L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH3. 0的草酸水溶液洗柱子一 次，控制洗脱速度为3000L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH3. 0)洗脱杂质，控制洗 脱速度为1000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70% 乙醇水溶液(用10%草酸调pH3. 0)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为500L/h，TLC监测柔红 霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用饱和乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至9. 5，加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相，再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得有 机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度10°C，真空度≥0.09Mpa，浓缩至45L静 置析晶，控制析晶温度15°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度≥0. 09Mpa)干燥72h得粗 品1.89kg。含量79%，收率68%，粗品杂质B含量0. 3%，产品炽灼残渣量为0.06%。实施例三
1000L发酵液(效价2.0g/L)用草酸液调节pHl. 0后添加30kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 8MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 3MPa)得澄清液。用2000L LX-20大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为4. 0的草酸水溶液对树 脂进行预处理，控制流速为1000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH4. 0，上柱，控 制流速为200L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH4. 0的草酸水溶液洗柱子一 次，控制洗脱速度为1000L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH4. 0)洗脱杂质，控制洗 脱速度为1000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70% 乙醇水溶液(用10%草酸调pH4. 0)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为1000L/h，TLC监测柔 红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用10%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至10。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度10°C，真空度> 0.09Mpa，浓缩至45L静 置析晶，控制析晶温度20°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0. 09Mpa)干燥72h得粗 品。得到粗品1. 66kg，含量83 %，收率69 %，粗品杂质B含量0. 2 %，产品炽灼残渣量为 0. 04%。实施例四1000L发酵液(效价2. lg/L)用草酸液调节pHl. 5后添加40kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 7MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 2MPa)得澄清液。用2000L LX-20大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为5. 0的草酸水溶液对树 脂进行预处理，控制流速为2000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH5. 0，上柱，控 制流速为300L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH5. 0的草酸水溶液洗柱子一 次，控制洗脱速度为1500L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH5. 0)洗脱杂质，控制洗 脱速度为1500L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70% 乙醇水溶液(用10%草酸调pH5. 0)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为1500L/h，TLC监测柔 红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用0. 乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至8.0。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度15°C，真空度> 0.09Mpa，浓缩至45L静 置析晶，控制析晶温度25°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0. 09Mpa)干燥72h得粗 品。得到粗品1. 83kg，含量82 %，收率72 %，粗品杂质B含量0. 1 %，产品炽灼残渣量为 0. 01%。实施例五1000L发酵液(效价2. 2g/L)用草酸液调节pH2. 0后添加50kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 6MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 5MPa)得澄清液。
用2000L LX-20大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为2. 5的草酸水溶液对树 脂进行预处理，控制流速为2500L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH2. 5，上柱，控 制流速为400L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH2. 5的草酸水溶液洗柱子一 次，控制洗脱速度为2000L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH2. 5)洗脱杂质，控制洗 脱速度为2000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70% 乙醇水溶液(用10%草酸调pH2. 5)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为2000L/h，TLC监测柔 红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用30%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至9. 5。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度20°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静 置析晶，控制析晶温度30°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0. 09Mpa)干燥72h得到 粗品2. 0kg。含量80 %，收率73 %，粗品杂质B含量0. 4 %，产品炽灼残渣量为0.07%。实施例六1000L发酵液(效价2.5g/L)用草酸液调节pH2. 5后添加10kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 5MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 4MPa)得澄清 液。用2000L LX-68M大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为3. 0的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为3000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH3. 0，上柱， 控制流速为300L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH3. 0的草酸水溶液洗柱子 一次，控制洗脱速度为2000L/h;用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH3. 0)洗脱杂质，控 制洗脱速度为2000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用 70%乙醇水溶液(用10%草酸调pH3. 0)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为2000L/h，TLC监 测柔红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用20%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至8. 1。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度5°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静置 析晶，控制析晶温度15°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0.09Mpa)干燥72h得到粗 品2. 16kg，含量81 %，收率70 %，粗品杂质B含量0. 2 %，产品炽灼残渣量为0. 06 %。实施例七1000L发酵液(效价2.7g/L)用草酸液调节pHl. 8后添加20kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 4MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 3MPa)得澄清液。用2000L LX-68M大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为2. 5的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为1000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH2. 5，上柱， 控制流速为400L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH2. 5的草酸水溶液洗柱子 一次，控制洗脱速度为1500L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH2. 5)洗脱杂质，控 制洗脱速度为1500L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70%乙醇水溶液(用10%草酸调pH2. 5)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为1500L/h，TLC监 测柔红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用15%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至8.8，加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相，再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得有 机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度7°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静置 析晶，控制析晶温度20°C，析晶4h后抽滤。50°C真空(真空度彡0.09Mpa)干燥72h得到粗 品2. 26kg，含量80 %，收率67 %，粗品杂质B含量0. 2 %，产品炽灼残渣量为0.02%。实施例八1000L发酵液(效价2. 4g/L)用草酸液调节pH2. 2后添加30kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 3MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 2MPa)得澄清液。用2000L LX-68M大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为3. 5的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为2000L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH3. 5，上柱， 控制流速为200L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH3. 5的草酸水溶液洗柱子 一次，控制洗脱速度为1000L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH3. 5)洗脱杂质，控 制洗脱速度为1500L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用 70%乙醇水溶液(用10%草酸调pH3.5)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为1000L/h，TLC监 测柔红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用25%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至8. 8。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度9°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静置 析晶，控制析晶温度25°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度彡0.09Mpa)干燥72h得到粗 品2. 08kg,含量83%收率72%，粗品杂质B含量0. 1 %，产品炽灼残渣量为0.03%。实施例九1000L发酵液(效价2. 6g/L)用草酸液调节pH2. 5后添加40kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 2MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 5MPa)得澄清液。用2000L LX-68M大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为5. 5的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为1000L/h;过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH5. 5，上柱， 控制流速为300L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上。用4000L的pH5. 5的草酸水溶液洗柱子 一次，控制洗脱速度为1500L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH5. 5)洗脱杂质，控 制洗脱速度为2000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用 70%乙醇水溶液(用10%草酸调pH5. 5)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为2000L/h，TLC监 测柔红霉素点基本消失时停止洗脱。合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用20%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至9. 4。加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。
将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度10°C，真空度> 0.09Mpa，浓缩至45L静 置析晶，控制析晶温度22°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度≤0. 09Mpa)干燥72h得到 粗品2. 18kg，含量82 %，收率69 %，粗品杂质B含量0. 3 %，产品炽灼残渣量为0. 06 %。实施例十1000L发酵液(效价2.5g/L)用草酸液调节pHl. 5后添加50kg硅藻土，用压滤机 压滤(操作压力0. 5MPa)，经过0. 1 y m钛棒过滤器进一步澄清(操作压力0. 4MPa)得澄清 液。用2000L LX-68M大孔吸附树脂装填树脂柱；用3000L pH为4. 5的草酸水溶液对 树脂进行预处理，控制流速为500L/h ；过滤得到的澄清液用10% NaOH调节pH4. 5，上柱，控 制流速为350L/h，使柔红霉素被吸附在树脂上；用4000L的pH4. 5的草酸水溶液洗柱子一 次，控制洗脱速度为1500L/h ；用30%乙醇水溶液(用10%草酸调pH4. 5)洗脱杂质，控制洗 脱速度为1500L/h，TLC监测杂质B点基本消失，柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；用70% 乙醇水溶液(用10%草酸调pH4. 5)洗脱柔红霉素，控制洗脱速度为2000L/h，TLC监测柔 红霉素点基本消失时停止洗脱，合并70%乙醇水溶液的洗脱液作为下一步萃取用。用30%乙二胺四乙酸四钠盐调节溶液pH至8. 3，加入二氯甲烷3000L剧烈搅拌 30min萃取，静置分液得有机相。再加入二氯甲烷1500L剧烈搅拌30min萃取，静置分液得 有机相。将有机相合并后真空浓缩，控制浓缩温度8°C，真空度> 0. 09Mpa，浓缩至45L静置 析晶，控制析晶温度18°C，析晶4h后抽滤，50°C真空(真空度≤0.09Mpa)干燥72h得到粗 品2. 21kg，含量80%，收率71 %，粗品杂质B含量0. 09%，产品炽灼残渣量为0. 08%。
权利要求
一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法，包含以下步骤(1)发酵液用草酸液调节pH范围为1.0-4.0，添加助滤剂，用压滤机压滤，经过0.1μm钛棒过滤器过滤得澄清料液；(2)树脂装柱后用1.5倍于树脂体积的树脂预处理液进行冲洗预处理，控制流速为500-3000L/h；澄清料液用10％NaOH溶液调节pH为2.0-6.0，上柱，控制流速为100-800L/h，被吸附后用2倍于树脂体积的草酸水溶液冲洗，控制洗脱速度为500-3000L/h；再用30％乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为500-3000L/h，TLC监测杂质B点基本消失，盐酸柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；最后用70％乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为500-3000L/h，TLC监测盐酸柔红霉素点基本消失时停止洗脱，合并70％乙醇水溶液洗脱的洗脱液进行下一步萃取；(3)用乙二胺四乙酸盐水溶液调节上步最后所得洗脱液pH至8.0-10.0，加入二氯甲烷萃取，静置分液得有机相，将有机相合并后真空浓缩至原体积的1/4时停止浓缩进行析晶，析晶、抽滤，干燥得粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中发酵液用草酸液调节PH范围为 1 5 2 5 o
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的助滤剂为硅藻土或珍珠岩粉。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的助滤剂用量为 20-30kg/1000L 发酵液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中料液吸附后冲洗用草酸水溶液 pH 为 2. 0-4. 5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中配制乙二胺四乙酸盐的水溶液， 浓度范围为0. 饱和。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中配制乙二胺四乙酸盐的水溶液， 浓度范围为10 30%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙 酸四锂、乙二胺四乙酸二锂、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸四钾、乙 二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二铵和乙二胺四乙酸四铵中的一种或多种。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物柔红霉素的制备方法，本发明发酵液提取纯化包括发酵液过滤、大孔树脂吸附纯化及乙二胺四乙酸盐络合除杂质几个过程，通过控制pH值、对发酵液和树脂柱预处理等方法，达到良好的纯化柔红霉素的技术效果，杂质B降至0.5％以下，炽灼残渣降至0.1％以下。
文档编号C12P19/56GK101798328SQ20101015006
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月20日 优先权日2010年3月20日
发明者潘淑勇, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司