专利名称：水稻OsEATB基因在改良水稻产量性状方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种改良水稻产量性状方法。
背景技术：
水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有约2/3的人口以水稻为主食。为了 满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻生产力具有重要意义。产量性状是描述水稻 生产力的重要农艺性状，主要由有效穗数、每穗谷粒数和千粒重几部分组成。这些产量性状 都属于数量性状(QTL)，由许多效应不同的基因所控制。目前国内外利用转基因改良农作物经济性状的技术主要是根据已知的功能基因 与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植 物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。具有AP2结构域的转录因子家族成员是一类只存在于高等植物中的重要转录因 子。该家族不同成员的功能涉及植物花、子房、种子的发育调控；乙烯诱导的、与植株抗性相 关基因的表达调控；植物顶端分生及分枝性状的调控等。目前有关AP2的生物学功能几乎都只涉及植物(或作物)对逆境的响应及有关调 控路线，尚无关于AP2涉及产量性状形成及其改良的报道。
发明内容
本发明的在于提出水稻OsEATB基因在改良水稻产量性状方面的应用。本发明利用水稻AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化水稻两个亚种粳 稻和籼稻，用以改良水稻的产量性状；实施例中，本发明将水稻OsEATB基因转化处理籼稻 9311，使籼稻9311产量性状发生明显改善。本发明还利用水稻AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化包括玉米，小麦， 高粱和其它谷类作物，用于产量性状的改良。本发明还利用AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化双子叶作物，用于产量 性状的改良，包括增加分枝数，籽粒和果实数，籽粒和果实体积与重量。本发明还包括水稻AP2转录因子家族成员OsEATB(Oryza sativa ERF protein Associated with Tillering and Branch)的分离、克隆与转基因功能研究等。1) OsEATB基因与蛋白结构组成水稻AP2转录因子家族成员OsEATB属于AP2转录因子家族中的ERF亚家族，基因 结构无内含子(intron)，含有一个AP2结构域。目前我们在国际生物信息网站登录的水稻 AP2转录因子家族成员OsEATB编号为EU622934，DNA序列长825bp，见SEQ. ID N01.。该基 因的结构与其编码的蛋白质组成如下水稻OsEATB基因结构见图1所示。蛋白结构见图2所示，含有一个AP2结构域。2) OsEATB基因表达载体的构建
^tM pCAMBIA1304(Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia)M # M 9311 白勺 OsEATB基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得含OsEATB基因的表达载 体。其结构图如图3所示。3) OsEATB基因转化实验采用目前国内超级杂交稻的主要亲本之一籼稻9311为转基因受体，构建OsEATB 基因的过表达转基因植株。将籼稻9311成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育 基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含OsEATB基因 的经纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入籼稻9311愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的 MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导 长芽和生根。4)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测将OsEATB基因转化处理的9311试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采 用PCR扩放技术进行分子检测，于2008年夏获得阳性TO代植株。2008年冬，在海南岛加代 繁殖，获得转基因Tl代，共计8个株系。5) OsEATB转籼稻9311植株转基因的实时定量PCR(RealTime PCR)检测目的基因OsEATB在籼稻9311转基因植株中的表达量上调为野生型植株的十倍。 见图4所示。6) OsEATB转基因T2代群体产量性状的调查与统计将OsEATB基因转基因T2代于2009年春播种，四叶期将转化的2个OsEATB转基 因T2代株系种植在复旦大学试验田。2个株系每个株系各种植27株，行株距为6寸x6寸， 重复三次，同时设立籼稻9311亲本对照。在成熟期统计各株系27个单株的有效穗数，主穗 长，主穗一次枝梗及二次枝梗数，主穗总粒数和千粒重，计算平均值，统计结果如下 水稻OsEATB转基因有效分蘖数、有效穗数、穗枝梗数和穗粒数变化见图5_图8所示。 根据上述田间调查及考种数据，与对照相比，OsEATB转基因籼稻9311的产量性状 优于对照
有效穗增加16. 95% ；平均主穗穗粒数增加29. 34%。水稻OsEATB转基因植株与野生型籼稻9311穗形模式比较见图9和图10。水稻OsEATB转基因增加产量的主要原因是增加分蘖力、有效穗数、穗枝梗数和穗 粒数。7) OsEATB转基因植株生育期提前对上述T2代转基因植株进行叶龄和抽穗时间的跟踪记录，结果表明=OsEATB转基 因植株的抽穗时间比野生型植株提前约20天。OsEATB转基因植株与野生型籼稻9311植株 同为2009-05-25播种，转基因植株2009-08-20十张旗叶时抽穗，野生型植株2009-09-10 十三张旗叶时抽穗。8) OsEATB转基因植株具有抗倒伏株形OsEATB转基因植株株型与野生型籼稻9311植株相比，穗长未缩短、第1节间缩短 2.6%、第二节间缩短18.5%、第三节间缩短26.9%、第四节间缩短56.3%，根节未缩短，符 合抗倒伏株形的特点。
图1为水稻OsEATB基因结构。图2为水稻OsEATB基因蛋白结构。图3为水稻OsEATB基因的表达载体结构图。图4为OsEATB基因在籼稻9311转基因植株中表达量与野生型植株的比照。图5为水稻OsEATB转基因有效分蘖数变化。图6为水稻OsEATB转基因穗长变化。
图7为水稻OsEATB转基因穗枝梗数变化。图8为水稻OsEATB转基因穗谷粒数变化图9为野生型籼稻9311穗形模式。图10为水稻OsEATB转基因植株穗形模式。图11为OsEATB转基因种子形态特征。种子形态更细长，符合优良籼稻品种的特 征。图12为水稻OsEATB转基因种子发芽势(1)，快于对照9311。图13为为水稻OsEATB转基因种子发芽势(2)，快于对照9311。图14为OsEATB转基因成熟单株。左图9311对照，右图=OsEATB转基因9311单株。图15为OsEATB转基因植株性状。其中，有效穗增加16. 95% ；平均每穗穗粒数增 加29. 34% ；每株总粒数增加51. 26% ；千粒重减少18. 03%。图16为OsEATB转基因植株形态变化。其中，植株矮化，穗长及第1节间长度无明 显变化，第4节间明显缩短，符合抗倒伏株形的特点。左侧，9311对照；右侧，OsEATB转基因 植株。图17为OsEATB转基因植株穗形。其中，穗一次枝梗数和二次枝梗数明显增多，穗 总粒数增多。左侧，9311对照；右侧，OsEATB转基因植株。
具体实施例方式1、选择OsEATB全长ORF区段(其全长cDNA序列见SEQ ID NO. 1，编码序列见 SEQ IDN0. 2)，采用PCR方法从籼稻9311中将其扩增，并合成插入接头克隆到植物表达载体 PCAMBIA1304,获得 OsEATB 表达载体 pCAMBIA1304/lrkl。2、诱导水稻愈伤组织培养基(1)诱导及继代培养基MS+2mg/L 2，4_D。(2)高渗培养基MS+2mg/L 2，4-D+46. 67g/L 山梨醇 +46. 67g/L 甘露醇。(3)第一轮筛选培养基MS+2mg/L 2，4_D+30mg/L 潮霉素。(4)第二轮筛选培养基MS+2mg/L 2，4_D+50mg/L 潮霉素。(5)分化培养基:MS+3mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+50mg/L 潮霉素。(6)生根壮苗培养基l/2MS+0. lmg/L NAA。(注1.以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar, pH 5. 8。2.愈伤诱导、继代、 筛选培养条件为26-28°C暗培养，分化、生根壮苗为26-28°C及16小时光周期)3、愈伤组织诱导与处理(1)取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70%乙醇浸洗lOmin，转 入0. 升汞浸泡20min，无菌水清洗3次。(2)在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26_28°C暗培养约20天后 切芽，继代一次。(3)在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤30-50块(每块3mm左右)，置 于高渗培养基上中央，排成直径约2. 5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化。4、基因枪转化(1)基因枪从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪，型号GJ-1000。(2)微粒子弹制备(3)称取60mg钨粉(直径约Ium)，加入到1. 5ml灭菌离心管中，再加入Iml无水 乙醇，振荡lmin，于IOOOOrpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于Iml无菌水中 现用或_20°C保存。(4)吸取50ul钨粉悬浮液于1. 5ml离心管，依次加入5ug DNA、50ul 2. 5M CaCl2, 20ul 0. IM亚精胺，振荡5分钟，IOOOOrpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加 入60ul无水乙醇，悬浮待用。5、轰击受体材料(1)将基因枪放于超净工作台上，用70%酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、 金属挡网(均由宁波新芝科技有限公司供货)于70%酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸 吸干或吹净残余酒精.(2)打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀。(3)将可裂膜装入固定、旋紧。(4)取IOul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均勻涂布于载粒膜中心，放在超净台 上吹干。(5)将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下。(6)将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央。
(7)打开气瓶，调节压力llOOPsi。(8)抽真空，当真空度达到需要值时，将VAC键转到Hold位置。(9)轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)， 按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12_16h。6、转化愈伤组织筛选(1)将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天。(2)将愈伤转到含30mg/L潮霉素的筛选培养基上，均勻摆放，暗培养14-17天进行 第一次抗性筛选。(3)将抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，暗培养8-12天进行第二次 抗性筛选。7、转化植株筛选与检测(1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天。(2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。(3)分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交法检测侯选的转化植株，共获得8 株含有转化的OsEATB片段的阳性植株。
权利要求
水稻OsEATB基因及其同源基因在改良水稻产量性状方面的应用，其特征在于利用水稻AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化水稻两个亚种粳稻和籼稻，以改良水稻的产量性状。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用籼稻9311为转基因受体，构建OsEATB 基因的过表达转基因植株。
3.一种OsEATB基因表达载体，其特征在于采用pCAMBIA1304为表达载体，将籼稻9311 的OsEATB基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得。
全文摘要
本发明属于转基因技术领域，具体为水稻OsEATB基因在改良水稻产量性状方面的应用。本发明利用水稻AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化水稻两个亚种粳稻和籼稻，用以改良水稻的产量性状；此外，还利用水稻AP2转录因子OsEATB基因及其同源基因转化包括玉米，小麦，高粱和其它谷类作物，用于改良谷类作物产量性状的改良。进一步还利用OsEATB基因及其同源基因转化双子叶作物，用于改良双子叶作物产量性状的，包括增加分枝数，籽粒和果实数，籽粒和果实体积与重量。
文档编号C12N15/29GK101886083SQ201010208969
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者孙凡, 杨金水, 祁巍巍 申请人:复旦大学