专利名称：功能性双歧杆菌高密度培养及其冻干产品的制备方法
技术领域：
本发明涉及双歧杆菌培养及其冻干产品的制备方法。
背景技术：
双歧杆菌是肠内最有益的菌群，在人体肠内发酵后可产生乳酸和醋酸，能提高钙、 磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收；双歧杆菌发酵乳糖产生半乳糖，是构成脑神经 系统中脑苷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系；双歧杆菌可以产生维生素 B1、B2、B6、B12及丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等人体必需的营养物质，对于人体具有 不容忽视的重要营养作用；并且还具有抗衰老、抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能及改善营养 的作用等。目前，双歧杆菌生产，多是采用离心浓缩的方式，存在处理量较小、离心机取料程 序繁杂、菌体死亡率较高及收获率较低的缺点，致使产品中活菌含量小、用量大、发酵效果 差；且其产品主要为冻干制剂，制造和使用成本均较高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有双歧杆菌生产存在产品中活菌含量小、用量大、发 酵效果差，而且其冻干制剂的制造和使用成本均较高的问题，而提供功能性双歧杆菌高密 度培养及其冻干产品的制备方法。功能性双歧杆菌高密度培养按以下步骤进行一、将经过耐氧驯化的功能性双歧 杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35 37°C、pH值为6. 5 6. 8的条件下培养 15 17h，得发酵液；二、发酵液在0 20°C时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10%的 柠檬酸钠溶液或质量浓度为10 %的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度 为0. 2 2%的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为100 200nm、面积 为0. 5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为IlOKPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达 到6，得到含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性双歧杆菌高密度培养；其中步 骤一中接种量为2%;步骤一中增菌培养基由80 120g的脱脂乳粉，40 60g的胰蛋白酶 水解乳清粉，30 60g的番茄汁、30 60g的麦芽汁、10 30g乳糖、0. 50 0. 70g的酵母 膏或酵母粉、6. 8 7. 2mg的腺嘌呤和50 54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容 至IOOOmL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行一、按重量比1 1 2将 含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0 10°C的条件下进行10 12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于_70°C冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直 至混合物的温度达到_45°C，保持30min，然后以5°C /30min的速率升温至_28°C，并维持 此温度至真空度达到0. 05MPa完成主干燥阶段，再升温至10°C并维持此温度至真空度达到 0. 03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20°C的 环境中贮藏，即完成功能性双歧杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂10 20g的脱脂乳粉、1 3g的甘油、1 2g的维生素C、0. 5 Ig的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和 3 15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成；步骤二中混合物置于_70°C冷冻机的 冷冻盘中的大小为长40cmX宽50cmX高20mm。本发明中功能性双歧杆菌高密度培养，所得含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物中 双歧杆菌的活菌数为5. 4X1010CFU/g,比现有的活菌数提高10倍以上，乳杆菌用量减少，仅 取0. 005% 0. 010%与酸奶发酵剂配合使用即可满足益生菌发酵乳生产的要求，可以作 为优质的益生菌直投式发酵剂，且发酵效果好，同时增菌培养基中所用的腺嘌呤，为后续冻 干产品的制备过程中增加了功能性双歧杆菌的存活率。本发明中功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法，将功能性双歧杆菌高密度培养所 得的膜浓缩产物进行加工，这样减小冷冻处理的负荷，同时，优化后的冷冻保护剂，也可以 提高功能性双歧杆菌的存活率，与冻干制品相比具有生产成本低而活性高的优点，达到直 接使用目的，而且工艺简单；此外，本发明中功能性益生性乳杆冻干产品还可以作为辅料添 加到奶粉中，在12个月的保质期内益生菌奶粉的双歧杆菌的活菌数均大于1. OX 106CFU/g。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式功能性双歧杆菌高密度培养按以下步骤进行一、 将经过耐氧驯化的功能性双歧杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35 37°C、pH 值为6. 5 6. 8的条件下培养15 17h，得发酵液；二、发酵液在0 20°C时，加入与发酵 液等重量的质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10%的磷酸钠溶液对发酵液进 行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为0. 2 2%的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵 液使用孔径为100 200nm、面积为0. 5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为IlOKPa进行膜浓缩处理 至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物，即完成功能 性双歧杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2%;步骤一中增菌培养基由80 120g的 脱脂乳粉，40 60g的胰蛋白酶水解乳清粉，30 60g的番茄汁、30 60g的麦芽汁、10 30g乳糖、0. 50 0. 70g的酵母膏或酵母粉、6. 8 7. 2mg的腺嘌呤和50 54mg的L-半胱 氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜 管串联。本实施方式步骤一中耐氧驯化的功能性双歧杆菌，是从自然发酵食品或人类肠道 中分离出功能性双歧杆菌，然后对其进行紫外线诱变，诱变条件为15_25W紫外线灯，菌株 悬浮液距紫外光源30cm，照射2mic。本实施方式步骤三中所用陶瓷膜可以再生，再生工艺为50°C的热水清洗5min， 质量浓度为0. 5%的氢氧化钠溶液清洗10min，50°C的热水清洗5min，质量浓度为0. 5%的 硝酸清洗10min，5(TC的热水清洗5min，即完成陶瓷膜再生。本实施方式采用流加法补充增菌培养基。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中采用中和剂调 节增菌培养基的PH值，中和剂为质量浓度为10 15%的氢氧化钠、质量浓度为10 15% 的氨水或质量浓度为20%的Na2CO3 ；步骤一中培养15 17h的过程中需补加乳糖，乳糖补加量为所消耗的中和剂中碱性物质摩尔量的3 5倍，同时采用D301型树脂吸附培养过程 中产生的钠盐。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中在温度为 35°C、pH值为6. 5的条件下培养17h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相 同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中在温度为 37°C、pH值为6. 8的条件下培养15h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相 同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中在温度为 36°C、pH值为6. 6的条件下培养16h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相 同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中增菌 培养基由80g的脱脂乳粉，40g的胰蛋白酶水解乳清粉，30g的番茄汁、30g的麦芽汁、IOg乳 糖、0. 50g的酵母膏或酵母粉、6. Smg的腺嘌呤和50mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并 定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中增菌 培养基由120g的脱脂乳粉，60g的胰蛋白酶水解乳清粉，60g的番茄汁、60g的麦芽汁、30g 乳糖、0. 70g的酵母膏或酵母粉、7. 2mg的腺嘌呤和54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水 并定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中增菌 培养基由90 IlOg的脱脂乳粉，45 55g的胰蛋白酶水解乳清粉，40 50g的番茄汁、 40 50g的麦芽汁、15 25g乳糖、0. 55 0. 65g的酵母膏或酵母粉、6. 9 7. Img的腺嘌 呤和51 53mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数 与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中增菌 培养基由IOOg的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g 乳糖、0. 60g的酵母膏或酵母粉、7mg的腺嘌呤和52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并 定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中加入 质量浓度为0. 2%的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式
一至九之一 相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中加 入质量浓度为的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式
一至九之一 相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中加 入质量浓度为0. 5 1. 5%的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式
一 至九之一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中加 入质量浓度为2%的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式
一至九之一
6相同。
具体实施方式
十四本实施方式功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤 进行一、按重量比1 1 2将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合， 在温度0 10°C的条件下进行10 12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置 于-70°C冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物的温度达到_45°C，保持30min，然后以 5°C /30min的速率升温至-28°C，并维持此温度至真空度达到0. 05MPa完成主干燥阶段，再 升温至10°C并维持此温度至真空度达到0. 03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉 碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20°C的环境中贮藏，即完成功能性双歧杆菌冻干产品的 制备；其中步骤一中冷冻保护剂10 20g的脱脂乳粉、1 3g的甘油、1 2g的维生素C、 0. 5 Ig的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和3 15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL 组成；步骤二中混合物置于_70°C冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cmX宽50cmX高20mm。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
十四不同的是步骤一中按重量比 1 1将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0°c的条件下进行 12h的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式
十四相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
十四不同的是步骤一中按重量比 1 2将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度10°C的条件下进行 IOh的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式
十四相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
十四不同的是步骤一中按重量比 1 1.5将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度5°C的条件下进行 Ilh的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式
十四相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
十四至十七之一不同的是步骤一 中冷冻保护剂IOg的脱脂乳粉、Ig的甘油、Ig的维生素C、0. 5g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗 糖和3g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
十四 至十七之一相同。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
十四至十七之一不同的是步骤一 中冷冻保护剂20g的脱脂乳粉、3g的甘油、2g的维生素C、lg的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖 和15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
十四 至十七之一相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
十四至十七之一不同的是步骤一 中冷冻保护剂12 18g的脱脂乳粉、1. 5 2. 5g的甘油、1. 2 1. 8g的维生素C、0. 6 0. 9g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和5 IOg的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。 其它步骤及参数与具体实施方式
十四至十七之一相同。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
十四至十七之一不同的是步骤 一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g的甘油、1. 5g的维生素C、0. 8g的谷氨酸或甘氨酸、5g 的蔗糖和8g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。其它步骤及参数与具体实施方式
十四至十七之一相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式功能性双歧杆菌高密度培养按以下步骤进行 一、将经过耐氧驯化的功能性双歧杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为36°C、pH 值为6. 6的条件下培养16h，得发酵液；二、发酵液在10°C时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10%的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱， 再加入质量浓度为的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为150nm、 面积为0. 5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为IlOKPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液浓缩倍数 达到6，得到含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性双歧杆菌高密度培养；其中 步骤一中接种量为2% ；步骤一中增菌培养基由IOOg的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳 清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g乳糖、0. 60g的酵母膏或酵母粉、6. Smg的腺嘌呤和 52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式 为两个陶瓷膜管串联。功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行一、按重量比1 1. 5将含 有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度6°C的条件下进行12h的冷冻 前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于-70°C冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物 的温度达到_45°C，保持30min，然后以5°C /30mi η的速率升温至_28°C，并维持此温度至 真空度达到0. 05MPa完成主干燥阶段，再升温至10°C并维持此温度至真空度达到0. 03MPa 完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20°C的环境中贮 藏，即完成功能性双歧杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g 的甘油、1. 5g的维生素C、0. 8g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和IOg的海藻糖加入蒸馏水并 定容至IOOOmL组成；步骤二中混合物置于_70°C冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cmX宽 50cmX 高 20mm。本实施方式中所得冻干产品，经测试其中活菌数为5. 4X1010CFU/g,与酸奶发酵剂 配合使用以0. 005% -0. 010%的量接种到灭菌脱脂乳和鲜牛奶中，在41 43°C的条件下发 酵3. 5h，乳凝固并产酸70° T，组织状态、风味良好，在21天酸奶的保质期内益生菌的活菌 数均大于1.0X106CFU/g，可以作为优质的益生菌直投式发酵剂；此外，还可以作为辅料添 加到奶粉中，在12个月的保质期内益生菌奶粉的双歧杆菌的活菌数均大于1. OX 106CFU/g。
权利要求
功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于功能性双歧杆菌高密度培养按以下步骤进行一、将经过耐氧驯化的功能性双歧杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35～37℃、pH值为6.5～6.8的条件下培养15～17h，得发酵液；二、发酵液在0～20℃时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10％的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为0.2～2％的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为100～200nm、面积为0.5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为110KPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性双歧杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2％；步骤一中增菌培养基由80～120g的脱脂乳粉，40～60g的胰蛋白酶水解乳清粉，30～60g的番茄汁、30～60g的麦芽汁、10～30g乳糖、0.50～0.70g的酵母膏或酵母粉、6.8～7.2mg的腺嘌呤和50～54mg的L 半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。
2.根据权利要求1所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中采用中和 剂调节增菌培养基的pH值，中和剂为质量浓度为10 15%的氢氧化钠、质量浓度为10 15%的氨水或质量浓度为20%的Na2CO3 ；步骤一中培养15 17h的过程中需补加乳糖，乳 糖补加量为所消耗的中和剂中碱性物质摩尔量的3 5倍，同时采用D301型树脂吸附培养 过程中产生的钠盐。
3.根据权利要求1或2所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中在温 度为36°C、pH值为6. 6的条件下培养16h，得发酵液。
4.根据权利要求3所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中增菌培养 基由90 IlOg的脱脂乳粉，45 55g的胰蛋白酶水解乳清粉，40 50g的番茄汁、40 50g的麦芽汁、15 25g乳糖、0. 55 0. 65g的酵母膏或酵母粉、6. 9 7. Img的腺嘌呤和 51 53mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。
5.根据权利要求3所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中增菌培养 基由IOOg的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g乳糖、 0. 60g的酵母膏或酵母粉、7mg的腺嘌呤和52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至 IOOOmL 组成。
6.根据权利要求4或5所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤二中加入 质量浓度为0. 5 1. 5%的壳聚糖进行菌体的絮凝。
7.根据权利要求4或5所述的功能性双歧杆菌高密度培养，其特征在于步骤二中加入 质量浓度为2%的壳聚糖进行菌体的絮凝。
8.制备如权利要求1所述的功能性双歧杆菌高密度培养的所得功能性双歧杆菌冻干 产品的方法，其特征在于功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行一、按重量 比1 1 2将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0 10°C的 条件下进行10 12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于_70°C冷冻机的冷冻 盘中进行预冻，直至混合物的温度达到_45°C，保持30min，然后以5°C /30min的速率升温 至-28°C，并维持此温度至真空度达到0. 05MPa完成主干燥阶段，再升温至10°C并维持此温 度至真空度达到0. 03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包 装并置于_20°C的环境中贮藏，即完成功能性双歧杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂10 20g的脱脂乳粉、1 3g的甘油、1 2g的维生素C、0. 5 Ig的谷氨酸或 甘氨酸、5g的蔗糖和3 15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成；步骤二中混合物 置于_70°C冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cmX宽50cmX高20mm。
9.根据权利要求8所述的功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法，其特征在于步骤一中 按重量比1 1.5将含有功能性双歧杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度5°C的条 件下进行Ilh的冷冻前预冷处理，得混合物。
10.根据权利要求8或9所述的功能性双歧杆菌冻干产品的制备方法，其特征在于步骤 一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g的甘油、1. 5g的维生素C、0. 8g的谷氨酸或甘氨酸、5g 的蔗糖和8g的海藻糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL组成。
全文摘要
功能性双歧杆菌高密度培养及其冻干产品的制备方法，它涉及双歧杆菌培养及其冻干产品的制备方法。它解决了现有双歧杆菌生产存在产品中活菌含量小、用量大、发酵效果差，而且其冻干制剂的制造和使用成本均较高的问题。培养一、耐氧驯化的功能性双歧杆菌接种到增菌培养基中，得发酵液；二、洗脱和絮凝；三、膜浓缩处理后即完成。制备一、膜浓缩产物与冷冻保护剂混合预冷，得混合物；二、将混合物预冻后，经主干燥和解析干燥，再进行粉碎、包装并贮藏即完成。本发明中双歧杆菌的活菌数为5.4×1010CFU/g，用量减少，且发酵效果好，冻干产品的生产成本低、工艺简单且活性高，可达到直接使用目的。
文档编号C12R1/01GK101948775SQ20101026635
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者冯镇, 吴海波, 张兰威, 易华西, 李婧妍, 杜明, 韩雪, 马春丽 申请人:哈尔滨工业大学;张兰威