专利名称：一种用外源质粒消除革兰氏阴性菌代谢质粒的方法
技术领域：
本发明属于微生物遗传学相关领域，更具体是涉及一种用外源质粒消除革兰氏阴 性菌代谢质粒的方法，它适用于革兰氏阴性菌代谢质粒的消除。
背景技术：
质粒是染色体外具有独立复制能力的对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双 链DNA分子。自然存在的质粒大小从Ikb到IOOOkb不等，在单个细胞中的拷贝数从一个到 几百个不等。质粒拷贝数在恒定的条件下是质粒的固有属性，是由质粒编码的决定起始复 制频率的蛋白质控制的。根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，可将其分为各种 不同的类型
1.致育因子(Fertility factor, F 因子)
又称F质粒，其大小约lOOkb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合 作用)有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株(相当于雄性)，无F质粒的菌株称为F — 菌株(相当于雌性)。F质粒在大肠杆菌的接合作用中起主要作用。2.抗性因子(Resistance factor, R 因子)
这是另一类普遍而重要的质粒，主要包括抗药性和抗金属两大类，简称R质粒。3. Col 质粒
因这类质粒首先发现与大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌 素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影 响。4. _个生Mf立(Virulence plasmid)
越来越多的证据表明，许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具 有编码毒素的基因，例如产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中 许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。5.代谢质粒(Metabolic plasmid)
这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因，含有这类质粒的细菌，特别是假单胞 菌，能将复杂的化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。尤其是对一些有毒 化合物，如芳香族化合物，农药的降解，在环境保护方面具有重要的意义。6.隐秘质粒(Cryptic plasmid)
以上所讨论的质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，但隐秘质粒不显示任何表型 效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。研究带有质粒的菌株时，人们总是希望得到相应的质粒消除菌。质粒消除常指细 菌携带的质粒从宿主中消除，其所编码的性状同时消失的现象。完全消除质粒的细菌与质 粒存在的原始菌株比较，可以观察研究质粒的遗传学功能，完全消除质粒的细菌还可以作 为基因工程菌，广泛用于分子生物学研究。有的质粒可以自发的以很高的频率消除，但绝大部分质粒都是非常稳定的，需要采用某些质粒消除剂或改变培养条件来提高质粒消除率。消除质粒的方法有化学处理法、物理处理法和高温处理法。经处理后质粒复制或 分配受到抑制使子代细菌中的质粒消除。常用的化学消除剂如丫啶橙、溴化乙啶、十二烷 基硫酸钠SDS等，高温处理法常用37°C、43°C两种温度进行交替传代。在实际应用中，往 往根据前人的经验选择消除方法。菌体的特征、所含质粒分子量大小、消除剂浓度、作用 时间和温度都与消除率有关。嵌合染料(如丫啶橙、溴化乙啶等)适用于消除大肠杆菌中 的质粒，十二烷基硫酸钠对具有纤毛的细菌作用效果较好，胸腺嘧啶限量法仅适用于其营 养缺陷型菌株的质粒消除。采用丝裂霉素(mitorcin，mitomycin C, MMC)消除假单胞菌 iPseudomonas)及相近属菌株的质粒是一个比较有效的方法。丝裂霉素的化学结构中有乙 撑亚胺及氨甲酰酯基团，具有烷化作用，能与DNA双链交叉联结，抑制DNA复制，也能使部 分 DNA 断裂。Prakash 等通过 mitomycin CPseudomonas cepacia strain RKJ200 一 个50kb质粒，效率为3%，然后通过生长实验和色谱分析，证明质粒消除菌的细胞破碎液对 对硝基酚降解生化途径中的中间产物都没有活性，细胞也不能以此几个中间产物为底物生 长。通过将质粒结合转移到假单胞菌PaW340 (.P. putida PaW340)后受体菌获得了同供体 菌一样的降解特性。从而证明整个对硝基酚的降解途径编码在质粒上。在许多能够降解异 源物质微生物中，编码代谢途径的基因簇定位在质粒上，通过质粒消除实验定位代谢基因， 有利于研究降解基因的整个操纵子的组成，功能，进化和代谢途径的调控。质粒的不相容性是指在无选择压力的条件下，亲缘关系密切的不同质粒或同一不 相容群的质粒不能稳定共存于同一宿主细胞，在细胞增殖过程中将有一种被排斥的现象。 质粒不相容性最初是在20世纪60年代研究F质粒时被描述到的，在70年代由Datta和 Hedges正式提出质粒的不相容性的定义。质粒的不相容性有可能是相称的(symmetric)， 指的是两个质粒都相等的丢失概率，也可能是矢量的(vectorial)，是指一个质粒有更高的 或者必然的丢失频率。目前，主要有30组大肠杆菌中的不相容组和7组葡萄球菌中的不相 容组被分类。名为《DNA Insertion elements, Plasmid, and Episomes》的书中详细列 出了质粒根据不相容组的分类表。目前已有多个代谢质粒的全基因组序列测定完成(如表 1-1)，发现代谢质粒多属于IncP不相容组。这些代谢质粒的大小在50-500kb左右，而且多 为低拷贝。代谢质粒往往是广宿主的，即能够在多种微生物中存在。这也是它在污染物的 生物降解中越来越受到重视的原因。表1-1降解质粒IncP不相容组中的完全测序的质粒
Tablel-I Characteristics of IncP catabolic plasmids with complete sequence determinedo
权利要求
一种用外源质粒消除革兰氏阴性菌代谢质粒的方法，其步骤是A 制备电转法感受态细胞 (1)从LB平板中挑取含代谢质粒的革兰氏阴性菌，例如潘多拉菌MCB032菌株(Pandoraea sp. MCB032)单菌落，接种到含有5 ml LB中30℃振荡培养15 17 h； (2)次日，以1% vol/vol 的接种量转接到50 ml LB中，于28 32℃剧烈振荡培养2 3 h至600nm波长处的吸光值OD600达0.4 0.6； (3)在无菌条件下，将细菌转移到无菌、用冰预冷的离心管中，在冰上放置10 min；(4)于4℃以3500×g离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置以使最后的痕量培养液流尽；(5)用10 ml预冷的Milli Q水重悬每份细胞沉淀，冰浴30 min；(6)于4℃以3500×g离心10 min，以回收细胞，倒出液体，将管倒置以使最后的痕量培养液流尽；(7)用10ml 10%vol/vol甘油/水重悬每份细胞沉淀，放置于冰浴上30 min；(8)于4℃以3500×g离心10 min，以回收细胞，倒出液体，将管倒置以使最后的痕量培养液流尽；(9)重复步骤7、步骤8各一次；(10)用2 ml冰预冷的10%vol/vol甘油/水重悬每份细胞沉淀，用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，将细胞冻存于10％ vol/vol甘油/水中 80℃备用；B、 转化(a)，分别将2μl 外源质粒pRK415 或pVLT31 ，DNA浓度10ng 50 ng /μl加入50μl感受态细胞，混匀后转移到电转杯中，电转仪的参数设置为2.5 KV，电脉冲一次；(b)每管加1 ml LB培养基，然后将管转移到摇床上，温育1h；(c)将体积50 200l已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂培养基上；(d)将平板置于室温直至液体被吸收；(e)倒置平板，于30℃培养，2天后出现菌落，挑选单菌落，提取质粒，凝胶电泳检测质粒； 所述的革兰氏阴性菌包括假单胞菌属、伯克霍尔德菌属或潘多拉菌属；所述的外源质粒包括属IncP 1不相容组的革兰氏阴性菌广泛宿主质粒或属IncP 4不相容组的革兰氏阴性菌广泛宿主质粒。
全文摘要
本发明公开了一种用外源质粒消除革兰氏阴性菌代谢质粒的方法，步骤是A、制备电转法感受态细胞(1)挑取单菌落，接种到LB中振荡培养；(2)接种量转接到LB中培养；(3)在无菌条件下，将细菌转移到无菌、放置；(4)离心，回收细胞；(5)用预冷的水重悬细胞沉淀，冰浴；(6)离心，回收细胞；(7)用甘油重悬细胞沉淀，放置冰浴上；(8)离心，回收细胞；(9)将细胞冻存于甘油中备用；B、转化(a)，将外源质粒加入感受态细胞，转移到电转杯中；(b)将管转移到摇床上，温育；(c)将感受态细胞转移含抗生素的LB琼脂培养基上；(d)将平板置于室温；(e)倒置平板，提取质粒，凝胶电泳检测质粒。方法简单，快速，效率高，准确性高。
文档编号C12N15/63GK101974551SQ20101050244
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者刘虹, 周宁一, 孟芳会, 王淑君 申请人:中国科学院武汉病毒研究所