专利名称：一种假单胞菌脂肪酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码假单胞菌I^seudomonas sp脂肪酶WJLIPASE1的基因。本发 明还涉及所述基因在脂肪酸代谢和生产生物柴油方面的应用。
背景技术：
生物(酶)法生产生物柴油是以油脂为原料，在常温常压下利用脂酶(脂肪酶) 作为催化剂合成而得，具有条件温和、甲醇用量少和能耗低、环保性能好等优点。
由于生物(酶)法生产生物柴油必须添加甲醇或乙醇，另外，在生物(酶)法合成 柴油的同时，会得到附产品甘油，而酶在甲醇或乙醇等中容易失活，并且甘油也会在一定程 度上影响酶活性。因此目前的脂肪酶活性较低。
所以需要开发能够提高酶活性的脂肪酶。
在对现有技术文献的分析中，至今尚未发现假单胞菌I^seudomonas sp脂肪酶在生 产生物柴油有关的任何报道。发明内容
本发明的目的是从假单胞菌I^seudomonas sp中克隆出一种脂肪酶蛋白基因。该 基因的核苷酸序列编码的脂肪酶蛋白可用于生产生物柴油.
本发明从假单胞菌I^seudomonas sp获得了如SEQ ID NO 1所示序列的DNA分 子，并经实验证实由SEQ ID NO :1编码的蛋白具有脂肪酶的功能。所述脂肪酶蛋白命名为 WJLIPASE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
从公共数据库GenBank和Swissprot中已释放的脂肪酶基因序列，用ClustalW进 行多序列比对，利用生物信息软件分析脂肪酶的转脂位点保守区和蛋白的稳定化和折叠的 结构功能区域，选择假单胞菌I3Seudomonas sp提取RNA，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒) 进行cDNA全长克隆，获得脂肪酶蛋白基因，将脂肪酶基因转化大肠杆菌(pET22 a/b系列表 达载体)，获得高效产生脂肪酶的大肠杆菌菌株。使得其重组蛋白含量达到30%以上，发酵 液酶活达可达8620U/ml以上，纯化后制得酶活可高达^K)00U/g的粉状脂肪酶。利用该酶 生产生物柴油应用试验，使可使生物柴油含量>98.5%，总回收率> 92.6%。
在本发明的一个方面，提供了 一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有 WJLIPASE1蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 1中从 核苷酸第133-1980位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中 度严紧条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第133-1980位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述 的序列编码具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1中从核苷酸第133-1980位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离出的W几IPASEl相关蛋白质多肽，它包括 具有SEQ ID NO. 1氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生 物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO. 1序列的多肽。
在本发明还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞，它是原核或真核细胞。在实 例中该宿主细胞是大肠杆菌。
在本发明中，DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出 来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随 其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“WJLIPASE1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有WJLIPASE1蛋 白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列及其简并序列。 该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的编码框第133-1980位核苷酸中，有一个或多个 密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所 以与SEQ ID NO. 3中第133-1980位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出 SEQ IDN0.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与 SEQ ID NO. 3中从核苷酸第133-1980位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括 与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第133-1980位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少 80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的假单胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相同功能的 蛋白的SEQ ID N0. 3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若 干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内， 更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“假单胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1蛋白或多肽”指具有 WJLIPASE1蛋白活性的SEQ ID N0. 3序列的多肽。该术语还包括具有与天然假单胞菌 Pseudomonas sp脂肪酶相关相同功能的、SEQ ID N0. 4序列的变异形式。这些变异形式包括 (但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个) 氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个 以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括假单胞菌I^seudomonas sp脂肪酶相关蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的假单胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1多肽的变异形式包括同源序 列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与假单 胞杆菌脂肪酶相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗假单胞菌I^seudomonas sp W几IPASEl多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“假单胞菌I^seudomonas sp WJLIPASE1保守性变异多肽”指与SEQ ID N0. 3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质 相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产 生。
表1氨基酸替换表
权利要求
1.一种假单胞菌I^seudomonas sp脂肪酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种脂肪酶基因，其碱基序列中含有SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸。
3.一种脂肪酶基因，其碱基序列与SEQ ID NO. 1所示序列中第133-1980位的核苷酸至 少有70%的同源性；或者能在中度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中第133-1980位的核苷酸 序列杂交。
4.一种脂肪酶蛋白，其特征是含有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多肽、或其保守性变 异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.权利要求1所述的脂肪酶基因转化的宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞。
6.权利要求1 3中任一所述基因在脂肪酸代谢中的应用。
7.权利要求1 3中任一所述基因在生产生物柴油中的应用。
全文摘要
本发明从假单胞菌Pseudomonas sp中获得了如SEQ ID NO1所示序列的基因，并经实验证实该基因编码的蛋白具有脂肪酶的功能，可用于生产生物柴油。
文档编号C12N15/63GK102031264SQ20101054860
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者王劲 申请人:西南科技大学